CN103749456A

CN103749456A - 二萜生物碱类化合物及制剂在抑防作物病毒病害中的应用

Info

Publication number: CN103749456A
Application number: CN201310726275.9A
Authority: CN
Inventors: 徐维明; 胡德禹; 宋宝安; 杨松; 贺鸣; 陈卓; 薛伟; 黎世泽
Original assignee: Guizhou University
Current assignee: Guizhou University
Priority date: 2013-12-25
Filing date: 2013-12-25
Publication date: 2014-04-30

Abstract

本发明二萜生物碱类化合物及制剂在抑防作物病毒病害中的应用，涉及化工和农药，所指二萜生物碱类化合物是从乌头快根中提取分离出的二萜生物碱类化合物，结构通式如式(I)，主要用于防治或抑制作物烟草花叶病毒病害，由于二萜类化合物结构新颖，是一类新农药，农药市面上没有此类农药，因此，不会和现有农药产生交互抗性。

Description

二萜生物碱类化合物及制剂在抑防作物病毒病害中的应用

技术领域

本发明涉及化工和农药，具体的说是一类二萜生物碱类化合物及制剂在抑制和防治作物烟草花叶病毒病害的应用。

背景技术

烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, 缩写: TMV)是烟草花叶病等的病原体，属于Tobamovirus群，其寄主范围很广，可侵染十字花科、茄科、菊科、藜科及苋科等36 科350 种植物，包括烟草、番茄、茄子、辣椒、菠菜等。作为世界上最先发现并确定的病毒，已经有了一百多年的历史，由其引起的烟草花叶病在世界各烟区普遍发生。烟草植株染病后，幼嫩叶片侧脉及支脉组织呈半透明状，即明脉，叶脉两侧叶肉组织渐呈淡绿色。病毒在叶片组织内大量增殖，使部分叶肉细胞增大或增多，出现叶片薄厚不匀，颜色黄绿相间，呈花叶状。后花叶斑驳程度加大，并现大面积深褐色坏死斑，中下部老叶尤甚，发病重的叶片皱缩、畸形、扭曲。早期发病的植株节间缩短，严重矮化，生长缓慢，不能正常开花结实，并易脱落。能发育的荫果小而皱缩，种子量少且小，多不能发芽。烟草花叶病毒具有寄主范围广、抗逆性强和在生产上造成的危害大等特点，在我国南北烟区均有发生，尤其南方烟区发病较重，田间株发病率一般5%~20%，个别田块可高达90%~100%，早期发病的损失可达50%~70%，甚至失收。此外，病叶在烤晒后颜色不均，烟味差，品质大为降低。全世界每年因TMV 而造成的经济损失就超过1 亿美元。由于病毒一旦侵入寄主, 其增殖就与寄主的代谢融为一体, 抑制病毒增殖的药剂很难不伤害寄主, 因此, 该病毒病的防治一直以来是植物病害防治的难点。(李才华，凌受恒，沈力，周向平，黄石旺. 几种防治烟草花叶病的药剂筛选, 安徽农业科学, 2009, 37(34): 16909-16910)。

为了开发理想的抗烟草花叶病毒病药剂，化学工作者进行了许多的定向合成和筛选，但至今仍然没有开发出高效而友好的抗病毒剂。目前，从天然药物中获取新药已经在全球范围内形成了有组织、有计划的创新行为,来自天然药物活性成分的新药已经在临床上大范围使用,全球药品市场中天然来源的药物制剂已经占临床药物的30%，青蒿素、紫杉醇等已经成为临床不可或缺的一线药物。同时，越来越多的研究工作更注重于天然产物的生物活性研究。如汪清明等首次发现广泛分布于我国西北旱沙荒漠地带的牛心朴子草提取物中生物碱部位对危害极大的烟草花叶病毒具有很高的抑制活性，经生物活性跟踪与色谱分离，结构鉴定确认主要活性成分是安托芬(汪清民等，牛心朴子草抑制植物病毒活性成分安托芬的室内和田间活性测定，农药， 2007, 46(6), 425-427).

