CN104292237B - 一种六环生物碱类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种六环生物碱类化合物及其制备方法与应用 Download PDF

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    • C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system

Abstract

本发明公开了一种六环生物碱类化合物及其制备方法与应用，所述的六环生物碱类化合物是以青霉属分枝青霉组(Penicillium ramigena，YNCA0361)菌株经发酵、浸膏提取、层析、纯化后得到，其分子式为C19H20N2O6，结构式为：该化合物命名为：青霉菌生物碱A；所述青霉属分枝青霉组(Penicillium ramigena，YNCA0361)菌株，菌株保藏编号为CGMCC No. 4824，保藏日期为2011年5月2日。所述的制备方法包括固体发酵、浸膏提取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离纯化步骤。本发明的应用为所述的六环生物碱类化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。本发明的化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中有良好的应用前景。本发明化合物活性好，可通过生物发酵途径获得，可作为抗烟草花叶病毒药物的先导性化合物。

Description

一种六环生物碱类化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种六环生物碱类化合物及其制备方法与应用。
背景技术
微生物代谢产物的种类很多，在菌体对数生长期所产生的产物，如氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸、糖类等，是菌体生长繁殖所必需的。这些产物叫做初级代谢产物；在菌体生长静止期，某些菌体能合成一些具有特定功能的产物，如抗生素、生物碱、细菌毒素、植物生长因子等。这些产物与菌体生长繁殖无明显关系，叫做次生代谢产物。次生代谢产物多为小分子化合物，但其化学结构类型多种多样，不同结构的次生代谢产物广泛具有抗炎症、抗菌、抗病毒、抗癌、扩张心血管、强心、平喘等多种生理活性，因而从微生物次生代谢中发现具有药用价值的先导性化合物得到了广泛的关注，并且药物生产已成为发酵工业的重要支柱。
生物碱是存在于自然界（主要为植物，但有的也存在于动物）中的一类含氮的碱性有机化合物，有似碱的性质。大多数生物碱有复杂的环状结构，氮素多包含在环内。生物碱类化合物有显著的生物活性，是一类重要的药用成分。本发明从青霉属分枝青霉组固体发酵产物中分离得到一种具有显著抗烟草花叶病毒活性的六环生物碱类化合物；该化合物至今尚未见到相关报道。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种六环生物碱类化合物；第二目的在于提供所述的六环生物碱类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述六环生物碱类化合物的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的六环生物碱类化合物是以青霉属分枝青霉组(Penicillium ramigena，YNCA0361)菌株经发酵、浸膏提取、层析、纯化后得到，其结构式为：
该化合物命名为：青霉菌生物碱A；
所述青霉属分枝青霉组(Penicillium ramigena，YNCA0361)菌株，菌株保藏编号为CGMCC No. 4824，保藏日期为2011年5月2日。
本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：
A、固体发酵：将菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中于28℃培养7天，接种到含100ml马铃薯葡萄糖液体培养基的250ml锥形瓶中，于28℃下在转速180rpm旋转震荡的条件下培养5天，得到供发酵用的菌种，将其接种进行大规模固体发酵得到发酵产物；
B、浸膏提取：将发酵产物中加入固液体积比1.5~3的体积浓度60~80%醇溶剂提取1~3次，提取液再加入体积比1:0.5的乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯萃取部分经浓缩（蒸干乙酸乙酯）得到浸膏；
C、硅胶柱层析：浸膏用重量比2~5倍量的160~300目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析，以1:0~0:1的氯仿-丙酮进行梯度洗脱，合并相同部分，收集各部分的洗脱液并浓缩；
D、高压液相色谱分离纯化：洗脱液的9:1部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得目标物六环生物碱类化合物。
本发明的六环生物碱类化合物的结构通过以下方法测定。该化合物为黄色胶状物；比旋光度值 -52.6 (c 0.22, 甲醇); 紫外光谱 (甲醇) λmax (log ε): 220(4.17), 252 (3.42), 295 (2.18) nm; 圆二色谱 (CD) (c 0.12, MeOH) Δε207 -35.6,Δε225 +28.8; 红外光谱 (溴化钾压片) νmax 3412, 3069, 2916, 1718, 1610, 1462,1380, 1251, 1163, 1074, 922, 857 cm-1; 电喷雾质谱(正离子模式) m/z 395 [M + Na]+; 高分辨电喷雾质谱(正离子模式) m/z 395.1212 [M + Na]+ (计算值395.1219).化合物的核磁共振碳谱和氢谱数据见表-1。由于化合物结构复杂，无法通过核磁共振确定其平面结构和构型，我们培养了单晶，并通过X-射线单晶衍射的方法确定了化合物的结构和绝对构型。
表-1.化合物的1H NMR 和13C NMR 数据 (CDCl3)1 13 3
No. δC δH No. δC δH
2 178.4 s 13 138.2 s
3 82.9 s 14 122.0 d 6.99 (d, 7.8)
