CN104761526B - 一种具有抗病毒活性的异黄酮类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种如式(Ⅰ)所示的异黄酮类化合物及其制备方法和应用，式(Ⅰ)。以烟草全株为原料，以甲醇‑水、乙醇‑水或丙酮‑水的混合溶剂为提取溶剂进行提取，提取液合并，过滤，滤液减压浓缩成浸膏；浸膏用硅胶干法装柱进行硅胶柱层析；以氯仿‑丙酮的混合溶剂进行梯度洗脱；洗脱液的8:2部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得所需的异黄酮类化合物。经活性测试表明，该化合物对轮状病毒具有很好的抑制作用。本发明化合物结构简单，化合物活性好，可作为抗轮状病毒的先导性化合物。

Description

一种具有抗病毒活性的异黄酮类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于烟草化学技术领域，具体涉及一种从烟草中首次提取得到的异黄酮类化合物。同时，本发明还涉及该化合物的制备方法和应用。
背景技术
烟草是世界上化学成分最为复杂的植物，次生代谢产物非常丰富，经过几十年的研究，人们目前从烟草中鉴定出来的单体化学物质就超过3000多种，而且还有许多成分尚未鉴定出来。烟草除主要用于卷烟抽吸用途外，还可从中提取多种有利用价值的化学成分，从中发现有开发利用价值的先导性化合物。
异黄酮类化合物是一类天然植物中普遍存在的化合物，在烟草中也有存在该类化合物的文献报道，异黄酮类化合物具有广泛的药理作用，如抗肿瘤、抗人类免疫缺陷病毒(HIV)、抗氧化、抗菌、抗凝血等；同时已有研究证实，其药理作用与化学结构密切相关，可进一步研究和开发更多的异黄酮类化合物，从中寻找有效的先导化合物和活性基团。本发明从烟草中分离得到了一种具有抗轮状病毒活性的异黄酮类化合物，该化合物至今尚未见到相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的异黄酮类化合物。
本发明的另一个目的是提供一种制备所述异黄酮类化合物的方法。
本发明的目的还在于提供所述异黄酮类化合物在制备抗轮状病毒的药物中的应用。
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
本发明从烟草中分离出一种新的异黄酮类化合物，其分子式为C18H16O6，具有如式(Ⅰ)所示的结构式：
式(Ⅰ)。
该化合物命名为4',7-二甲氧基-8-羟甲基-6-羟基-异黄酮，英文名称为：4′,7-dimethoxy-8-hydroxymethyl-6-hydroxyisoflavone，为黄色胶状物。
制备所述异黄酮类化合物的方法，该方法包括以下步骤：
步骤(1)，浸膏提取：取烟草样品全株，将烟草粉碎或切成小段，用高浓度甲醇(w％：70％～95％)、高浓度乙醇(w％：70％～95％)或高浓度丙酮(w％：60％～95％)为提取溶剂，每次提取将烟草粉末或小段浸泡在提取溶剂中24h～72h，提取3～5次，每次提取溶剂的用量与烟草的重量比＝2～4:1，合并提取液，过滤，滤液浓缩成浸膏；
步骤(2)，硅胶柱层析：将步骤(1)得到的浸膏用重量是浸膏1～3倍的50～150目硅胶拌样，用重量是浸膏2～8倍量的100-400目硅胶干法装柱，然后上样，进行硅胶柱层析；以体积配比依次为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2的氯仿-丙酮的混合溶剂作为洗脱剂进行梯度洗脱，薄层层析法跟踪，合并相同的部分，收集各部分洗脱液并浓缩；每个比例的溶剂洗脱时，洗脱到没有成分洗下为止，然后换下一个比例的溶剂；
步骤(3)，高压液相色谱分离纯化：柱层析洗脱液的8:2部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得所述的异黄酮类化合物。
上述技术方案中，高压液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的C18色谱柱，流速为20mL/min，流动相为质量百分浓度为48％的甲醇，紫外检测器检测波长为350nm，每次进样200μL，收集27.2min的色谱峰，多次累加后蒸干。
上述技术方案中，进一步优选的是所述的浸膏在经硅胶柱层析分离前，采用干法上样，具体方法为：用重量是浸膏的1.5～3倍量的纯甲醇、纯乙醇或纯丙酮溶解后，用重量是浸膏的0.8～1.2倍的80～100目硅胶拌样，然后上样。
经所述高效液相色谱分离纯化后，一个优选的后续处理方案为，所得化合物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化。
以上述方法制备得到的异黄酮类化合物的结构通过以下方法进行测定。本发明化合物为黄色胶状物；紫外光谱(溶剂为甲醇),λmax(log ε)350(3.60)、308(3.28)、250(3.91)、210(4.32)nm；红外光谱(溴化钾压片)νmax 3397、1654、1608、1554、1508、1416、1367、1135、1050、931、846cm-1；高分辨质谱(HRESIMS)给出准分子离子峰m/z 351.0849[M+Na]+(计算值351.0845)。结合图1和图2所示的1H NMR和13C NMR谱图数据，给出一个分子式C18H16O6，不饱和度为11。从1H和13C NMR谱结合二维相关(数据归属见表1)信号可以看出该化合物为异黄酮类化合物，化合物中有一个1,4-二取代的苯环、一个五取代苯环、一个氧化亚甲基、二个甲氧基、一个酚羟基、一个羰基、一组双键。其中两个苯(C-5～C-10和C-1′～C-6′)、羰基(C-4)和双键(C-2和C-3)构成了异黄酮的骨架；根据H-2和C-3、C-4、C-1'、C-9，H-2'，6'和C-3的HMBC相关(图3)可进一步证实化合物为异黄酮结构。母体骨架确定，剩余的一个氧化亚甲基、二个甲氧基、一个酚羟基则为取代基。根据两个甲氧基氢信号分别和C-4'和C-7有HMBC相关，可证实两个甲氧基分别取代在C-4'和C-7位；根据H-2”和C-7、C-8和C-9有HMBC相关，则可推测羟甲基取代在C-8位；酚羟基取代在C-6位可从酚羟基信号和C-5、C-6和C-7的HMBC相关得到确认。至此本化合物的结构得以确定。