本课题组在贵州省农业公关项目的支持下，针对黔产草乌中的二萜生物碱在农药上的应用而展开研究，首先分离并鉴定草乌中的二萜生物碱，生物活性测试评价表明目标化合物对烟草花叶病毒具有较好的活性。

发明内容

式(I)所示的二萜生物碱类化合物用于防治或抑制作物烟草花叶病毒病害的用途，

Figure 2013107262759100002DEST_PATH_IMAGE001

式(I)

式(I)中：

R₁选自氢、甲基、乙基；

R₂选自氢、羟基、甲氧基、乙氧基、甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、取代苯甲酰基；

R₃选自氢、羟基、甲氧基、乙氧基、甲酰基、乙酰基；

R₄选自氢、羟基、甲氧基、乙氧基、甲酰基、乙酰基；

R₅选自氢、羟基、甲氧基、乙氧基、甲酰基、乙酰基。

所述的取代苯甲酰基选自邻氟苯甲酰基、间氟苯甲酰基、对氟苯甲酰基、邻氯苯甲酰基、间氯苯甲酰基、对氯苯甲酰基、2,3-二氟苯甲酰基、3,4-二氟苯甲酰基、2,3-二氯苯甲酰基、3,4-二氯苯甲酰基。

式(I)所示的二萜生物碱类化合物中，

当 R₁=CH₃, R₂=OH, R₃=H, R₄=(S)OH, R₅=(S)OCH₃时，为Hypaconitine；

当R₁=CH₃, R₂=OH, R₃=H, R₄=(S)OH, R₅=(S)OCH₃时，为 Mesaconitine；

当R₁=CH₂CH₃, R₂=H, R₃=H, R₄=(S)OH, R₅=(S)OCH₃时，为Aconitine；

当R₁=CH₃, R₂=OH, R₃=(S)OH, R₄=(S)OH, R₅=(S)OCH₃时，为Fuziline；

当R₁=CH₃, R₂=OH, R₃=(S)OH, R₄=H, R₅=H时，为Lycoctonine。

所述二萜生物碱类化合物用于防治或抑制作物病毒病害。

所述二萜生物碱类化合物用于防治或抑制烟草花叶病毒病害、黄瓜花叶病毒病害、水稻条纹叶枯病毒病害、水稻矮缩病毒病害、玉米粗缩病毒病害、水稻黑条矮缩病毒病害、番茄病毒病毒病害。

所述制剂含有上述的二萜生物碱类化合物，并且所述制剂的剂型为乳油、微乳、水乳、悬浮剂、种衣剂、拌种剂、可湿性粉剂、缓释颗粒剂、控释颗粒剂、水分散粒剂、干悬浮剂或颗粒剂。

所述制剂的剂型中，有效成分二萜生物碱类化合物占制剂总重量的1%~90%，更具体的含量是10%~85%。

所述的二萜生物碱类化合物用于处理病毒、病毒栖息地或需防治病毒侵袭的材料、植物、区域、土壤、种子或空间的用途。

具体实施方式

实施例一：二萜生物碱类化合物类化合物的提取分离

称取贵州省种植的乌头块根8 KG，粉碎后以工业乙醇室温提取4次，前三次每次浸泡7天，第4次浸泡10天至无生物碱检出 ( TLC 检测)。在浓缩液中加入5 %的盐酸溶液至pH= 3 ,用氯仿萃取数次。然后,加浓氨水至pH = 11 ,再用氯仿萃取至水溶液中无生物碱，合并氯仿提取物，减压脱氯仿得到草乌中总生物碱31 克。

将草乌中总生物碱上80*800 mm的层析柱分离，以石油醚:乙酸乙酯:三乙胺=15:1:1.2的混合溶剂作为洗脱剂。以1000 mL为一个分离段，收集了140个分离段。然后以氯仿：甲醇：三乙胺1:1:0.1的混合溶剂作为洗脱剂。以1000mL为一个分离段，收集了70个分离段。然后用不同比例的石油醚-乙酸乙酯-三乙胺和氯仿-甲醇-三乙胺进行反复硅胶常压柱层析，得到化合物a-f。

