CN106176844A - 一种抗氧化作用强的木槿叶提取物制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种抗氧化作用强的木槿叶提取物制备方法，将木槿叶烘干、粉碎，采用超声波辅助提取；提取的溶剂为50%乙醇水溶液，提取条件组合为：料液比的质量比为1:40‑60，提取时控制温度60‑70℃，提取时间40‑60min；然后过滤或者离心，浓缩蒸发去掉乙醇，得到木槿提取水溶液；过DM130树脂层析柱、冲洗、用60%的乙醇洗脱，收集洗脱液；洗脱液浓缩、干燥，得到木槿叶提取物。本发明得到一种总酚含量为10%‑15%的木槿叶提取物，通过DPPH自由基清除试验，超氧阴离子清除实验，羟自由基清除实验，该提取物具有强抗氧化作用，可以作为食品、保健品、药品、化妆品的功效原料。
Description
技术领域
本发明涉及植物提取领域，尤其是一种木槿叶提取物的制备方法。
背景技术
木槿是落叶灌木，属锦葵科木槿。在木槿叶中含有蒽醌类化合，包括大黄素甙、大黄素、大黄酚、槲皮素等二十多种成分。这些物质能促进肠内肌肉收缩，使肠内细菌分解和活化，加快肠道蠕动，具有通便利尿的作用。其中大黄酚具有泻下作用；大黄素苷能够治疗气喘、过敏性鼻炎、花粉过敏等；槲皮素能够祛痰、止咳、平喘。此外这些物质还具有降血压,降低血脂、抑制溃疡、扩张冠状动脉、以及收敛镇静的作用，可用于治疗慢性支气管炎，同时可以辅助治疗高血压和冠心病。木槿中含有氨基酸和有机酸，食用木槿可满足人体对必需氨基酸的摄入需求。木槿叶中含有多种维生素，这些维生素具有很强的抗氧化作用。木槿叶还含有黄酮类化合物，这些化合物的抗氧化能力比维生素E的抗氧化能力还要强十倍以上。公开号为CN103601770A，名称为木槿花瓣花色苷超声波辅助提取方法的发明专利，公开了一种木槿花瓣花色苷超声波辅助提取方法，通过将木槿花瓣在液氮中研磨成粉后加入盐酸甲醇混合液，并在恒温水浴和超声波环境下实现从木槿花瓣中提取花色苷。以0.1%盐酸甲醇为提取剂，辅以超声波提取木槿花瓣中花色苷的方法，大大降低了提取木槿花色苷的时间，提高了提取效率。发明专利公开号为CN103642862A，名称为从木槿叶中分离提取复合氨基酸的方法，公开一种从木槿叶中分离提取复合氨基酸的方法，该方法包括预处理、超声处理、脱色、除杂、纯化、溶解晶体、析出晶体、烘干，得复合氨基酸晶体。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种总酚含量为10%-15%、具有强抗氧化作用的木槿叶提取物的制备方法，该提取物可以作为食品、保健品、药品、化妆品的功效原料。
为了解决该技术问题，以质量比计，本发明采取的技术方案是：
1、木槿叶的前处理
将木槿叶烘干，或者采用干叶，用粉碎机粉碎成粗粉；粗粉呈暗绿色，具有木槿特殊的气味。
2、超声波水-乙醇提取
采用超声波辅助提取。提取的溶剂为50%乙醇水溶液，提取条件组合为：以质量比计，料液比为1:40-60，提取时控制温度60-70℃，提取时间40-60min。
优选提取条件组合为：温度70℃、配料比1:50、乙醇浓度50%、提取时间50min，提取率会高。
然后过滤或者离心，弃去残渣，得到黄棕色提取液。
3、回收乙醇
将得到黄棕色提取液蒸发浓缩，回收乙醇，得到木槿提取水溶液；
蒸发浓缩优选旋转蒸发仪，蒸发时控制温度为60℃、转速为50r/min。
4、大孔树脂纯化
DM130为聚苯乙烯型弱极性吸附树脂，主要用于黄酮、皂苷和多酚类的提取和精制。由于木槿叶提取液中含有大量的果胶、糖类物质、氨基酸，导致干燥提取液时粉末呈现粘稠的状态。在干燥之前采用DM130大孔树脂吸附、洗脱得到去除大部分果胶、糖类和氨基酸的木槿叶提取物，提高总酚含量。
将得到木槿提取水溶液，过DM130大孔树脂层析柱，控制流速和流量，结束后用清水压出提取液，冲洗树脂除去杂质；再用60%的乙醇洗脱，收集洗脱液。
用DM130大孔树脂吸附提取液时，优选层析柱型号是φ1.4cm×20cm，流速每秒滴液体2~3滴，用60%的乙醇洗脱，流速同样为每秒滴液体2~3滴。
5、浓缩、干燥
将收集到的洗脱液蒸发浓缩得到浓缩液，将浓缩液进一步干燥，得到木槿叶提取物。称重，计算木槿叶提取物总酚的提取率。
所述的前处理、超声波水-乙醇提取、浓缩、柱层析、干燥都为已知技术。
总酚含量测定
利用福林酚法，在碱性条件下，酚类物质与铜结合生成复合物，福林酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐被酚还原，形成钼蓝和钨蓝的混合物，产生深蓝色。在一定条件下，蓝色深度与酚类物质的含量成正比。