表1.化合物的1H NMR和13C NMR数据(C5D5N)
No. δC δH(m,J,Hz) No. δC δH(m,J,Hz)
2 151.6d 7.95s 1′ 124.8s
3 124.5s 2′,6′ 130.9d 7.71(d)8.6
4 176.5s 3′,5′ 115.9d 6.84(d)8.8
5 117.1d 7.35s 4′ 161.2s
6 141.5s 1″ 52.0t 4.49s
7 156.5s -OMe-7 61.1q 3.85s
8 124.4s -OMe-4′ 56.0q 3.81s
9 148.2s Ar-OH-6 11.17s
10 118.4s
将上述的异黄酮类化合物应用于制备抗轮状病毒的药物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明化合物是首次被分离出来的，通过上述核磁共振和质谱测定方法确定了为异黄酮类化合物，并表征了其具体结构。经对抗轮状病毒的实验，其TC50值为226.5μg/mL、IC50值为8.94μg/mL，治疗指数TI为25.34；其治疗指数超过对照病毒唑的治疗指数18.90；化合物具有很好的抗轮状病毒活性。以上结果揭示了本发明的化合物在制备抗轮状病毒药物中有良好的应用前景。本发明化合物结构简单活性较好，可作为抗轮状病毒药物研发的先导性化合物用于抗轮状病毒药物制剂研发。
附图说明
图1为本发明异黄酮类化合物的核磁共振碳谱；
图2为本发明异黄酮类化合物的核磁共振氢谱；
图3为本发明异黄酮类化合物的主要1H-1H COSY和HMBC相关。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明中的溶液如果只给出了溶质，没有公开溶剂，则本领域技术人员应该知晓溶剂为水。
实施例1
制备异黄酮类化合物C18H16O6，包括浸膏提取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离，具体采用以下步骤：
1.浸膏提取：取烟草样品全株，烟草可以粉碎或切成小段，用质量百分浓度为70％～95％的甲醇或乙醇，或质量百分浓度为60％～95％的丙酮为任意一种提取溶剂，每次提取将烟草粉末或小段浸泡在提取溶剂中54h，提取3次，每次提取溶剂的用量与烟草的重量比＝2.5:1，合并提取液，过滤，滤液浓缩成浸膏；
2.硅胶柱层析：浸膏用重量是其2.5倍量的纯甲醇、纯乙醇或纯丙酮溶解后，用重量是浸膏1.2倍的80～100目硅胶拌样，再用重量是浸膏3倍量的250目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析；以体积配比为(1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2)的氯仿-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每个比例的溶剂洗脱时，洗脱到没有成分洗下为止，然后换下一个比例的溶剂，合并相同的部分，收集各部分洗脱液并浓缩。
3.高压液相色谱分离：柱层析洗脱液的8:2部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得所述的异黄酮类化合物，高压液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的C18色谱柱，流速为20mL/min，流动相为48％的甲醇，紫外检测器检测波长为350nm，每次进样200μL，收集27.2min的色谱峰，多次累加后蒸干。
高压液相色谱法分离纯化后的物质，一个优选的后处理方案为，所得化合物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化。
本发明所用原料不受地区和品种限制，均可以实现本发明，下面以来源于云南中烟工业有限责任公司不同产地的烟草原料，对本发明做进一步说明：
实施例2
烟草样品来源于云南玉溪，品种为玉溪K326。将烟草取样2.0kg粉碎以质量百分浓度为95％的甲醇提取5次，每次提取24h，每次质量百分浓度为95％的甲醇的用量与烟草的重量比＝2:1，提取液合并，过滤，滤液减压浓缩成浸膏，得浸膏100g。
浸膏用重量是其2.0倍量的纯甲醇溶解后，用120g的100目粗硅胶拌样，0.6kg的160目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮混合溶剂梯度洗脱，每个比例的溶剂洗脱时，洗脱到没有成分洗下为止，然后换下一个比例的溶剂，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为8:2的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以48％的甲醇为流动相，Zorbax SB-C18(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为350nm，每次进样200μL，收集27.2min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，即得该新化合物。
