CN103012339B

CN103012339B - 一种橙酮类化合物及其制备方法和应用

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Publication number: CN103012339B
Application number: CN201310007482.9A
Authority: CN
Inventors: 陈永宽; 韩熠; 孔维松; 陈进雄; 杨光宇; 缪明明
Original assignee: Yunnan Academy of Tobacco Science
Current assignee: Yunnan Academy of Tobacco Science
Priority date: 2013-01-09
Filing date: 2013-01-09
Publication date: 2014-06-04
Anticipated expiration: 2033-01-09
Also published as: CN103012339A

Abstract

本发明公开了一种橙酮类化合物及其制备方法和应用，所述的橙酮类化合物是从香料烟中提取出来的，其4′位为乙酰基，结构式为：命名为：4′-乙酰基-5-羟基-6-甲氧基橙酮。所述的橙酮类化合物制备方法包括原料处理、超声提取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离、凝胶柱层析。所述的橙酮类化合物在制备抗白血病细胞和/或人乳腺癌细胞药物中的应用。发明的橙酮类化合物是首次从香料烟中分离出来，能够确认其分子式和结构。本发明以乙醇为溶剂，对环境污染小、安全环保；化合物结构简单，人工合成也易于实现。该化合物对白血病细胞（NB4）和人乳腺癌细胞（MCF7）有明显的抑制作用，IC₅₀值分别为2.6μM和1.8μM，说明该橙酮类化合物可以作为抗癌药物的先导化合物。

Description

一种橙酮类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于植物有效成分提取技术领域，具体涉及一种橙酮类化合物及其制备方法和应用。

背景技术

烟草是人类所认识的各种植物中含化学物质最多的一种，经过几十年的研究，人们目前从烟草中鉴定出来的单体化学物质就超过3000多种，而且还有许多成分尚未鉴定出来。香料烟又称土耳其烟、东方型烟，原产于地中海沿岸国家，是红花烟草（Nicotianatobacum）的一种特殊烟草类型。由于香料烟具有浓郁芳香和纯净吃味的品质特点，在烟草制品中有着特殊的应用价值，是生产混合型、外香型和东方型卷烟及斗烟丝的重要原料之一。尤其是混合型卷烟具有劲足、味浓、用料广泛、可有效降低焦油含量从而减轻吸烟对人体健康的危害特点，深受吸烟者的青睐，成为当今世界流行的卷烟类型。目前，香料烟在云南保山地区有大面积种植。香料烟中黄酮类化合物的含量很丰富，黄酮是一类自然界中广泛存在的生物活性物质，由于植物黄酮成分结构类型多，立体化学复杂，具有多种生物活性，国内外对该领域的研究十分活跃；橙酮属于稀有黄酮类化合物，由于其显著的生物活性，无论是天然存在的，还是人工合成得到的橙酮类化合物，都引起了化学家的广泛关注。因此，深入开发香料烟中有利用价值的化学成分作为先导性化合物，如黄酮类化合物，尤其是橙酮，这样除了作为卷烟消费外，烟草的社会价值会得到更大提升，更具深远意义。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种橙酮类化合物，第二目的在于提供该化合物的制备方法，第三目的在于提供该化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的橙酮类化合物是从香料烟中提取出来的，其4′位为乙酰基，结构式为：

橙酮类化合物的命名为：4′-乙酰基-5-羟基-6-甲氧基橙酮（4′- acetyl-5-hydroxy-6- methoxyaurone）。

本发明的第二目的是这样实现的，所述的橙酮类化合物制备方法包括原料处理、超声提取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离、凝胶柱层析，具体为：

A、原料处理：取香料烟全株，粗粉碎20~40目；

B、超声提取：以85~95%的乙醇为溶剂，超声提取3~5次，每次30~60min，每次乙醇用量为4~6L，将提取液合并、过滤，减压浓缩成浸膏；

C、硅胶柱层析：将浸膏用重量比1~2倍量的丙酮溶解，用80-100目的硅胶拌样后上硅胶柱，以体积配比为20:1~10:10的氯仿-乙醇溶液梯度洗涤，分别收集各部分的洗脱液并浓缩，用TLC监测合并相同的部分；

D、高压液相色谱分离：取体积配比9:1部分的洗脱液，以45~55%的乙醇为流动相，以规格为20 mm×250 mm、5 μm的C₁₈制备柱为固定相，流速为15ml/min，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样200μL，收集18.6 min的色谱峰，多次累加后蒸干，得到产物a；

E、凝胶柱层析：产物a用重量比1~2倍量的纯乙醇溶解后上Sephadex LH-20凝胶柱，以纯乙醇溶液洗脱，分瓶收集，洗脱液的0.8-0.9 L部分浓缩产物即为所述的橙酮类化合物。

