CN101297865A - 一种从番石榴叶中提取总黄酮的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从番石榴叶中提取总黄酮的方法,该方法是:取干燥、除杂和粉碎后的番石榴叶用70%乙醇回流提取,将提取液浓缩后上弱极性大孔树脂层析柱,先用水和碱洗脱将水溶性杂质除去,然后用30%~90%的乙醇洗脱吸附在大孔树脂中的黄酮类化合物,收集乙醇洗脱液,干燥,即可。利用本发明方法所得番石榴叶总黄酮提取物的得率可高达20~32%,提取物中总黄酮的含量高达50%左右。
Description
技术领域
本发明涉及黄酮类化合物的制备方法,具体是涉及从植物中提取黄酮类化合物的方法。
背景技术
番石榴(Psidium guaijava)又名鸡矢果、香稔、长稔、番桃树,是桃金娘科、番石榴属果树。在我国广西、福建、台湾、海南、广东等地广泛栽种,夏秋采叶,晒干。其叶性平、味甘涩,具有收敛止泻、消炎止血的功效。植物化学研究表明,番石榴叶中可提取的有效部位属于总黄酮类化合物,黄酮类化合物黄酮类化合物(Flavonoids)是植物经光合作用产生的一大类化合物,其主要作用有:抗肿瘤,延缓衰老,增强心血管功能,治疗慢性前列腺炎,增强免疫力,调解内分泌等。一项发明专利申请(申请号为200610041855.4)公开了一种从番石榴叶中提取黄酮类化合物的方法:(1)将经过干燥、去杂和粉碎的番石榴叶溶于5倍90%~100%酒精,真空提取30~40min,按上述工艺将番石榴叶重复提取3~4次,然后在常压、110℃~120℃的条件下浓缩成浸膏,冷却,回收乙醇;(2)将除去乙醇后的浸膏用离心的方法分离出固体,然后用非醚类溶剂在45℃~55℃下脱脂45~60min,最后烘干,即可。该方法所得番石榴黄酮干粉中水分含量≤10%,药用黄酮纯番石榴叶素含量≥10%,但是浸膏中总黄酮的含量较低。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提高从番石榴叶中提取所得的总黄酮的纯度。
本发明解决上述技术问题的技术方案是:
一种从番石榴叶中提取总黄酮的方法,该方法由以下步骤组成:
(1)将番石榴叶干燥、去杂,然后粉碎至粒度≥100目;
(2)将经过步骤(1)加工的番石榴叶粉用8~10倍70%乙醇回流提取2~4次,每次1~3h;合并提取液,然后80℃下加热浓缩至无醇味,过滤,得粗提液;
(3)按制备粗提液所用番石榴叶与湿树脂的重量比为1∶1~4,将粗提液以1~4BV/h的流速通过填充有径高比为1∶3~9的弱极性大孔吸附树脂的层析柱;接着先以2~4BV/h的流速用3~8BV的水洗脱,再以1~3BV/h的流速用4~6BV的浓度为0.1%的氢氧化钠溶液洗脱,最后以2~4BV/h的流速用30~90%乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液;
(4)将所得的乙醇洗脱液经减压或喷雾干燥,即可。
本发明所述的方法,其中步骤(3)中所述的湿树脂的用量为制备粗提液所用番石榴叶与湿树脂的重量比优选1∶4。
本发明所述的方法,其中步骤(3)中洗脱用的乙醇浓度优选70%。
本发明方法首先采用多次乙醇回流提取,尽可能将番石榴叶中黄酮类物质提取出来,提高粗提物总黄酮的得率,然后通过适于分离黄酮类化合物的弱极性大孔树脂层析柱将黄酮类物质从乙醇提取液中分离出来,达到提高总黄酮纯度目的。采用本发明方法所得番石榴叶总黄酮的得率可高达20~32%,纯度高达50%左右。
以下详述本发明人所做的实验报告和具体实施例,以期公众更好地掌握本发明方法的实施手段,充分理解本发明方法所能达到的技术效果。
一、总黄酮纯度的测定
由于番石榴叶中的黄酮类化合物在紫外分光区有吸收,因此可以用紫外分光光度法测定本发明方法所得总黄酮的纯度。
1、对照品的制备和标准曲线的绘制
