CN105296566A - 一种制备可皆霉素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备可皆霉素的方法，将狭旋毛壳菌种活化后制备种子液，将种子液发酵培养，将发酵培养得到的菌体用乙酸乙酯提取，得到乙酸乙酯提取物，再将乙酸乙酯提取物分离后得到可皆霉素。本发明以球壳科毛壳属狭旋毛壳为原料进行可皆霉素的提取分离，方法简单，成本低，具有可持续性，分离得到可皆霉素单体，提取分离过程中用到的溶剂可回收利用，提取量大，可工业化生产。

Description

一种制备可皆霉素的方法
技术领域
本发明属于可皆霉素生产技术领域，具体涉及一种制备可皆霉素的方法。
背景技术
可皆霉素为苯醌类化合物，分子式为C32H30N2O4；分子量：506.22；CAS登录号：11051-88-0，结构式为
。
到目前为止，可皆霉素仅在毛壳属（Chaetomiumglobosum,C.cochliodes）中分离得到。Brewerr的科研团队发现，在1-10μg/ml时，可皆霉素抑制多属真菌的生长，并能抑制真菌Botrytisallii和Fusarirmmoniliforme孢子的萌发，可皆霉素相对稳定，成盐后，稳定性上升，其形成三乙胺盐后，水溶性显著增加，且溶解后能显著抑制多种微生物质的生长（BrewerD,JerramWA,MeilerD,etal.Thetoxicityofcochliodinol,anantibioticmetaboliteofChaetomiumspp.[J].CanadianJournalofmicrobiology,1970,16:433-440.）。同时发现可皆霉素在低浓度时，能够抑制多种镰刀菌的生长（BrewerD,TaylorA.Theeffectofcochliodinol,ametaboliteofChaetomiumcochliodes,ontherespirationofmicrosporesofFusarizimoxysporum[J].CanadianJournalofmicrobiology,1971,17:83-86.），而镰刀菌可侵染多种植物(粮食作物、经济作物、药用植物及观赏植物)，引起植物多种病害，造成作物大量死亡，是生产上防治最具挑战性的的病害之一，由此可见，其在植物病害防治方面的潜在应用价值非常大。Casellada等研究发现可皆霉素具有显著细胞毒性，可以抑制人口腔上皮癌细胞KB和乳腺癌细胞MDA-MB-435的增殖，IC50分别为0.53μM、2.20μM，（CasellaTM,EparvierV,Mandavid,etal.Antimicrobialandcytotoxicsecondarymetabolitesfromtropicalleafendophytes:IsolationofantibacterialagentpyrrocidineCfromLewiainfectoriaSNB-GTC2402[J].Phytochemistry,201396:370-377）。
可皆霉素具有以上诸多生物活性，但是由于提取工艺的限制，产品含量低，而且合成成本高，无法进行更深入研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种原料成本较低、工艺简单、纯度高的提取可皆霉素的方法。
本实现上述目的，本发明采用的技术方案是，一种制备可皆霉素的方法，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将狭旋毛壳菌种接种到平板培养基上，25℃恒温培养72小时，获得活化菌种；
（2）制备种子液：将步骤（1）中得到的活化菌种接种到装有无菌培养液A的无菌三角瓶中，转速为150rpm，温度为25℃条件下震荡培养72小时，获得种子液；培养液A的配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH6.0±0.1；
（3）发酵培养：将步骤（2）制备的种子液与培养液B按照体积比为5：100接入到无菌三角瓶中，转速为150rpm，温度为25℃条件下震荡培养7d，获得发酵液；培养液B的配方为：葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉10g/L，pH6.0±0.1；
（4）乙酸乙酯提取物的制备：将步骤（3）制备的发酵液用医用纱布过滤，得到狭旋毛壳菌体，将狭旋毛壳菌体用乙酸乙酯提取，得到乙酸乙酯提取液，31~33℃下减压除去乙酸乙酯后得到乙酸乙酯提取物；
（5）可皆霉素的制备：将步骤（4）制备的乙酸乙酯提取物用80～100目硅胶拌样后装柱，固定相为200~300目硅胶，以二氯甲烷－甲醇梯度洗脱，硅胶薄层层析检测，合并二氯甲烷-甲醇的体积比为100：（2~4）的流份，31~33℃下减压除去二氯甲烷和甲醇，得可皆霉素。
所述步骤（1）中平板培养基配方为：酵母膏10g/L，葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，琼脂粉20g/L，pH6.0±0.1。
所述步骤（4）中将将狭旋毛壳菌体用乙酸乙酯提取时，用乙酸乙酯提取3次，每次提取时20~25℃冷浸10小时，每次提取时狭旋毛壳菌体与乙酸乙酯的固液比为1g︰30ml。
所述步骤（5）中将乙酸乙酯提取物与硅胶拌样时，乙酸乙酯提取物与80～100目硅胶的重量比为1︰2。
本发明产生的有益效果是：本发明以球壳科毛壳属狭旋毛壳为原料进行可皆霉素的提取，提取方法简单，成本低，具有可持续性，提取得到可皆霉素单体，提取过程中用到的溶剂可回收利用，提取量大，可工业化生产。
具体实施方式
实施例1
本实施列的制备可皆霉素的方法包括以下步骤：
（1）菌种活化
将狭旋毛壳菌种（来自于美国模式培养物集存库，菌种编号：ATCCNO.56725）接种到平板培养基上，25℃恒温培养72小时，获得活化菌种；平板培养基配方为：酵母膏10g/L，葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，琼脂粉20g/L，pH6.0±0.1；
（2）制备种子液：将步骤（1）中得到的活化菌种接种到装有无菌培养液A的无菌三角瓶中，转速为150rpm，温度为25℃条件下震荡培养72小时，获得种子液；培养液A的配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH6.0±0.1；
（3）发酵培养：将步骤（2）制备的种子液与培养液B按照体积比为5：100接入到无菌三角瓶中，转速为150rpm，温度为25℃条件下震荡培养7d，获得发酵液；培养液B的配方为：葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉10g/L，pH6.0±0.1；
（4）乙酸乙酯提取物的制备：将步骤3制备的发酵液用医用纱布过滤，得到狭旋毛壳菌体，将菌体用乙酸乙酯提取3次（每次23℃下冷浸10小时，每次提取时狭旋毛壳菌体与乙酸乙酯的固液比为1g︰30ml），得到乙酸乙酯提取液，通过旋转蒸发仪31~33℃下减压除去乙酸乙酯后得到乙酸乙酯提取物；
（5）可皆霉素的制备：将步骤4制备的乙酸乙酯提取物用80～100目硅胶拌样后装柱，固定相为200~300目硅胶，乙酸乙酯提取物与80～100目硅胶的重量比为1:2，以二氯甲烷－甲醇梯度洗脱(二氯甲烷－甲醇体积比为100:0；100:1；100:2；100:4；100:8)，以硅胶薄层层析，紫外254nm检测，合并二氯甲烷-甲醇的体积比为100：2和100:4的流份，旋转蒸发仪31~33℃下减压除去二氯甲烷和甲醇，得可皆霉素（纯度为98.76%）。
采用本实施例的方法所提取到的可皆霉素的结构鉴定如下：
【性状】紫色粉末
【鉴定】分子式：C32H30N2O4,分子量：506.2206
仪器设备：Agilent1100液相色谱仪,1H,13CNMR图谱由Brukeram-400MHz核磁共振仪测定(TMS为内标),质谱由Agilent6490型质谱仪测定。
利用ESI-MS，1HNMR和13CNMR试验，标准数据如下：ESI-MSm/z:505.2124[M-H]+;1HNMR(CDCl3,400MHz)δ:8.41(1H,s,2,5-OH),8.13(1H,s,1-NH),7.60(1H,s,H-2),7.44(1H,s,H-4),7.34(1H,d,J=8.4,H-7),7.08(1H,d,J=8.4,H-6),5.40(1H,m,H-11),3.46(1H,m,H-10),1.75(3H,s,13-CH3),1.74(1H,s,14-CH3);13CNMR(CDCl3,100MHz)δ:134.4(C-8),133.9(C-5),131.7(C-12),127.2(C-2),126.3(C-9),124.5(C-11),123.6(C-6),120.9(C-4),111.1(C-7),110.8(C-3,C-6),104.4(C-3),34.7(C-10),25.8(C-14),17.9(C-13).
【检查】利用TLC，在UV254nm呈强荧光；以硫酸显色剂，110℃下20秒钟，呈现棕色。
【含量测定】利用HPLC，色谱条件：SepaxGP-C185μm（250mm×4.6mm）色谱柱。流动相：乙腈︰水︰甲酸为10︰90︰0.1；流速：1.25mL/min，检测波长254nm，保留时间值9.46min。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明,而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (4)