实施例3
烟草样品来源于云南大理，品种为云烟200，将烟草取样3.5kg切成小段，以95％的乙醇提取4次，每次提取48h，每次95％的乙醇的用量与烟草的重量比＝3:1，提取液合并，过滤，滤液减压浓缩成浸膏，得浸膏145g。
浸膏用重量是其1.5倍量的纯乙醇溶解后用150g的80目粗硅胶拌样，1.0kg的200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脱，每个比例的溶剂洗脱时，洗脱到没有成分洗下为止，然后换下一个比例的溶剂，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为8:2的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以48％的甲醇为流动相，Zorbax SB-C18(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为350nm，每次进样200μL，收集27.2min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，即得该新化合物。
实施例4
烟草样品来源于云南昆明，品种为红花大金元，将烟草取样5kg粉碎，以75％的丙酮用超声提取3次，每次提取72h，每次75％的丙酮的用量与烟草的重量比＝4:1，提取液合并，过滤，滤液减压浓缩成浸膏，得浸膏350g。
浸膏用重量比3倍量的纯丙酮溶解后用400g的90目粗硅胶拌样，2.4kg的300目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脱，每个比例的溶剂洗脱时，洗脱到没有成分洗下为止，然后换下一个比例的溶剂，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为8:2的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以48％的甲醇为流动相，Zorbax SB-C18(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为350nm，每次进样200μL，收集27.2min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，即得该新化合物。
实施例5
烟草样品来源于云南昆明，品种为红花大金元，将烟草取样4.9kg粉碎，以60％的丙酮用超声提取3次，每次提取72h，每次75％的丙酮的用量与烟草的重量比＝4:1，提取液合并，过滤，滤液减压浓缩成浸膏，得浸膏350g。
浸膏用重量比2倍量的纯丙酮溶解后用280g的50目粗硅胶拌样，0.7kg的100目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脱，每个比例的溶剂洗脱时，洗脱到没有成分洗下为止，然后换下一个比例的溶剂，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为8:2的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以48％的甲醇为流动相，Zorbax SB-C18(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为350nm，每次进样200μL，收集27.2min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，即得该新化合物。
实施例6
烟草样品来源于云南昆明，品种为红花大金元，将烟草取样5.1kg粉碎，以95％的丙酮用超声提取3次，每次提取72h，每次75％的丙酮的用量与烟草的重量比＝4:1，提取液合并，过滤，滤液减压浓缩成浸膏，得浸膏350g。
浸膏用重量比1.5倍量的纯丙酮溶解后用1050g的150目粗硅胶拌样，2.8kg的400目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脱，每个比例的溶剂洗脱时，洗脱到没有成分洗下为止，然后换下一个比例的溶剂，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为8:2的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以48％的甲醇为流动相，Zorbax SB-C18(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为350nm，每次进样200μL，收集27.2min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，即得该新化合物。
实施例7
烟草样品来源于云南大理，品种为云烟200，将烟草取样3.5kg切成小段，以85％的乙醇提取4次，每次提取48h，每次95％的乙醇的用量与烟草的重量比＝3:1，提取液合并，过滤，滤液减压浓缩成浸膏，得浸膏148g。