4 54.8 d 3.25 (d, 8.6) 15 131.8 d 7.33 (t, 7.8)
5 106.1 s 16 107.2 d 6.69 (d, 7.8)
6 107.2 s 17 143.2 s
7 76.7 d 4.71 (s) 18 122.9 s
8 174.5 s 21 21.8 q 1.91 (s)
10 67.8 s 22 30.5 q 1.71 (s)
11 56.4 d 2.36 (m) 23 26.2 q 2.98 (s)
12 28.0 t 2.65 (d, 8.4)
本发明的第三目的是这样实现的，所述的六环生物碱类化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。
本发明化合物系首次从青霉属分枝青霉组固体发酵产物中分离得到的，并通过X-射线单晶衍射的方法确定化合物的结构，还补充了核磁共振、质谱、红外，紫外、圆二色谱等数据。经对抗烟草花叶病毒的实验，其相对抑制率达到56.4%，IC50 值达15.4 μM，具有很好的抗烟草花叶病毒活性，超过阳性对照品南宁霉素的相对抑制率（30.5%）。以上结果揭示了本发明的化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中有良好的应用前景。本发明化合物活性好，可通过生物发酵途径获得，可作为抗烟草花叶病毒药物的先导性化合物。
附图说明
图1为本发明化合物的核磁共振碳谱；
图2为本发化合物的核磁共振氢谱；
图3为本发明化合物的HSQC谱；
图4为本发明化合物的HMBC相关谱；
图5为本发明化合物的1H-1H COSY相关谱；
图6为本发明化合物的ROESY相关谱；
图7为本发明化合物的CD谱；
图8为本发明化合物的X-射线单晶衍射图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的六环生物碱类化合物，是以青霉属分枝青霉组(Penicilliumramigena，YNCA0361)菌株经发酵、浸膏提取、层析、纯化后得到，其结构式为：
该化合物命名为：青霉菌生物碱A；
所述青霉属分枝青霉组(Penicillium ramigena，YNCA0361)菌株，菌株保藏编号为CGMCC No. 4824，保藏日期为2011年5月2日；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。
本发明所述六环生物碱类化合物的制备方法，包括以下步骤：
A、固体发酵：将菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中于28℃培养7天，接种到含100ml马铃薯葡萄糖液体培养基（取200 g马铃薯切成小块，加水煮烂（煮沸20~30分钟，能被玻璃棒戳破即煮马铃薯块可），用八层纱布过滤，加热，再加5 g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入20 g 葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，（121℃）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用）的250ml锥形瓶中，于28℃下在转速180rpm旋转震荡的条件下培养5天，得到供发酵用的菌种，将其接种进行大规模固体发酵得到发酵产物；
B、浸膏提取：将发酵产物中加入固液体积比1.5~3的体积浓度60~80%醇溶剂提取1~3次，提取液再加入体积比1:0.5的乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯萃取部分经浓缩（蒸干乙酸乙酯）得到浸膏；
C、硅胶柱层析：浸膏用重量比2~5倍量的160~300目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析，以1:0~0:1的氯仿-丙酮进行梯度洗脱，合并相同部分，收集各部分的洗脱液并浓缩；
D、高压液相色谱分离纯化：洗脱液的9:1部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得目标物六环生物碱类化合物。
A步骤中所述的马铃薯葡萄糖培养基取200 g马铃薯切成小块，加水煮烂，即煮沸20~30分钟，能被玻璃棒戳破即煮马铃薯块即可，用八层纱布过滤，加热，再加5 g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入20 g 葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎， 121℃灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用。
A步骤中所述的大规模固体发酵是将供发酵用的菌种在500 mL锥形瓶中进行，每个锥形瓶中含100 g 大米和120 mL的水，高温消毒灭菌后接种上菌种；每批发酵50瓶，在25℃下发酵45天。
B步骤中所述的醇溶剂为甲醇或乙醇。
C步骤中所述的浸膏在经硅胶柱层析粗分前，还包括用重量比1.5～3倍量的纯甲醇或纯乙醇或纯丙酮溶解后，用重量比1.0～2.0倍的80～100目硅胶拌样。
C步骤中所述的氯仿-丙酮溶液体积配比为1:0、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和0:1。
D步骤中所述的高压液相色谱分离纯化是采用21.2 mm × 250 mm，5 μm的C18色谱柱，流速为12 mL/min，流动相为60%的甲醇，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样200μL，收集22.5 min的色谱峰，多次累加后蒸干。
D步骤中所述高压液相色谱分离纯化后，所得化合物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化。
本发明的应用为所述的六环生物碱类化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。
另外，本发明的菌种不局限于青霉属分枝青霉组(Penicillium ramigena，YNCA0361)菌株，下面以青霉菌为例对本发明进行进一步说明。
本发明所述的六环生物碱类化合物从青霉菌 (Penicillium versicolor)固体发酵产物中分离得到，其分子式为C19H20N2O6，具有下述结构式：