参照《中华人民共和国药典》总黄酮的测定方法:精密称取在120℃干燥下至恒重的芦丁对照品50mg,置25ml量瓶中,加甲醇适量,置水浴上微热使溶解,放冷,加甲醇置刻度,摇匀。精密量取10ml置100ml量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀作为对照品溶液备用。精密量取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0与6.0ml分别置25ml量瓶中,各加蒸馏水至6.0ml,加5%亚硝酸钠溶液1ml,混匀,放置6分钟,加10%硝酸铝溶液1ml摇匀,放置6分钟,加氢氧化钠溶液10ml再加蒸馏水至刻度,摇匀放置15分钟,以用紫外分光光度法,于波长500nm处测定吸光度,随行试剂空白,测定3次,绘制标准曲线。
结果如表1所示,以芦丁标准品的浓度(mg/ml)为横坐标x,吸光度为纵坐标y,绘制标准曲线,得回归方程:y=10.925x+0.0017,r=0.9998。
表1 不同浓度芦丁的紫外分光光度法测定结果
2、样品中总黄酮的测定
取本发明所得总黄酮用甲醇溶解作为待测样品溶液于波长500nm处测定吸光度y,代入标准曲线方程y=10.925x+0.0017计算样品中总黄酮的浓度x。
二、工艺参数对提取效果的影响
1.上柱时药材量与湿树脂的不同比例对提取效果的影响
1.1树脂的预处理:以95%乙醇浸泡FL-1型树脂24h,充分溶胀后,除去上浮树脂碎片和杂物,用湿法装柱,继续用95%乙醇以适当流速通过树脂柱,洗至流出液与水(1∶5)混合不呈浑浊,再用水洗至无醇味,备用。
1.2上柱溶液的制备:称取番石榴叶粗粉适量,10倍量70%乙醇加热回流提取2次,每次1h。两次提取液合并,减压回收乙醇至无醇味,加入适量热水,抽滤,即得上柱溶液。
1.3药材上样量的确定:准确称取2、4、6、8g已处理好的FL-1型大孔吸附树脂,分别以湿法装柱(12cm×20cm),精密吸取10ml上柱溶液(药材浓度为0.2g/ml,总黄酮浓度为13.22mg/ml),以流速2ml/min上柱,过柱液重吸附一次,经充分吸附后,收集吸附后的样品液,采用上述报告一中所述总黄酮纯度的测定方法测定其中总黄酮的浓度,计算吸附量及吸附百分率,结果见表2。
表2 不同比例的药材与树脂对提取效果的影响
从表2可以看出,当药材量∶湿树脂量=1∶1~4时,大孔树脂对总黄酮的吸附量可达67%以上,其中比例为1∶4时效果最佳,吸附量高达92.42%。
2.洗脱时不同乙醇浓度对提取效果的影响
2.1上柱液的制备:取番石榴叶250g,10倍量70%乙醇煎煮2次,每次1h。合并提取液,过滤,回收乙醇,浓缩至150ml。
2.2大孔树脂分离:将上述上柱液分为6组,每组25ml,分别以1ml/min的流速通过填充有F-1树脂(2cm×45cm)的层析柱,然后用水洗至无色,再用相当于装柱体积5倍的0.1%NaOH洗脱,最后1~6组分别用30%、40%、50%、60%、70%和80%的乙醇洗脱,洗脱流速为2ml/min,收集乙醇洗脱液,80℃水浴浓缩至干,得番石榴叶总黄酮粗品。采用上述报告一中所述总黄酮纯度的测定方法测定该样品中总黄酮的量,结果如表3所示。
表3 乙醇浓度对提取效果的影响(n=3)
从表3可以看出,总黄酮的收率和洗脱时所用乙醇的浓度密切相关,乙醇浓度小于70%时,总黄酮的收率与乙醇浓度呈递增关系,当乙醇浓度大于70%时,总黄酮的收率开始有下降的趋势,当乙醇浓度等于70%时,总黄酮的收率最高,总黄酮的纯度也最高。
三、本发明方法提取番石榴叶所得的总黄酮治疗轮状病毒性腹泻的效果试验
1.动物:6~8w龄SPF级BALB-C小鼠(南方医科大学实验动物中心提供,合格证号:粤检证字第2006B023,2006A049号)84只,体重18~22g。
2.试剂番石榴叶:广东产桃金娘科番石榴(Psidum guajava)的嫩叶水煎剂,由南方医科大学中医系制剂室完成;思密达:博福-益普生(天津)制药有限公司生产,批准文号为国药准字H20000690;粪便HRV抗原检测试剂盒,由北京万泰生物药业有限公司提供(酶标法)批准文号为S20050030;总黄酮:取下述实施例1从番石榴叶中提取得到的总黄酮。
