CN114128729B

CN114128729B - 楝叶吴萸挥发油在防治辣椒疫病中的应用

Info

Publication number: CN114128729B
Application number: CN202111358681.5A
Authority: CN
Inventors: 王奇志; 王碧; 杨璟璟; 李丕睿; 印敏; 徐曙; 刘飞; 雍旭红; 靳桐; 赵兴增; 张建华
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2021-11-17
Filing date: 2021-11-17
Publication date: 2022-10-04
Anticipated expiration: 2041-11-17
Also published as: CN114128729A

Abstract

本发明属于植物源农药技术领域。本发明首次以楝叶吴萸挥发油为有效成分用于防治由辣椒疫霉引起的辣椒疫病，初步研究了楝叶吴萸挥发油对辣椒疫病的控制效果。试验结果表明，楝叶吴萸挥发油对辣椒疫霉菌丝生长、孢子产生和萌发具有较好的抑制效果，同时，在活体条件下，对辣椒疫霉在辣椒叶片和植株上引起的辣椒疫病有较好的防治效果。另外，本发明还明确了楝叶吴萸挥发油的主要成分和对辣椒疫霉的主要抑菌活性成分。本发明的优点在于利用楝叶吴萸挥发油防治辣椒疫病不污染环境，不易产生抗药性，减少了化学农药使用量，低残留，对作物相对安全，对非靶标作物影响小。

Description

楝叶吴萸挥发油在防治辣椒疫病中的应用

技术领域

本发明属于植物源农药技术领域，具体涉及楝叶吴萸挥发油在防治辣椒疫病中的用途。

背景技术

辣椒疫病是由辣椒疫霉（Phytophthora capsici L.）引起的，世界范围内的一种毁灭性病害，常造成辣椒的大幅减产、甚至绝收。辣椒疫病在辣椒的苗期到成株期都可发生，且根、茎、叶、果实均可发病，发病周期短、蔓延快，是造成辣椒严重减产的重要土传病害。目前，生产上可供选择的辣椒疫霉防治药剂较少，主要包括甲霜灵、嘧菌酯等广谱性杀菌剂和烯酰吗啉等专一性杀菌剂。但随着这些化学药剂的不合理及频繁使用，生产上辣椒疫霉的抗药性问题已日益突出。因此，亟需开发新型防治药剂以缓解抗药性问题、丰富防治药剂选择和减少农业生产损失。

芸香科（Rutaceae）四数花属（Tetradium）植物楝叶吴萸（Tetradium glabrifolium）【原植物名为：楝叶吴萸（Evodia glabrifolia）】主要分布于我国的贵州、云南、广西、广东、湖北、湖南、江西、四川、安徽、浙江、海南等地，植物资源丰富，近成熟果实为民间常用草药，可用于治疗胃脘痛，腹胀，头痛等。楝叶吴萸挥发油是从楝叶吴萸的果实中提取出的挥发油，早期研究发现其具有较强的抗虫作用。经本发明人研究发现，楝叶吴萸挥发油对辣椒疫霉菌丝生长、孢子产生和萌发具有较好的抑制效果，同时，在活体条件下，对辣椒疫霉在辣椒叶片和植株上引起的辣椒疫病有较好的防治效果。另外，本发明人还明确了楝叶吴萸挥发油的主要成分和对辣椒疫霉的主要抑菌活性成分。目前，将楝叶吴萸挥发油应用于辣椒疫病防治的研究尚未有相关报道。

发明内容

本发明提供了楝叶吴萸挥发油在防治辣椒疫病中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现：

本发明所述的楝叶吴萸挥发油，提取自楝叶吴萸果实，提取步骤为：称取一定量的7~9月采摘的新鲜楝叶吴萸近成熟果实，置于圆底烧瓶中，按照1：1的比例加入蒸馏水；随后，将烧瓶置电热套中加热至沸，水蒸气蒸馏提取3~6 h后停止加热；开启提取器下端活塞，将馏出液装于分液漏斗中，静置1 h后回收上层浅黄色透明油状液体；收集的挥发油经无水硫酸钠干燥后即为楝叶吴萸挥发油。