浸膏用重量是其1.5倍量的纯甲醇溶解后用150g的80目粗硅胶拌样，1.0kg的200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脱，每个比例的溶剂洗脱时，洗脱到没有成分洗下为止，然后换下一个比例的溶剂，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为8:2的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以48％的甲醇为流动相，Zorbax SB-C18(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为350nm，每次进样200μL，收集27.2min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，即得该新化合物。
实施例8
烟草样品来源于云南大理，品种为云烟200，将烟草取样3.5kg切成小段，以70％的乙醇提取4次，每次提取48h，每次95％的乙醇的用量与烟草的重量比＝3:1，提取液合并，过滤，滤液减压浓缩成浸膏，得浸膏150g。
浸膏用重量是其2倍量的纯乙醇溶解后用150g的80目粗硅胶拌样，1.0kg的200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脱，每个比例的溶剂洗脱时，洗脱到没有成分洗下为止，然后换下一个比例的溶剂，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为8:2的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以48％的甲醇为流动相，Zorbax SB-C18(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为350nm，每次进样200μL，收集27.2min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，即得该新化合物。
实施例9
烟草样品来源于云南大理，品种为云烟200，将烟草取样3.5kg切成小段，以70％的甲醇提取4次，每次提取48h，每次95％的乙醇的用量与烟草的重量比＝3:1，提取液合并，过滤，滤液减压浓缩成浸膏，得浸膏146g。
浸膏用重量是其3倍量的纯乙醇溶解后用150g的80目粗硅胶拌样，1.0kg的200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脱，每个比例的溶剂洗脱时，洗脱到没有成分洗下为止，然后换下一个比例的溶剂，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为8:2的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以48％的甲醇为流动相，Zorbax SB-C18(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为350nm，每次进样200μL，收集27.2min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，即得该新化合物。
实施例10
烟草样品来源于云南大理，品种为云烟200，将烟草取样3.5kg切成小段，以85％的甲醇提取4次，每次提取48h，每次95％的乙醇的用量与烟草的重量比＝3:1，提取液合并，过滤，滤液减压浓缩成浸膏，得浸膏149g。
浸膏用重量是其1.5倍量的纯甲醇溶解后用150g的80目粗硅胶拌样，1.0kg的200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脱，每个比例的溶剂洗脱时，洗脱到没有成分洗下为止，然后换下一个比例的溶剂，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为8:2的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以48％的甲醇为流动相，Zorbax SB-C18(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为350nm，每次进样200μL，收集27.2min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，即得该新化合物。
实施例11
------化合物结构的鉴定
取实施例1制备的化合物，为黄色胶状物。λmax(log ε)350(3.60)、308(3.28)、250(3.91)、210(4.32)nm；红外光谱(溴化钾压片)νmax 3397、1654、1608、1554、1508、1416、1367、1135、1050、931、846cm-1；高分辨质谱(HRESIMS)给出准分子离子峰m/z 351.0849[M+Na]+(计算值351.0845)。结合图1和图2所示的1H NMR和13C NMR谱给出一个分子式C18H16O6，不饱和度为11。从1H和13CNMR谱结合二维相关(数据归属见表1)信号可以看出该化合物为异黄酮类化合物，化合物中有一个1,4-二取代的苯环、一个五取代苯环、一个氧化亚甲基、二个甲氧基、一个酚羟基、一个羰基、一组双键。其中两个苯(C-5～C-10和C-1′～C-6′)、羰基(C-4)和双键(C-2和C-3)构成了异黄酮的骨架；根据H-2和C-3、C-4、C-1'、C-9，H-2'，6'和C-3的HMBC相关(图3)可进一步证实化合物为异黄酮结构。母体骨架确定，剩余的一个氧化亚甲基、二个甲氧基、一个酚羟基则为取代基。根据两个甲氧基氢信号分别和C-4'和C-7有HMBC相关，可证实两个甲氧基分别取代在C-4'和C-7位；根据H-2”和C-7、C-8和C-9有HMBC相关，则可推测羟甲基取代在C-8位；酚羟基取代在C-6位可从酚羟基信号和C-5、C-6和C-7的HMBC相关得到确认。至此本化合物的结构得以确定。