本发明的第三目的是这样实现的，所述的橙酮类化合物在制备抗白血病细胞和/或人乳腺癌细胞药物中的应用。

本发明的橙酮类化合物是首次从香料烟中被分离出来，采用核磁共振、质谱、红外光谱、紫外光谱等波普数据确认了其分子式和结构。本发明的橙酮类化合物制备方法简单易行，以乙醇为溶剂，对环境污染小、安全环保；化合物结构简单，人工合成也易于实现。该化合物进行抗肿瘤活性筛选，发现对白血病细胞（NB4）和人乳腺癌细胞（MCF7）有明显的抑制作用，IC₅₀值分别为2.6μM和1.8μM，说明该橙酮类化合物可以作为抗癌药物的先导化合物，对于开发抗肿瘤药物是十分有意义的。

附图说明

图1为本发明的制备方法工艺流程图；

图2为本发明化合物的核磁共振氢谱（¹H NMR）图；

图3为本发明化合物的核磁共振碳谱（¹³C NMR）图；

图4为本发明化合物的主要HMBC相关图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。

本发明所述的橙酮类化合物是从香料烟中提取出来的，其4′位为乙酰基，结构式为：

该橙酮类化合物的命名为：4′-乙酰基-5-羟基-6-甲氧基橙酮。

本发明所述的橙酮类化合物制备方法包括原料处理、超声提取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离、凝胶柱层析，具体为：

A、原料处理：取香料烟全株，粗粉碎20~40目；

C、硅胶柱层析：将浸膏用重量比1~2倍量的丙酮溶解溶解后上硅胶柱，以体积配比为20:1~10:10的氯仿-乙醇溶液梯度洗涤，分别收集各部分的洗脱液并浓缩，用TLC监测合并相同的部分；

E、凝胶柱层析：产物a用重量比1~2倍量的纯乙醇溶解后上Sephadex LH-20凝胶柱，凝胶柱层析：产物a用重量比1~2倍量的纯乙醇溶解后上Sephadex LH-20凝胶柱，以纯乙醇溶液洗脱，分瓶收集，洗脱液的0.8-0.9 L部分浓缩产物即为所述的橙酮类化合物。

所述的纯乙醇作为洗脱剂，分瓶收集，如以每瓶100 mL算，那么发明化合物在第8到第9瓶中，即流出液的0.8~0.9 L。

B步骤所述的超声提取以90%的乙醇为溶剂，提取4次，每次45min，每次乙醇用量为5L。

C步骤所述的浸膏用其重量1.5倍的丙酮溶解。

C步骤所述的浸膏被丙酮溶解后用浸膏重量1~2倍量80~100目粗硅胶拌样。

C步骤所述的硅胶柱用浸膏重量3-10倍量200～300目的硅胶装柱。

C步骤所述的氯仿-乙醇体积配比为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5。

D步骤所述的流动相为50%的乙醇。

E步骤所述的产物a用重量比1.5倍的纯乙醇溶解。

本发明所述的橙酮类化合物在制备抗白血病细胞和/或人乳腺癌细胞药物中的应用。

本发明的橙酮类化合物是首次从香料烟中被分离出来，采用核磁共振、质谱、红外光谱、紫外光谱等波普数据确认了其分子式和结构。本发明的橙酮类化合物制备方法简单易行，以乙醇为溶剂，对环境污染小、安全环保；化合物结构简单，人工合成也易于实现。

本发明烟草所用原料不受地区和品种限制，均可以实现本发明，下面以来源于云南保山的香料烟样品对本发明做进一步说明：

实施例1

香料烟样品采自于云南保山地区，品种为巴斯马；将香料烟样品全株2.5kg粉碎至20目。将粉碎后的样品置于85%乙醇中超声提取3次，每次30min，每次乙醇用量为4L，将提取液合并、过滤，减压浓缩得到浸膏126 g。在浸膏中加入300 mL，溶解后用300 g的80目粗硅胶拌样，然后上硅胶柱，硅胶柱中装入800 g 的200目硅胶；以体积配比为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的氯仿-乙醇混合溶剂梯度洗涤，分别收集各部分的洗脱液并浓缩，用TLC监测合并相同的部分。取体积配比9:1部分的洗脱液，以45%的乙醇为流动相，以规格为20mm×250mm、5μm的C₁₈制备柱为固定相，流速为15ml/min，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样200μL，收集18.6min的色谱峰，多次累加后蒸干，得到本发明化合物的粗品0.46 g。在产物a中加入1 mL 纯乙醇，溶解后上Sephadex LH-20凝胶柱，以乙醇溶液洗脱，分别收集洗脱流出液的0.8-0.9 L部分浓缩即得和发明化合物纯品0.36 g。