化合物a, white solid, m.p 202-203??C; MS(m/z): 615, 556(M⁺-HAc); ¹H NMR(500Hz, CDCl₃) δ: 1.37(3H, s, COCH₃), 2.34(3 H, s, NCH₃), 3.16(3H, s, OCH₃-18), 3.29(6 H, s, OCH₃-1,6), 3.32-3.33(1H, d, J=5.2 Hz, H-16α), 3.74(3 H, s, OCH₃-16), 3.92(1H, br s OH-13), 4.35(1H, d, J=2.7Hz, OH-15), 4.88 (1H, d, J=5.15 Hz ,H-14),7.44-8.05(5H, m, Ar-H). ¹³C NMR(125Hz, CDCl₃) δ: 85.16(C-1), 26.47(C-2), 34.97(C-3), 39.36(C-4), 48.26(C-5), 83.23(C-6), 44.62(C-7), 92.02(C-8), 43.92(C-9), 41.16(C-10), 50.00(C-11), 36.34(C-12), 74.21(C-13), 78.92(C-14), 79.02(C-15), 90.22(C-16), 62.25(C-17), 80.24(C-18), 56.02(C-19), 56.68(C-1*), 58.05(C-6*), 61.07(C-16*), 59.13(C-18*), 42.70(N-CH₃), 172.49(CH₃ CO), 21.48(CH ₃CO), 166.20(C₆H₅ CO), 129.91, 129.69*2, 128.70*2, 133.32(Ar-C). 鉴定为次乌头碱(Hypaconitine). Pelletier, S.W.; Djarmati, Z. J. A. Chem.Soc. 1976, 98, 2626.

化合物b, white solid, m.p 172-174??C, MS(m/z): 357; ¹H NMR(500Hz, CDCl₃) δ: 0.76(3H, s, CH₃-4), 1.06 (3H, t, J=6.85, NCH₂ CH ₃), 3.83-3.83(1H, t, J=9.45, H-1), 5.20-5.29 (2H, m, =CH₂), ¹³C NMR(125Hz, CDCl₃) δ: 70.45(C-1), 31.74(C-2), 32.24(C-3), 34.18(C-4), 48.24(C-5), 23.27(C-6), 43.58(C-7), 52.46(C-8), 35.27 (C-9), 49.26(C-10), 38.24(C-11), 210.21(C-12), 53.87(C-13), 37.40(C-14), 77.12(C-15), 151.03(C-16), 111.53(C-17), 26.17(C-18), 57.50(C-19), 66.10(C-20), 51.10(N-CH₃), 13.70(CH₃). 鉴定为宋果灵 (Songorine). Takayama, H.; Wu, F. E.; Eda, H.; Oda, K. Chem. Pharm. Bull. 1991, 39, 1644-1646.

化合物c, white solid, m.p 202-204??C, MS(m/z): 631, ¹H NMR(500Hz, CDCl₃) δ: 1.38(3H, s, COCH₃), 2.34(3 H, s, NCH₃), 2.87(1H, s, H-17), 3.16(3H, s, OCH₃-18), 3.29(6 H, s, OCH₃-6, 18), 3.61(2H, J=9.0Hz, H-18), 3.72(1H, overlap, H-3), 3.73(3H, s, OCH₃-16), 3.94(1H, s, OH-13), 4.35(1H, d, J=2.85, OH-15), 4.86 (1H, d, J= 5.15 Hz ,H-14),7.44-8.04(5H, m, Ar-H). ¹³C NMR(125Hz, CDCl₃) δ: 83.25(C-1), 35.87(C-2), 71.33(C-3), 43.55(C-4), 46.72(C-5), 82.51(C-6), 44.33(C-7), 91.94(C-8), 43.74(C-9), 40.92(C-10), 50.00(C-11), 34.18(C-12), 74.13(C-13), 78.94(C-14), 78.94(C-15), 90.08(C-16), 62.25(C-17), 76.47(C-18), 49.54(C-19), 56.46(C-1*), 58.03(C-6*), 61.17(C-16*), 59.22(C-18*), 42.52(N-CH₃), 172.54(CH₃ CO), 21.53(CH ₃CO), 166.20(C₆H₅ CO), 129.91, 129.69*2, 128.70*2, 133.32(Ar-C). 鉴定为中乌头碱(Mesaconitine). Wang, F. P. J. Nat. Prod. 1987, 50, 55.