3.试验步骤
观察小鼠84只,先取小鼠粪便用病毒诊断试剂盒检测均为阴性,①将84只小鼠随机分为7组,每组12只,即正常对照组、感染对照组、番石榴叶治疗组、思密达治疗组、总黄酮高剂量组、总黄酮中剂量组、总黄酮低剂量组。除正常组不用病毒灌胃外,其余每组小鼠给予浓度为104TCID轮状病毒悬液100ul灌胃,第2天小鼠开始出现腹泻、水样便、少食等症状,大便试剂盒检测阳性。水煎剂组给予番石榴叶水煎剂0.5ml灌胃,思密达组给予思密达0.5ml灌胃,总黄酮高(10mg/ml)、中(20mg/ml)、低剂量组(30mg/ml)分别给予各组相应剂量的总黄酮混悬液0.5ml灌胃,每天1次,连续3天,同时均给予普通饲料及饮水进行饲养。
4.试验结果
4.1对小鼠粪钠、粪糖的影响
于治疗后采集粪便新鲜样本,取1g加入2ml蒸馏水,充分搅匀,3000rmp离心3分钟,取上清液测试;结果见表4:低、中、高剂量组在番石榴叶总黄酮的治疗下,轮状病毒性腹泻引起的粪钠、粪糖有明显的降低,量效关系明确,对正常动物无明显影响。
4.2对小鼠轮状病毒转阴率的影响
治疗前后分别用试剂盒检测粪便轮状病毒抗原。检测步骤:取适量粪便样本放入容器内,加入9倍体积生理盐水,搅拌混匀2分钟,静置或离心后在加样处滴加3~4滴粪便上清液,平置于室温,10分钟内判断结果。出现两条红线提示为阳性;出现一条红线提示为阴性;不出现红色线提示为无效。
治疗3天后,检测小鼠粪便中轮状病毒转阴率,结果示:黄酮高剂量组转阴11只(转阴率为91.7%),中剂量组转阴10只(转阴率为83.3%),低剂量组转阴7只(转阴率为58.3%),感染组全部阳性(转阴率为0),思密达组转阴8只(转阴率为66.7%),番石榴叶水煎剂组转阴9只(转阴率为75%)。而总黄酮高、中、低剂量组的小鼠在番石榴叶总黄酮的治疗下,轮状病毒性腹泻引起轮状病毒转阴率有明显的提高,且量效关系明确。
表4 各组小鼠粪钠、粪糖的变化(x±s)
具体实施方式
例1
1、利用本发明方法从番石榴叶中提取总黄酮
(1)初级加工:
干燥:取收集来的成熟番石榴叶采用日光晒或烘干的方法进行干燥,至含水分≤10%;
去杂:将经过干燥后的番石榴叶经振动分拣筛处理、分离、滤去非金属杂质;
粉碎:将经过以上工艺加工的番石榴叶用打碎机进行粉碎,粉碎粒度≥100目。
(2)粗提:称取番石榴叶粗粉适量,10倍量70%乙醇加热回流提取2次,每次1h;合并两次提取液,减压回收乙醇至无醇味,过滤,即得粗提液。
(3)精制:将粗提液以2BV/h的上柱流速通过填充有径高比为1∶5的弱极性大孔吸附树脂的层析柱,上柱时控制药材量与湿树脂重量比为1∶4,接着用5BV的水洗脱,洗脱流速为2BV/h,再以2BV/h的流速用5BV的浓度为0.1%的氢氧化钠溶液洗脱,然后用70%乙醇洗脱,洗脱流速为2BV/h,收集乙醇洗脱液,最后将收集所得的洗脱液经减压干燥。
2、结果鉴定
采用常用的中药干膏提取物的测算方法以及上述报告一中所述总黄酮纯度的测定方法进行测算,本实施例所述方法的总黄酮干膏得率为30.12%,纯度为55.22%。
例2
1、利用本发明方法从番石榴叶中提取总黄酮
(1)初级加工:
干燥:取收集来的成熟番石榴叶采用日光晒或烘干的方法进行干燥,至含水分≤10%;
去杂:将经过干燥后的番石榴叶经振动分拣筛处理、分离、滤去非金属杂质;
粉碎:将经过以上工艺加工的番石榴叶用打碎机进行粉碎,粉碎粒度≥100目。
(2)粗提:称取番石榴叶粗粉适量,8倍量70%乙醇加热回流提取2次,每次1h;合并两次提取液,减压回收乙醇至无醇味,过滤,即得粗提液。
(3)精提:将粗提液以1BV/h的上柱流速通过填充有径高比为1∶3的弱极性大孔吸附树脂的层析柱,上柱时控制药材量与湿树脂重量比为1∶1,接着用3BV的水洗脱,洗脱流速为2BV/h,再以3BV/h的流速用6BV的浓度为0.1%的氢氧化钠溶液洗脱,然后用30%乙醇洗脱,洗脱流速为2BV/h,收集乙醇洗脱液,最后将收集所得的洗脱液经减压干燥。
采用实施例1所述方法测得总黄酮干膏得率为28.43%,纯度为47.51%。