实施例2

香料烟样品采自于云南保山地区，品种为巴斯马；将香料烟样品全株3.5 kg粉碎至40目。将粉碎后的样品置于95%乙醇中超声提取5次，每次60min，每次乙醇用量为6L，将提取液合并、过滤，减压浓缩得到浸膏222 g。在浸膏中加入400 mL的乙醇，溶解后用400 g的100目粗硅胶拌样，然后上硅胶柱，硅胶柱中装入1200 g 的300目硅胶；以体积配比为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的氯仿-乙醇混合溶剂梯度洗涤，分别收集各部分的洗脱液并浓缩，用TLC监测合并相同的部分。取体积配比9:1部分的洗脱液，以55%的乙醇为流动相，以规格为20 mm×250 mm、5 μm的C₁₈制备柱为固定相，流速为15ml/min，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样200μL，收集18.6 min的色谱峰，多次累加后蒸干，得到产物0.55 g。在产物a中加入1.5 mL 纯乙醇，溶解后上Sephadex LH-20凝胶柱，以乙醇溶液洗脱，分别收集洗脱流出液的1.1-1.2 L部分浓缩即得和发明化合物纯品0.47 g。

实施例3

香料烟样品采自于云南保山地区，品种为巴斯马；将香料烟样品全株2.5~3.5 kg粉碎至30目。将粉碎后的样品置于90%乙醇中超声提取4次，每次40min，每次乙醇用量为5L，将提取液合并、过滤，减压浓缩得到浸膏147 g。在浸膏中加入250 mL，溶解后用260 g的90目粗硅胶拌样，然后上硅胶柱，硅胶柱中装入800 g 的250目硅胶；以体积配比为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的氯仿-乙醇混合溶剂梯度洗涤，分别收集各部分的洗脱液并浓缩，用TLC监测合并相同的部分。取体积配比9:1部分的洗脱液，以50%的乙醇为流动相，以规格为20mm×250mm、5μm的C₁₈制备柱为固定相，流速为15ml/min，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样200μL，收集18.6min的色谱峰，多次累加后蒸干，得到产物0.35 g。在产物a中加入1.5 mL 纯乙醇，溶解后上Sephadex LH-20凝胶柱，以乙醇溶液洗脱，分别收集洗脱流出液的0.9 -1.0 L部分浓缩即得和发明化合物纯品0.32 g。

实施例4

取实施例3制备的化合物进行质谱、红外光谱、紫外光谱分析和核磁检测，结果为：该化合物为黄色胶状物。由高分辨质谱（HR-ESI-MS）的分子离子碎片，m/z 309.0756 [M-H]^-确定其分子式为C₁₈H₁₄O₅（计算值 309.0763）。化合物的¹H和¹³C NMR数据（见表1）显示化合物中有18个碳信号和14个氢信号，包括一个橙酮母核（δ _C 147.8 s, 180.5 s, 114.6 d, 141.1 s, 150.0 s, 103.3 d, 159.9 s, 117.2 s, 110.9 d, 133.0 s, 132.4 d （2C）, 122.6 d （2C）, 137.2 s），1个甲氧基信号（δ _C 55.8,δ _H 3.80），1个酚羟基信号（δ _H 10.82），以及1个乙酰基信号（δ _C 199.3 s, 28.4 q;δ _H 2.54）。红外光谱显示有羟基（3420 cm^-1）、羰基（1688, 1665 cm^-1）和芳环（1638, 1592, 1497, 1442 cm^-1）的吸收峰。紫外光谱在352、264和210nm 处有吸收峰也证实有芳环存在。化合物中存在 H-10（δ _H 6.81）和C-2（δ _C 147.8）、C-3（δ _C 180.5）、C-1′（δ _C 133.0）、C-2′（δ _C 132.4），H-2′（δ _H 7.79）和C-10（δ _C 110.9），以及H-4（δ _H 7.34）和C-3（δ _C 180.5）的HMBC相关也证实化合物为橙酮类结构。核磁共振氢谱中4个偶合的氢信号δ_H 7.79（d, J=8.8 Hz, 2H）、8.12（d, J=8.8, 2H），证实化合物中C环为4′-取代；2个单峰 δ_H 7.34（s, 1H）和δ_H 6.60（s, 1H）信号可推测化合物的B-环为C-5/C-6 取代。酚羟基信号δ_H 10.82和C-4（δ_C 114.6）、C-5 （δ_C 141.1）、C-6（δ_C 150.0）的 HMBC 相关证实酚羟基取代在 C-5 位。甲氧基信号（δ_H 3.80）和C-6（δ_C 150.0）的HMBC相关证实甲氧基取代在化合物的C-6位。乙酰基取代在化合物的C-4′位也由乙酰基甲基 H-2′′（δ _H 2.54）和C-4′（δ _C 137.2）的HMBC相关，以及H-3′/5′（δ _H 8.12）和乙酰羰基C-1′′（δ _C 199.3）的HMBC相关确认。该化合物的波普数据：UV（MeOH）, l _max（log e） 352（3.28）, 264（3.80）, 210（4.07）nm; IR（KBr）n _max3420, 2908, 2876, 1688, 1665, 1638, 1592, 1497, 1442, 1267, 1145, 1073, 862, 784 cm^-1; ¹H NMR and ¹³C NMR data（C₅ND₅, 500 MHz and 125 MHz）, 表1; ESIMS（负离子模式）m/z 309 [M-H]^-; HRESIMS（负离子模式）m/z 309.0756 [M-H]^-（计算值309.0763，C₁₈H₁₄O₅）。因此化合物的结构得以确定。