化合物d, white solid, m.p 198-200??C, MS(m/z): 645, ¹H NMR(500Hz, CDCl₃) δ: 1.12(3H, t, J=7.05, N-CH₂ CH ₃), 1.44(3H, s, COCH₃), 3.16, 3.29, 3.32, 3.75(each 3H, s, OCH₃), 4.06(1H, d, J=5.5Hz, H-6), 4.47(1H, d, J=5.0Hz, H-15), 4.88 (1H, d, J=5.15 Hz ,H-14),7.42-8.04(5H, m, Ar-H); ¹³C NMR(125Hz, CDCl₃) δ: 82.05(C-1), 33.17(C-2), 71.03(C-3), 43.25(C-4), 46.82(C-5), 83.52(C-6), 44.63(C-7), 91.97(C-8), 43.74(C-9), 44.02(C-10), 50.01(C-11), 34.98(C-12), 74.11(C-13), 78.90(C-14), 78.90(C-15), 90.01(C-16), 61.15(C-17), 76.57(C-18), 47.64(C-19), 48.92(N-CH ₂CH₃), 13.02(N-CH₂ CH ₃), 55.86(C-1*), 58.00(C-6*), 61.15(C-16*), 59.26(C-18*), 172.34(CH₃ CO), 21.34(CH ₃CO), 166.04(C₆H₅ CO), 129.91, 129.58, 129.91, 128.71*2, 133.34(Ar-C). 鉴定为乌头碱(Aconitine). 陈立书，邓步华. 康定乌头根的化学成分研究, 中国药业, 2009, 18(7), 3-4.

化合物e, white solid, m.p 193-195??C, MS(m/z): 453; ¹H NMR(500Hz, CDCl₃) δ: 1.10 (3H, t, J=6.85, NCH₂ CH ₃), 3.33, 3.35, 3.45, (each 3H, s, OCH₃), 3.72(1H, m, H-1), 4.33(1H, t, J=4.5Hz, H-14), 4.58(1H, d, J=6.85Hz, H-15); ¹³C NMR(125Hz, CDCl₃) δ: 72.25(C-1), 29.56(C-2), 30.16(C-3), 38.14(C-4), 44.17(C-5), 84.44(C-6), 49.85(C-7), 79.89(C-8), 47.56 (C-9), 40.73(C-10), 49.43(C-11), 30.78(C-12), 43.68(C-13), 85.89(C-14), 79.04(C-15), 90.52(C-16), 62.67(C-17), 80.22(C-18), 56.81(C-19), 58.15(C-6*), 57.59(C-16*), 59.23(C-18*), 48.58(N-CH ₂CH₃), 13.22(N-CH₂ CH ₃), 鉴定为附子灵(Fuziline). 徐暾海,赵洪峰,徐雅娟,等. 四川江油生附子强心成分的研究[J]. 中草药，2004, 35(9): 964-6.

化合物f, white solid, m.p 174-177??C, MS(m/z): 467; ¹H NMR(500Hz, CDCl₃) δ: 1.10 (3H, t, J=6.85, NCH₂ CH ₃), 3.23, 3.33, 3.35, 3.45, (each 3H, s, 4×OCH₃), 3.57(1H, t, J=4.8 Hz, H-14); ¹³C NMR(125Hz, CDCl₃) δ: 82.71(C-1), 26.86(C-2), 31.18(C-3), 38.74(C-4), 43.67(C-5), 90.04(C-6), 88.65(C-7), 77.89(C-8), 49.36 (C-9), 38.33(C-10), 49.49(C-11), 28.78(C-12), 46.45(C-13), 83.89(C-14), 33.86(C-15), 82.76(C-16), 64.67(C-17), 68.22(C-18), 52.81(C-19), 55.75(C-1*), 57.85(C-6*), 58.05(C-14*), 56.59(C-16*), 59.23(C-18*), 51.58(N-CH ₂CH₃), 14.22(N-CH₂ CH ₃), 鉴定为牛扁碱(Lycoctonine). Pelletier SW, Mody NV , Varughase KI. Structure revision of 37 ly2 coctonine-related diterpenoid alkaloids [J]. J. Am. Chem. Soc. 1981, 103: 6536