例3
1、利用本发明方法从番石榴叶中提取总黄酮
(1)初级加工:
干燥:取收集来的成熟番石榴叶采用日光晒或烘干的方法进行干燥,至含水分≤10%;
去杂:将经过干燥后的番石榴叶经振动分拣筛处理、分离、滤去非金属杂质;
粉碎:将经过以上工艺加工的番石榴叶用打碎机进行粉碎,粉碎粒度≥100目。
(2)粗提:称取番石榴叶粗粉适量,10倍量70%乙醇加热回流提取2次,每次1h;合并两次提取液,减压回收乙醇至无醇味,过滤,即得粗提液。
(3)精提:将粗提液以4BV/h的上柱流速通过填充有径高比为1∶9的弱极性大孔吸附树脂的层析柱,上柱时控制药材量与湿树脂重量比为1∶4;接着用9BV的水洗脱,洗脱流速为4BV/h,再以1BV/h的流速用4BV的浓度为0.1%的氢氧化钠溶液洗脱,然后用90%乙醇洗脱,洗脱流速为4BV/h,收集乙醇洗脱液;最后将收集所得的洗脱液经喷雾干燥。
采用实施例1所述方法测得总黄酮干膏得率为32.51%,纯度为54.18%。
例4
1、利用本发明方法从番石榴叶中提取总黄酮
(1)初级加工:
干燥:取收集来的成熟番石榴叶采用日光晒或烘干的方法进行干燥,至含水分≤10%;
去杂:将经过干燥后的番石榴叶经振动分拣筛处理、分离、滤去非金属杂质;
粉碎:将经过以上工艺加工的番石榴叶用打碎机进行粉碎,粉碎粒度≥100目。
(2)粗提:称取番石榴叶粗粉适量,9倍量70%乙醇加热回流提取2次,每次1h;合并两次提取液,减压回收乙醇至无醇味,过滤,即得粗提液。
(3)精提:将粗提液以3BV/h的上柱流速通过填充有径高比为1∶7的弱极性大孔吸附树脂的层析柱,上柱时控制药材量与湿树脂重量比为1∶3;接着用6BV的水洗脱,洗脱流速为3BV/h,再以2BV/h的流速用5BV的浓度为0.1%的氢氧化钠溶液洗脱,然后用50%乙醇洗脱,洗脱流速为3BV/h,收集乙醇洗脱液,最后将收集所得的洗脱液经喷雾干燥。
采用实施例1所述方法测得总黄酮得率为29.82%,纯度为51.26%。
对比例
按照发明专利申请(申请号为200610041855.4)“一种从番石榴叶中提取黄酮类化合物”的方法提取番石榴叶中的总黄酮:(1)将经过干燥、去杂和粉碎的番石榴叶溶于5倍90%~100%酒精,真空提取30~40min,按上述工艺将番石榴叶重复提取3~4次,然后在常压、110℃~120℃的条件下浓缩成浸膏,冷却,回收乙醇;(2)将除去乙醇后的浸膏用离心的方法分离出固体,然后用氯仿在45℃~55℃下脱脂45~60min,最后烘干,即可。
采用实施例1所述方法测得总黄酮干膏得率为44.82%,纯度为37.12%。
Claims (3)
1、一种从番石榴叶中提取总黄酮的方法,该方法由以下步骤组成:
(1)将番石榴叶干燥、去杂,然后粉碎至粒度≥100目;
(2)将经过步骤(1)加工的番石榴叶粉用8~10倍70%乙醇回流提取2~4次,每次1~3h;合并提取液,然后80℃下加热浓缩至无醇味,过滤,得粗提液;
(3)按制备粗提液所用番石榴叶与湿树脂的重量比为1∶1~4,将粗提液以1~4BV/h的流速通过填充有径高比为1∶3~9的弱极性大孔吸附树脂的层析柱,接着先以2~4BV/h的流速用3~8BV的水洗脱,再以1~3BV/h的流速用4~6BV的浓度为0.1%的氢氧化钠溶液洗脱,最后以2~4BV/h的流速用30~90%乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液;
(4)将所得的乙醇洗脱液经减压或喷雾干燥,即可。
2、如权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(3)中所述的湿树脂的用量为制备粗提液所用番石榴叶与湿树脂的重量比为1∶4。
3、如权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(3)中洗脱用的乙醇浓度为70%。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20081105 |