该化合物命名为青霉菌生物碱A，英文名称为：Penicilline A；为黄色结晶。
所述六环生物碱类化合物的方法，以青霉菌固体发酵产物为原料，经浸膏提取、硅胶柱层析、高压液相色谱、凝胶柱层析制备而成，具体包括以下步骤：
(1) 菌种筛选：该菌株从百合科重楼属滇重楼(Paris polyphylla var.yunnanensis)中分到，菌株由云南民族大学杜刚博士鉴定青霉菌属 (Penicilliumversicolor)，ITS 序列号为(Genbank Accession number KJ801852)。
(2) 固体发酵和浸膏提取：菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中培养7天，培养温度为28 ℃；该琼脂塞接种到含100 mL 马铃薯葡萄糖的250 mL锥形瓶中，在28 ℃，转速为180 rpm 旋转震荡的条件下培养5天，得到供发酵用的菌种。固体发酵在500 mL锥形瓶中进行，每个锥形瓶中含100 g 大米和120 mL的水，高温消毒灭菌后接种上菌种；每批发酵50瓶，在25 ℃下发酵45天。发酵产物用70%的甲醇提取，然后再用乙酸乙酯萃取, 乙酸乙酯萃取部分用浓缩得到浸膏210 g。
(3) 硅胶柱层析：浸膏用重量比2～5倍量的160～300目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析；以氯仿-丙酮进行梯度洗脱，合并相同部分，收集各部分的洗脱液并浓缩；
(4) 高压液相色谱分离纯化：洗脱液的9:1部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得所需的六环生物碱类化合物。
高压液相色谱分离纯化是采用21.2 mm × 250 mm，5μm的C18色谱柱，流速为12mL/min，流动相为60%的甲醇，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样200 μL，收集22.5min的色谱峰，多次累加后蒸干，所得产物再进行凝胶柱层析。
其中，凝胶柱层析步骤中，所得化合物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化。
下面以实施例本发明作进一步说明：
实施例1
------固体发酵和浸膏提取：
菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中培养7天，培养温度为28 ℃；该琼脂塞接种到含100 mL 马铃薯葡萄糖的250 mL锥形瓶中，在28 ℃，转速为 180 rpm 旋转震荡的条件下培养5天，得到供发酵用的菌种。固体发酵在500 mL锥形瓶中进行，每个锥形瓶中含100 g大米和120 mL的水，高温消毒灭菌后接种上菌种；每批发酵50瓶，在25 ℃下发酵45天。发酵产物用70%的甲醇提取，然后再用乙酸乙酯萃取, 乙酸乙酯萃取部分用浓缩得到浸膏210g。
实施例2
------化合物分离
浸膏用重量比2.0倍量的纯甲醇溶解后用350 g的100目粗硅胶拌样，1.2 kg 的160目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、0:1的氯仿-丙酮梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为9:1的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以60％的甲醇为流动相，Zorbax SB-C18(21.2 × 250 mm, 5 μm)制备柱为固定相，流速为12 ml/min，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样200 μL，收集22.5 min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-20 凝胶柱层析分离，即得该新化合物。
实施例3
-------化合物的鉴定
本发明的六环生物碱类化合物的结构通过以下方法测定。该化合物为黄色胶状物；比旋光度值 -52.6 (c 0.22, 甲醇); 紫外光谱 (甲醇) λmax (log ε): 220(4.17), 252 (3.42), 295 (2.18) nm; 圆二色谱 (CD) (c 0.12, MeOH) Δε207 -35.6,Δε225 +28.8; 红外光谱 (溴化钾压片) νmax 3412, 3069, 2916, 1718, 1610, 1462,1380, 1251, 1163, 1074, 922, 857 cm-1; 电喷雾质谱(正离子模式) m/z 395 [M + Na]+; 高分辨电喷雾质谱(正离子模式) m/z 395.1212 [M + Na]+ (计算值395.1219).化合物的核磁共振碳谱和氢谱数据见表-1。由于化合物结构复杂，无法通过核磁共振确定其平面结构和构型，我们培养了单晶，并通过X-射线单晶衍射的方法确定了化合物的结构和绝对构型。所测试的波谱数据可为今后类似化合物的结构鉴定提供依据。
实施例4
------抗烟草花叶病毒的活性试验
取实施例2～4制备的任一生物碱类化合物进行抗烟草花叶病毒活性试验，试验情况如下：
采用半叶法，在药剂的质量浓度均为50 mg/L时对本发明化合物进行抗烟草花叶病毒活性测定。在5～6龄烤烟的植株上，选取适用于测试的叶片(叶行正常，无病无虫)，先将叶片均匀撒上细金刚砂，用毛笔将备用的烟草花叶病毒源(3.0×10-3)均匀抹在撒有金刚砂的叶片上，待所有中选的叶片接毒结束后，立即放在盛有药液的培养皿中处理20 min，取出，擦去叶片上水珠和药液，将两个半叶复原排放在铺有卫生纸保湿的玻璃缸中，并盖上玻璃盖，控温(23 ± 2)℃，放在温室自然光照射，2～3 d即可见枯斑．每个处理都设另一半叶为对照，另外设有1组为商品宁南霉素的处理作为对比，按下公式计算相对抑制率。
XI％=(CK-T)／CK×100％
X：相对抑制率(％)，CK：浸泡于清水中半片接毒叶的枯斑数(个)，T浸泡于药液中半片接毒叶的枯斑数(个)。
配制不同浓度的化合物进行抗病毒抑制率实验，确定化合物的IC50
结果明本化合物的相对抑制率为56.4%，超过对照宁南霉素的相对抑制率30.5%，化合物的IC50 值达15.4 μM，说明化合物具有很好的抗烟草花叶病毒活性。