实施例12
取实施例2-10制备的化合物，为黄色胶状物。测定方法与实施例5相同，确认实施例2-10制备的化合物均为所述的异黄酮类化合物——4',7-二甲氧基-8-羟甲基-6-羟基-异黄酮。
实施例13
取实施例1-10任意一项制备的的异黄酮类化合物进行抗轮状病毒活性试验，试验情况如下：
抗轮状病毒采用体外细胞测试法，即样品与病毒同时作用于MA104细胞后，通过Alarmablue法检测样品对病毒感染致细胞死亡的保护作用，从而测定样品对HRV的活性作用。
(a)药物的细胞毒性检测
MA104细胞在96孔细胞培养板中培养形成单层后，加入不同浓度的样品液，继续培养3天后，更换含Alamarblue的培养液，继续培养2～3小时后检测其530/590nm(激发波长为530nm，发射波长为590nm)处的荧光值，从而检测样品对MA104细胞的毒性，并计算半数细胞毒浓度(TC50)。
(b)药物抗轮状病毒作用检测
MA104细胞在96孔细胞培养板中培养形成单层后，100TCID50的病毒液和不超过20％细胞毒性的梯度浓度药物溶液同时加到MA104细胞上，继续培养4-6天后，更换含Alamarblue的培养液继续培养2-3小时后检测其530/590nm(激发波长为530nm，发射波长为590nm)处的荧光值，并计算半数抑制浓度(IC50)。(c)根基TC50/IC50计算化合物的治疗指数。
结果表明，本发明化合物的TC50值为226.5μg/mL、IC50值为8.94μg/mL，治疗指数TI为25.34；其治疗指数超过对照病毒唑的治疗指数18.90；化合物具有很好的抗轮状病毒活性。以上结果揭示了本发明的化合物在制备抗轮状病毒药物中有良好的应用前景。本发明化合物结构简单活性较好，可作为抗轮状病毒药物研发的先导性化合物用于抗轮状病毒药物制剂研发。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (5)

1.一种具有抗轮状病毒活性的异黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)，浸膏提取: 以烟草全株为原料，将烟草粉碎或切成小段，用质量百分浓度为70％～95％的甲醇或乙醇，或质量百分浓度为60％～95％的丙酮为提取溶剂，每次提取将烟草粉末或小段浸泡在提取溶剂中24h～72h，提取3～5次，每次提取溶剂的用量与烟草的重量比＝2～4:1，合并提取液，过滤，滤液浓缩成浸膏；
步骤(2)，硅胶柱层析：将步骤(1)得到的浸膏用重量是其0.8～3倍量的50～150 目硅胶拌样，并用重量是浸膏2～8倍的100～400目的硅胶干法装柱，然后上样，进行硅胶柱层析；以氯仿-丙酮的混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，薄层层析法跟踪，合并相同的部分，收集各部分洗脱液并浓缩；梯度洗脱时，氯仿-丙酮的混合溶剂体积配比从1:0逐渐变化至1:2；
步骤(3)，高压液相色谱分离纯化：将步骤(2) 得到的洗脱液的8:2部分进一步用高压液相色谱分离纯化，即得如式(Ⅰ)所示的异黄酮类化合物：
该化合物的命名为：4',7-二甲氧基-8-羟甲基-6-羟基-异黄酮。
2.根据权利要求1 所述的一种具有抗轮状病毒活性的异黄酮类化合物的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，高压液相色谱分离纯化后的化合物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用凝胶柱层析进一步分离纯化。
3.根据权利要求1所述的一种具有抗轮状病毒活性的异黄酮类化合物的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的高压液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的C18色谱柱，流速为20mL/min，流动相为质量百分浓度为48％的甲醇，紫外检测器检测波长为350nm，每次进样200μL，收集27.2min 的色谱峰，多次累加后蒸干。
4.根据权利要求1所述的一种具有抗轮状病毒活性的异黄酮类化合物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的浸膏在经硅胶柱层析分离前，采用干法上样，具体方法为：用重量是浸膏的1.5～3倍量的纯甲醇、纯乙醇或纯丙酮溶解后，用重量是浸膏的0.8～1.2倍的80～100目硅胶拌样，然后上样。
5.根据权利要求1 所述的一种具有抗轮状病毒活性的异黄酮类化合物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的梯度洗脱时，氯仿-丙酮混合溶剂的体积配比依次为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1 和1:2 ；每个比例的溶剂洗脱时，洗脱到没有成分洗下为止，然后换下一个比例的溶剂。
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