本发明所述的楝叶吴萸挥发油，主要成分为2-十三烷酮、石竹烯、2-十一烷酮、D-柠檬烯和β-橄香烯。

本发明所述的楝叶吴萸挥发油，对辣椒疫霉的主要抑菌活性成分为D-柠檬烯、β-橄香烯和2-十三烷酮。

本发明所述的应用是指用于抑制辣椒疫霉菌丝生长、孢子产生和萌发以及辣椒疫病的防治。

本发明也包括有效成分为楝叶吴萸挥发油的喷雾剂在防治辣椒疫病中的应用。

本发明所述的喷雾剂是指楝叶吴萸挥发油的质量浓度为5%~10%的喷雾剂。

附图说明

图1. 楝叶吴萸挥发油的总离子流图。

图2. 楝叶吴萸挥发油对辣椒疫霉菌丝生长的抑制活性。

图3. 辣椒植株上辣椒疫病病情分级标准。

图4. 辣椒叶片上有效成分为楝叶吴萸挥发油的喷雾剂对辣椒疫病的防治效果。

具体实施方式

以下结合具体的实施例和附图对本发明的技术方案和技术效果作进一步说明。

实施例1：楝叶吴萸挥发油的提取

试验方法：楝叶吴萸挥发油提取自楝叶吴萸近成熟果实。具体提取方法如下：

（1）称取一定量的7~9月采摘的新鲜楝叶吴萸近成熟果实，置于圆底烧瓶中，按照1：1的比例加入蒸馏水；

（2）随后，将烧瓶置电热套中加热至沸，水蒸气蒸馏提取3~6 h后停止加热；

（3）开启提取器下端活塞，将馏出液装于分液漏斗中，静置1 h后回收上层浅黄色透明油状液体；

（4）收集的挥发油经无水硫酸钠干燥后即为楝叶吴萸挥发油，于-20℃密封保存。

试验结果：经上述步骤获得楝叶吴萸挥发油，得率为3.11~6.03%。

实施例2：楝叶吴萸挥发油的成分分析

试验方法：（1）按实施例1提取楝叶吴萸挥发油；（2）采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术对楝叶吴萸挥发油的成分进行分析。具体参数如下：使用安捷伦6890N气相色谱仪和HP-5MS毛细管色谱柱进测定。楝叶吴萸挥发油按照1:100的体积比用丙酮稀释。柱温：初始温度60℃，保持4 min，以8℃/min的速度升温至150℃，保持5 min，再以10℃/min的速度升温至230℃，保持3 min；进样口温度：250℃；离子源温度：250℃；电离能量：70 eV；质量扫描范围：20-650 u；进样量：1 μL。另外，测定了在相同条件下运行的一系列正构烷烃混合对照品（C₈~C₂₄）的保留指数。通过将挥发性化合物的质谱信息和保留指数与NationalInstitute of Standards and Technology（NIST）数据库进行比较，明确楝叶吴萸挥发油的成分，采用色谱峰面积均一化法计算各主要成分的相对含量。

试验结果：楝叶吴萸挥发油的总离子流图见图1。共鉴定获得主要化学成分（相对含量＞2%）13个，峰面积之和占挥发油色谱总峰面积的90.81%（去除溶剂峰）。其中2-十三烷酮（2-tridecanone，22.74%），石竹烯（caryophyllene，14.36%），2-十一烷酮（2-undecanone，12.68%)，D-柠檬烯（D-limonene，9.15%)和β-橄香烯（β-elemene，8.75%)的含量最高，占挥发油色谱总峰面积的67.68%（表1）。

表1. 楝叶吴萸挥发油的主要化学成分

实施例3：楝叶吴萸挥发油对辣椒疫霉菌丝生长的抑制作用

试验方法：（1）按实施例1提取楝叶吴萸挥发油；（2）釆用菌丝生长速率法测定楝叶吴萸挥发油对辣椒疫霉菌丝生长的影响。以丙酮为溶剂将供试楝叶吴萸挥发油配制为10mg/mL的母液，加入V8培养基混匀，使用倍比稀释法制成含楝叶吴萸挥发油终浓度为1.25，2.5，5，10和20 µg/mL楝叶吴萸挥发油的培养基平板，对照加丙酮溶剂。用直径5 mm的灭菌打孔器在活化的辣椒疫霉菌落边缘打取菌饼，反接入培养基平板中。将平板置于25℃恒温培养箱中黑暗倒置培养约4天，用十字交叉法测量菌落直径，计算楝叶吴萸挥发油对辣椒疫霉菌丝生长的抑制率。随后利用DPS软件计算楝叶吴萸挥发油对辣椒疫霉菌丝生长的毒力回归方程和抑制中浓度（median effective concentration，EC₅₀）。