Claims (10)

1.一种六环生物碱类化合物，其特征在于所述的六环生物碱类化合物是以青霉属分枝青霉组(Penicillium ramigena，YNCA0361)菌株经发酵、浸膏提取、层析、纯化后得到，其分子式为C19H20N2O6，结构式为：
该化合物命名为：青霉菌生物碱A；
所述青霉属分枝青霉组(Penicillium ramigena，YNCA0361)菌株，菌株保藏编号为CGMCC No. 4824，保藏日期为2011年5月2日。
2.一种权利要求1所述六环生物碱类化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
A、固体发酵：将菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中于28℃培养7天，接种到含100 ml马铃薯葡萄糖培养基的250ml锥形瓶中，于28℃下在转速180rpm旋转震荡的条件下培养5天，得到供发酵用的菌种，将其接种进行大规模固体发酵得到发酵产物；
B、浸膏提取：向发酵产物中加入固液体积比1.5~3倍的体积浓度60~80%的醇溶剂提取1~3次，提取液再加入体积比1:0.5的乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯萃取部分经浓缩得到浸膏；
C、硅胶柱层析：浸膏用重量比2~5倍量的160~300目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析，以1:0~0:1的氯仿-丙酮进行梯度洗脱，合并相同部分，收集各部分的洗脱液并浓缩；
D、高压液相色谱分离纯化：洗脱液的9:1部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得目标物六环生物碱类化合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于A步骤中所述马铃薯葡萄糖培养基的制备方法为：取200g马铃薯切成小块，加水煮烂，即煮沸20~30分钟，能被玻璃棒戳破即可，用八层纱布过滤，加热，再加5g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入20g 葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，121℃灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于A步骤中所述的大规模固体发酵是将供发酵用的菌种在500mL锥形瓶中进行，每个锥形瓶中含100g大米和120mL的水，高温消毒灭菌后接种上菌种；每批发酵50瓶，在25 ℃下发酵45天。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于B步骤中所述的醇溶剂为甲醇或乙醇。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于C步骤中所述的浸膏在经硅胶柱层析粗分前，还包括将浸膏用重量比1.5～3倍量的纯甲醇或纯乙醇或纯丙酮溶解后，用重量比1.0～2.0倍的80～100目硅胶拌样。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于C步骤中所述的氯仿-丙酮溶液体积配比为1:0、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和0:1。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于D步骤中所述的高压液相色谱分离纯化是采用21.2 mm×250 mm，5μm的C18色谱柱，流速为12mL/min，流动相为60%的甲醇，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样200μL，收集22.5 min的色谱峰，多次累加后蒸干。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于D步骤中所述高压液相色谱分离纯化后，所得化合物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化。
10.一种权利要求1所述的六环生物碱类化合物的应用，其特征在于所述的六环生物碱类化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。
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