1.一种制备可皆霉素的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）菌种活化：将狭旋毛壳菌种接种到平板培养基上，25℃恒温培养72小时，获得活化菌种；
（2）制备种子液：将步骤（1）中得到的活化菌种接种到装有无菌培养液A的无菌三角瓶中，转速为150rpm，温度为25℃条件下震荡培养72小时，获得种子液；培养液A的配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH6.0±0.1；
（3）发酵培养：将步骤（2）制备的种子液与培养液B按照体积比为5：100接入到无菌三角瓶中，转速为150rpm，温度为25℃条件下震荡培养7d，获得发酵液；培养液B的配方为：葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉10g/L，pH6.0±0.1；
（4）乙酸乙酯提取物的制备：将步骤（3）制备的发酵液用医用纱布过滤，得到狭旋毛壳菌体，将狭旋毛壳菌体用乙酸乙酯提取，得到乙酸乙酯提取液，31~33℃下减压除去乙酸乙酯后得到乙酸乙酯提取物；
（5）可皆霉素的制备：将步骤（4）制备的乙酸乙酯提取物用80～100目硅胶拌样后装柱，固定相为200~300目硅胶，以二氯甲烷－甲醇梯度洗脱，硅胶薄层层析检测，合并二氯甲烷-甲醇的体积比为100：（2~4）的流份，31~33℃下减压除去二氯甲烷和甲醇，得可皆霉素。
2.如权利要求1所述的制备可皆霉素的方法，其特征在于：所述步骤（1）中平板培养基配方为：酵母膏10g/L，葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，琼脂粉20g/L，pH6.0±0.1。
3.如权利要求1中所述的制备可皆霉素的方法，其特征在于：所述步骤（4）中将狭旋毛壳菌体用乙酸乙酯提取时，用乙酸乙酯提取3次，每次提取时于20~25℃冷浸10小时，每次提取时狭旋毛壳菌体与乙酸乙酯的固液比为1g︰30ml。
4.如权利要求1中所述的制备可皆霉素的方法，其特征在于：所述步骤（5）中将乙酸乙酯提取物与80～100目硅胶拌样时，乙酸乙酯提取物与80～100目硅胶的重量比为1︰2。
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