试验结果：如图2所示，楝叶吴萸挥发油对辣椒疫霉菌丝生长具有良好的抑制效果。经计算，楝叶吴萸挥发油对辣椒疫霉菌丝生长毒力回归方程为Y = 3.97 + 2.31 X，r =0.97，EC₅₀= 2.78 µg/mL，EC₉₀= 9.98 µg/mL。

实施例4：楝叶吴萸挥发油对辣椒疫霉孢子产生和萌发的抑制作用

试验方法：（1）按实施例1提取楝叶吴萸挥发油；（2）测定楝叶吴萸挥发油对辣椒疫霉孢子产生和萌发的影响。用直径5 mm灭菌打孔器在活化的辣椒疫霉菌落边缘打取菌饼，接入V8液体培养基平板。将平板置于25℃恒温培养箱中黑暗培养2天后，将V8液体培养基倒掉(注意不要将菌丝倒掉）、用灭菌蒸馏水清洗菌丝3次。随后向平板中加入含有不同浓度（0，2.5，5，10和20 µg/mL）楝叶吴萸挥发油的灭菌自来水继续黑暗培养。待对照组产生大量孢子囊后，转至4℃培养1 h，继续转移至25℃恒温培养箱使孢子大量释放，于光学显微镜下观察并统计孢子产生情况。为了测定孢子的萌发，将对照组产生的孢子悬浮液浓度调整为1×10⁴个/mL，随后将这些孢子悬浮液转移至含有不同浓度（0，2.5，5，10和20 µg/mL）楝叶吴萸挥发油的V8液体培养基中，25℃下黑暗培养24 h。于光学显微镜下观察并统计孢子萌发情况。

试验结果：与对照组相比，添加楝叶吴萸挥发油能够显著抑制辣椒疫霉孢子的产生。不加药的对照组在上述条件下产生孢子数目约为6.42×10⁴个/mL；在含2.5，5，10 µg/mL楝叶吴萸挥发油的灭菌自来水平板中，产生的孢子数目分别约为4.78×10⁴个/mL、2.01×10⁴个/mL、0.28×10⁴个/mL；而高浓度楝叶吴萸挥发油（20 µg/mL）完全抑制了辣椒疫霉孢子的产生。这表明，楝叶吴萸挥发油抑制辣椒疫霉孢子的产生。进一步的，我们发现楝叶吴萸挥发油也能够抑制辣椒疫霉孢子的萌发。辣椒疫霉孢子萌发的速度随着楝叶吴萸挥发油浓度的增加而降低。在25℃黑暗培养8 h后，不加药对照组的孢子的萌发率达到100%，而在含2.5，5，10和20 µg/mL楝叶吴萸挥发油的V8液体培养基平板中，孢子的萌发率仅分别为83.86%、51.28%、30.54%和13.67%。综上所述，楝叶吴萸挥发油能够抑制辣椒疫霉孢子的产生和萌发。

实施例5：楝叶吴萸挥发油对辣椒疫病的防治效果（温室盆栽）

试验方法：（1）按实施例1提取楝叶吴萸挥发油；（2）灌根法测定楝叶吴萸挥发油对辣椒上由辣椒疫霉引起的辣椒疫病的防治效果。取生长均一的4~6期辣椒（苏椒5号）幼苗，在距离辣椒根部约3 cm处用玻璃棒刺一个约3 cm深的孔。将10 mL含有0.1%吐温-80的终浓度为500、800和1000 µg/mL的楝叶吴萸挥发油溶液注入每个孔中。以注入灭菌蒸馏水的辣椒植株为对照。按实施例4的方法配制孢子悬浮液。药剂处理24 h后，取5 mL浓度约为1×10⁴个/mL的辣椒疫霉孢子悬浮液注入上述孔中。灌根植株在25℃培养14天。14天后，对发病植株进行病情分级和统计。分级0 = 健康；1 = 茎秆病斑小于10 mm；2 = 病斑10~20mm；3 =病斑20~30 mm；4 = 病斑大于30 mm；5 = 整株猝倒（图3）。对所有接种植株进行病情统计并根据公式：病情指数 = ∑（病情分级×植株数）；防治效果 = （灭菌水对照组病情指数-施药组病情指数）/灭菌水对照组病情指数；计算楝叶吴萸挥发油对辣椒疫病的防治效果。