表1 化合物的¹H和¹³C NMR 数据

No.	dC （m）	dH （m, J, Hz）
			2	147.8 s
3	180.5 s
			4	114.6 d	7.34, s
5	141.1 s
			6	150.0 s
7	103.3 d	6.60, s
			8	159.9 s
9	117.2 s
			10	110.9 d	6.81, s
1′	133.0 s
			2′,6′	132.4 d	7.79, d, J=8.8
3′,5′	122.6 d	8.12, d, J=8.8
			4′	137.2 s
1′′	199.3 s
			2′′	28.4 q	2.54, s
3′′
			4′′
5′′
			6′′
OMe-6	55.8 q	3.80, s
			OH-5		10.82, s

实施例5

取实施例1、2制备的橙酮类化合物按照实施例的方法进行检测，得到了相同的结构。

实施例6

以实施例3制备的橙酮类化合物为原料进行体外抗肿瘤实验用MTT法。

受试细胞株：白血病细胞株（NB4）、人肺腺癌细胞株（A549）、神经母细胞瘤细胞株（SHSY5Y）、人前列腺癌细胞株（PC3）、人乳腺癌细胞株（MCF7）。

实验方法：

1、接种细胞：用含10%胎牛血清的DMEM或RMPI1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔5000~10000个细胞接种到96孔板上，每孔体积100μl，贴壁细胞提前12h接种培养。

2、将待测化合物制备成DMSO溶液，以40μM的浓度进行初步筛查，选择在该浓度对肿瘤细胞生长抑制接近50%的，再设置5个浓度进入梯度筛查（复筛），每孔终体积为200μl，每种处理均设3个重复孔。

3、在37℃下培养48h，每孔加MTT溶液20μl，继续孵育4h后终止培养；吸弃孔内培养上清液，每孔加200μl、10%的SDS溶液，在37℃下过夜孵育，使结晶物充分溶解。

4、选择595nm波长，酶联免疫检测仪（Bio-Rad 680）读取各孔光吸收值，记录结果，以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应用两点法（Reed and Muench法）计算化合物的IC₅₀值。

结果表明：本发明化合物白血病细胞株（NB₄）和人乳腺癌细胞株（MCF₇）显示出明显的抑制活性，相应的IC₅₀值分别为2.6μM和1.8μM。

实施例7

取实施例3制备的橙酮类化合物通过小鼠骨髓微核实验、Ames实验和TK基因突变实验对其安全性评价，结果证明该化合物对动物无毒性，使用安全。

Claims

1.一种橙酮类化合物制备方法，其特征在于所述的橙酮类化合物是从香料烟中提取出来的，其4′位为乙酰基，结构式为：

该化合物的命名为：4′-乙酰基-5-羟基-6-甲氧基橙酮；其制备方法包括原料处理、超声提取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离、凝胶柱层析，具体为：

A、原料处理：取香料烟全株，粗粉碎20~40目；

2.根据权利要求1所述的橙酮类化合物制备方法，其特征在于B步骤所述的超声提取以90%的乙醇为溶剂，提取4次，每次45min，每次乙醇用量为5L。

3.根据权利要求1所述的橙酮类化合物制备方法，其特征在于C步骤所述的浸膏用其重量1.5倍的丙酮溶解。

4.根据权利要求1所述的橙酮类化合物制备方法，其特征在于C步骤所述的浸膏被丙酮溶解后用浸膏重量1~2倍量80~100目粗硅胶拌样。

5.根据权利要求1所述的橙酮类化合物制备方法，其特征在于C步骤所述的硅胶柱用浸膏重量3-10倍量200～300目的硅胶装柱。

6.根据权利要求1所述的橙酮类化合物制备方法，其特征在于C步骤所述的氯仿-乙醇体积配比为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5。

7.根据权利要求1所述的橙酮类化合物制备方法，其特征在于D步骤所述的流动相为50%的乙醇。

8.根据权利要求1所述的橙酮类化合物制备方法，其特征在于E步骤所述的产物a用重量比1.5倍的纯乙醇溶解。