实施例二：对中乌头碱的结构修饰

中乌头碱3-位乙酰化产物（化合物g）：

Figure 2013107262759100002DEST_PATH_IMAGE003

称取中乌头碱(0.05 g, 0.079 mmol) 于 25mL的三口瓶中，用4.0mL的三氯甲烷溶解，再加入吡啶 (6.2 mg, 0.079 mmol)。控制温度在5℃左右，5分钟后加入用2mL三氯甲烷溶解的醋酸酐(0.0124 g, 0.79 mmol), 并将反应在室温下搅拌反应，同时TLC板跟踪反应，反应15 h后停止反应，用薄层层析色谱进行分离(展开剂, 石油醚:乙酸乙酯=2:1), 收集目标带用乙酸乙酯浸泡、淋洗，减压旋除溶剂，得白色固体0.043 g，产率：80%，熔点：225~228 ℃。化合物的氢谱显示其13-OH与15-OH信号仍然存在(δ 3.94、4.35), 但增加了一个甲基的信号(δ7.48~8.21)。质谱显示化合物分子量比中乌头碱多了一个甲酰基的分子量(43), 因此可以推断该化合物为中乌头碱的3-甲酰基衍生物(g). MS(m/z): 674.3[M+H]⁺。

中乌头碱3-位邻氟苯甲酰化产物（化合物h）

称取中乌头碱(0.05 g, 0.079 mmol) 于 25mL的三口瓶中，用4.0mL的三氯甲烷溶解，再加入吡啶 (6.2 mg, 0.079 mmol)。控制温度在5℃左右，5分钟后加入用2mL三氯甲烷溶解的邻氟苯甲酰氯(12.4 mg, 0.79 mmol), 并将反应在室温下搅拌反应，同时TLC板跟踪反应，反应15 h后结束，用薄层层析色谱进行分离(展开剂, 石油醚:乙酸乙酯=2:1), 收集目标带用乙酸乙酯浸泡、淋洗，减压旋除溶剂，得白色固体0.32 g，产率：55%，熔点：225~228℃，化合物的氢谱显示其13-OH与15-OH信号仍然存在(δ 3.94、4.34), 但增加了苯环氢的信号。质谱显示化合物分子量比中乌头碱多了一个氟苯甲酰基的分子量(123), 因此推断该化合物可能为3-酰基衍生物(h). MS(m/z): 754.3[M+H]^+ 1。

实施例三：MV活体治疗作用测试

采用Gooding方法，选取接种3周以上，TMV系统侵染寄主Nicotiana glutinosa L.植株上部叶片，在磷酸缓冲液中匀浆，双层纱布过滤，1000 rpm离心，经2次聚乙二醇处理，再离心，沉淀用磷酸缓冲液悬浮，即得到TMV的粗提液。整个试验在4 °C下进行。用紫外分光光度计测定260 nm波长的吸光度值，根据公式计算病毒浓度。

病毒浓度(mg/mL)= (A₂₆₀×稀释倍数) ∕ E^0.1% _1 cm ^260 nm

其中E表示消光系数，即波长260 nm时，浓度为0.1 % (1 mg/m1) 的悬浮液，在光程为l cm时的光吸收(光密度)值。TMV的E^0.1% _1 cm ^260 nm是3.1。

宁南霉素、供试药剂浓度均为500 μg/mL。

TMV的活体治疗作用

选长势一致的心叶烟，先用毛笔蘸取病毒汁液，全叶接种病毒，接种后用清水冲洗。待叶片干后，在左半叶涂施药剂，右半叶涂施对应剂量的溶剂作对照。随后在光照培养箱中保湿培养，控制温度23±1 °C，光照10000 Lux，3~4 d后观察并记录产生枯斑的数目。每药剂处理设3株，每株3~4片叶。按上述方法每药剂进行3次重复。