试验结果：楝叶吴萸挥发油对辣椒上的辣椒疫病具有较好的防治效果，且效果随着施药浓度的增加而提高。在楝叶吴萸挥发油施药浓度为500 µg/mL时，楝叶吴萸挥发油的防效为30.27%，当施药浓度为800 µg/mL时，楝叶吴萸挥发油的防效为58.51%，当施药浓度为1000 µg/mL时，楝叶吴萸挥发油的防效为75.37%。

实施例6：有效成分为楝叶吴萸挥发油的喷雾剂的制备

试验方法：（1）按实施例1提取楝叶吴萸挥发油；（2）按照以下方法配制有效成分为楝叶吴萸挥发油的喷雾剂：量取100 mL二甲基亚砜溶剂并称取10 g楝叶吴萸挥发油，将挥发油加入到二甲基亚砜中，不断搅拌至均匀。随后在溶液中加入4 mL十二烷基苯磺酸钙，不断搅拌至均匀。最后在溶液中加入0.5 mL氮酮，继续搅拌至均匀即制得最终产品。

试验结果：获得有效成分为楝叶吴萸挥发油的喷雾剂。

实施例7：有效成分为楝叶吴萸挥发油的喷雾剂对辣椒疫病的防治效果（离体叶片）

试验方法：（1）按实施例6配制有效成分为楝叶吴萸挥发油的喷雾剂；（2）离体叶片接种法测定有效成分为楝叶吴萸挥发油的喷雾剂对辣椒叶片上辣椒疫霉病害的防治效果。取生长均一的4~6期辣椒（苏椒5号）幼苗，采取大小、形状较为一致的叶片，用2% NaOCl消毒2 min，随后用灭菌蒸馏水冲洗3次，自然风干备用。分别用灭菌蒸馏水将楝叶吴萸挥发油喷雾剂稀释500、1000、2000倍，随后将稀释后的喷雾剂溶液喷洒至辣椒叶片表面，至液体能够在叶片上流动为止。以喷洒灭菌蒸馏水的叶片为对照。自然风干24 h后，用直径5 mm灭菌打孔器在活化的辣椒疫霉菌落边缘打取菌饼，接种在这些叶片上。接种后的叶片在25℃培养箱中培养约4天。测量并计算对照组和药剂处理组的病斑面积，并计算楝叶吴萸挥发油对辣椒叶片上辣椒疫霉病害的防治效果。防治效果 = （灭菌水对照组病斑面积-施药组病斑面积）/灭菌水对照组病斑面积。

试验结果：按实施例6配制有效成分为楝叶吴萸挥发油的喷雾剂稀释浓度为500倍、1000倍和2000倍时，对辣椒叶片本身没有不良影响，而对辣椒疫霉引起的病害有良好的防治效果。如图4所示，与对照组相比，施药组的病斑面积明显减小。经计算，稀释2000倍时，对病害的防治效果为21.13%，稀释1000倍时，对病害的防治效果为56.68%，稀释500倍时，对病害的防治效果为81.22%。

实施例8：有效成分为楝叶吴萸挥发油的喷雾剂对辣椒疫病的防治效果（温室盆栽）

试验方法：（1）按实施例6配制有效成分为楝叶吴萸挥发油的喷雾剂；（2）测定有效成分为楝叶吴萸挥发油的喷雾剂对辣椒疫病的防治效果。取生长均一的4~6期辣椒（苏椒5号）幼苗备用。分别用灭菌蒸馏水将楝叶吴萸挥发油喷雾剂稀释100、200、500倍，随后将稀释后的喷雾剂溶液喷洒至辣椒植株表面（包含茎基部），至液体能够在叶片上流动为止。以喷洒灭菌蒸馏水的辣椒植株为对照。药剂处理24 h后，在距离辣椒根部约3 cm处用玻璃棒刺一个约3 cm深的孔。按实施例4的方法配制孢子悬浮液，取5 mL浓度约为1×10⁴个/mL的辣椒疫霉孢子悬浮液注入上述孔中。接种植株在25℃培养14天。14天后，按照实施例5所述方法对发病植株进行病情分级和统计，并计算有效成分为楝叶吴萸挥发油的喷雾剂对辣椒疫病的防治效果。

试验结果：按实施例6配制的有效成分为楝叶吴萸挥发油的喷雾剂稀释浓度为100倍、200倍和500倍时，对辣椒本身没有不良影响，而对辣椒疫霉引起的病害也具有较好的防治效果。经统计和计算，有效成分为楝叶吴萸挥发油的喷雾剂稀释500倍时，对病害的防治效果为15.85%，稀释200倍时，对病害的防治效果为45.34%，稀释100倍时，对病害的防治效果为85.29%。

实施例9：楝叶吴萸挥发油的主要活性成分分析

试验方法：（1）按实施例1提取楝叶吴萸挥发油；（2）根据实施例2的结果，已明确楝叶吴萸挥发油的5种含量较高的主要组成成分为2-十三烷酮，石竹烯，2-十一烷酮，D-柠檬烯和β-橄香烯；（3）从试剂公司购买获得这5种主要成分的标准品（表2），采用实施例3所述菌丝生长速率法测定5种化合物对辣椒疫霉的抑菌活性。

表2. 楝叶吴萸挥发油5种主要成分的来源及纯度

化合物	公司	纯度
			D-柠檬烯	阿拉丁Aladdin	>99.0% (GC)
2-十一烷酮	阿拉丁Aladdin	≥99.5% (GC)
			<i>β</i>-橄香烯	阿拉丁Aladdin	95.0%
石竹烯	Sigma-Aldrich	≥98.0% (GC)
			2-十三烷酮	Sigma-Aldrich	≥98.0%

试验结果：利用菌丝生长速率法测定了D-柠檬烯、2-十一烷酮、β-橄香烯、石竹烯和2-十三烷酮等5种化合物对辣椒疫霉菌丝生长的抑制活性。结果表明，D-柠檬烯对辣椒疫霉菌丝生长有较好的抑制活性，在浓度为20 µg/mL时，抑制率为87.54%。β-橄香烯和2-十三烷酮对辣椒疫霉菌丝生长也有较弱的抑制能力，在浓度为20 µg/mL时，抑制率分别为62.45%和51.21%。

Claims

1.楝叶吴萸挥发油在防治辣椒疫病中的应用，其特征在于：所述楝叶吴萸挥发油的主要成分为2-十三烷酮、石竹烯、2-十一烷酮、D-柠檬烯和β-橄香烯。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述楝叶吴萸挥发油提取自楝叶吴萸果实，提取步骤为：选择7~9月采摘的新鲜楝叶吴萸近成熟果实，去除杂质，用灭菌蒸馏水冲洗3次，于室温通风处自然风干24 h，过筛后于4℃密封备用；称取一定量的楝叶吴萸粉末置于圆底烧瓶中，按照1：6的比例加入蒸馏水，浸泡1 h，将烧瓶置电热套中加热至沸，水蒸气蒸馏提取3~6 h至挥发油量不再增加后停止加热；开启提取器下端活塞，将馏出液装于分液漏斗中，静置1 h后回收上层浅黄色透明油状液体；收集的挥发油经无水硫酸钠干燥。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：对辣椒疫霉的主要抑菌活性成分为D-柠檬烯、β-橄香烯和2-十三烷酮。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：用于抑制辣椒疫霉菌丝生长、孢子产生和萌发。

5.有效成分为楝叶吴萸挥发油的喷雾剂在防治辣椒疫病中的应用，其特征在于：所述楝叶吴萸挥发油的主要成分为2-十三烷酮、石竹烯、2-十一烷酮、D-柠檬烯和β-橄香烯。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：楝叶吴萸挥发油的质量浓度为5%~10%。