当空白对照的半叶上呈现明显枯斑，约在实验3~4 d后就可调查，分别记录每片叶的左右半叶的枯斑数，按下列计算出供试化合物对烟草花叶病毒的抑制率，即相对效果。

表示方法: Y=(C-A) ∕ C ×100 %

其中：Y 为化合物对对烟草花叶病毒的抑制率；C为对照组 (右半叶) 枯斑数，单位：个；A为对照组 (左半叶) 枯斑数，单位：个。

每个处理都是用另一半作为对照，再设置一组宁南霉素的处理作参照。

按照以上方法测定，部分目标化合物的抑制活性见表1。

由表1结果知，在测试浓度下，目标化合物对烟草花叶病毒病都具有一定的抑制效果，除化合物b和f的抑制率为17.4%和32.4%外，其他化合物的抑制率都高于40%，化合物h在500 μg/mL下抗TMV 的活性为47.4%，与对照宁南霉素相当。

结论

1 、二萜生物碱用于防治作物烟草花叶病，结构新颖，农药市面上没有二萜生物碱类化合物类化合物，因此，不会和现有农药产生交互抗性。

2、二萜生物碱用于防治作物细菌病害，可以制备成多种制剂，易于转化为实际应用。

Claims

1.式(I)所示的二萜生物碱类化合物及制剂用于防治或抑制作物病毒病害的用途，

式(I)

式(I)中：

R₁选自氢、甲基、乙基；

R₃选自氢、羟基、甲氧基、乙氧基、甲酰基、乙酰基、邻氟苯甲酰；

R₄选自氢、羟基、甲氧基、乙氧基、甲酰基、乙酰基；

R₅选自氢、羟基、甲氧基、乙氧基、甲酰基、乙酰基。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的取代苯甲酰基选自邻氟苯甲酰基、间氟苯甲酰基、对氟苯甲酰基、邻氯苯甲酰基、间氯苯甲酰基、对氯苯甲酰基、2,3-二氟苯甲酰基、3,4-二氟苯甲酰基、2,3-二氯苯甲酰基、3,4-二氯苯甲酰基。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，式(I)所示的二萜生物碱类化合物中，

当R₁=CH₃, R₂=OH, R₃=H, R₄=(S)OH, R₅=(S)OCH₃时，为次乌头碱(Hypaconitine)；

当R₁=CH₃, R₂=OH, R₃=H, R₄=(S)OH, R₅=(S)OCH₃时，为中乌头碱(Mesaconitine);

当R₁=CH₂CH₃, R₂=H, R₃=H, R₄=(S)OH, R₅=(S)OCH₃时，为乌头碱(Aconitine);

当R₁=CH₃, R₂=OH, R₃=(S)OH, R₄=(S)OH, R₅=(S)OCH₃时，为附子灵(Fuziline)；

当R₁=CH₃, R₂=OH, R₃=(S)OH, R₄=H, R₅=H时，为牛扁碱 (Lycoctonine);

化合物g, 中乌头碱3-位乙酰化产物;

化合物h,中乌头碱3-位邻氟苯甲酰化产物。

4.权利要求1至3之一所述的用途，其中，所述二萜生物碱类化合物用于防治或抑制作物病毒病害。

5.权利要求4所述的用途，其中，所述二萜生物碱类化合物用于防治或抑制烟草花叶病毒病害、黄瓜花叶病毒病害、水稻条纹叶枯病毒病害、水稻矮缩病毒病害、玉米粗缩病毒病害、水稻黑条矮缩病毒病害、番茄病毒病毒病害。

6.用于防治作物病毒病害或抑制植物病毒病害的制剂，其特征在于，所述制剂含有所述的二萜生物碱类化合物，并且所述制剂的剂型为乳油、微乳、水乳、悬浮剂、种衣剂、拌种剂、可湿性粉剂、缓释颗粒剂、控释颗粒剂、水分散粒剂、干悬浮剂或其他颗粒剂。

7.根据权利要求6所述的制剂，其特征在于，所述制剂的剂型中，有效成分二萜生物碱类化合物占制剂总重量的1%~90%，更具体的含量是10%~85%。

8.权利要求1至3之一所述的二萜生物碱类化合物用于处理病毒、病毒栖息地或需防治病毒侵袭的材料、植物、区域、土壤、种子或空间的用途。