实验步骤：取没食子酸标准品（0.208mg/mL）0uL、50uL、100uL、200uL、300uL、400uL于比色管中，加水至2.5mL，再加福林酚2.5mL，反应3min，再加浓度为100mg/mL Na2CO3溶液2.5mL，反应5小时，取出。用紫外分光光度计在570nm处测吸光度，吸光度测三次取平均值。得到回归方程：y=122.8x-0.001(R=0.999)；表明没食子酸在0~12 mg/mL范围内吸光值与浓度之间存在良好的线性关系。经检测，上述所得木槿叶提取物中总酚含量为10%-15%。
抗氧化试验
将所得的木槿叶提取物，做抗氧化实验。
1.DPPH自由基清除试验
原理：DPPH是一种稳定的自由基，在有机溶剂中呈紫色，在517 nm波长处有较大吸收，当加入抗氧化剂时，一部分自由基被清除掉，使该波长下吸收强度减弱，可借此来评价某物质的抗氧化活性。
实验步骤：取木槿叶提取物，用DMSO溶解，配制成浓度为3mg/mL、4.5mg/mL、6mg/mL、7.5mg/mL、9mg/mL的待测液。DPPH用无水乙醇配制成0.16 mmol/L，置于棕色瓶中备用。取5支干净的比色管分别加入5μL 0.16 mmol/L的DPPH溶液，再取不同浓度的样品溶液100μL分别加入比色管中，再加入4.9mL蒸馏水，反应体系为10mL。加样后室温振荡15 min，用紫外分光光度计在517 nm波长处检测样品吸光度(As1、As2、As3、As4、As5)；取100 μL DMSO代替样品溶液测得空白吸光度(Ao)；以5mL无水乙醇代替DPPH溶液测得样品本底吸光度(Ac1、Ac2、Ac3、Ac4、Ac5)。根据公式，计算清除率，绘制趋势图。
结果表明，木槿黄酮的浓度与自由基的清除率具有良好的线性关系，自由基的清除率随着浓度的增加而上升呈现正相关。
2.超氧阴离子清除实验
原理：在碱性条件下邻苯三酚发生自氧化反应生成O2-·和中间体，该中间产物在299nm波长处有一特征吸收峰,当加入O2-·清除剂时，O2-·的生成受到抑制，邻苯三酚自氧化过程受阻，溶液在299 nm波长处吸收减弱。因此，通过测定某物质对邻苯三酚自氧化的抑制作用，即可表征其对超氧阴离子自由基的清除作用。
步骤：取5支比色管分别加入质量浓度为3mg/mL、6mg/mL、9mg/mL、12mg/mL、15 mg/mL的提取物100 μL，然后分别加入0.05 mol/L Tris-HC1缓冲溶液(pH8.2) 2.5mL，加分别入再蒸馏水6.9mL，摇匀，置于25 ℃水浴中预热20 min后，再分别加入500 μL用10 mmol/LHCl配成的25 mmol/L焦性没食子酸，混匀后于25℃水溶液中反应5 min，用紫外分光关光度计于299 nm处测吸光值(As1、As2、As3、As4、As5)；用DMSO代替体系中的样品，测得空白吸光值(Ao)；用10 mmol/L HCl代替体系中的焦性没食子酸，测得样品本底吸光值(Ac1、Ac2、Ac3、Ac4、Ac5)。根据公式，计算清除率，绘制趋势图。
结果表明，木槿黄酮的浓度与超氧阴离子清除率具有良好的线性关系，超氧阴离子清除率随着浓度的增加而上升呈现正相关，并且随着浓度的升高，清除率上升得很快。
3．羟自由基清除实验
原理：参照Fenton反应的方法建立反应体系模型，利用H2O2与Fe2+混合产生·OH，但由于·OH具有很高的反应活性，存活时间短，若在体系中加入水杨酸，就能有效地捕捉·OH,并产生有色产物。该产物在510 nm波长处有强吸收，若在反应体系中加入具有清除·OH功能的被测物，便会与水杨酸竞争·OH，而使有色产物生成量减少，采用固定反应时间法，在相同体积的反应体系加入一系列不同浓度的木槿黄酮提取液，并以蒸馏水为参比，与试剂空白液比较，通过在510 nm波长处测量各浓度下的吸光度A，便能检测被测物对·OH的清除作用。
实验步骤：取5支干净的比色管分别加入质量浓度为3mg/mL、6mg/mL、9mg/mL、12mg/mL、15 mg/mL的黄酮提取物100 μL,分别加入蒸馏水2.4mL,然后加入6 mmol/L的FeSO4溶液2.5mL,6 mmol/L的H2O2 2.5mL,摇匀,静置10 min后,再向其中分加入6 mmol/L的水杨酸溶液2.5mL,混匀。在37 ℃条件下反应30 min,然后用紫外分光关光度计于510 nm波长处测吸光值(As1、As2、As3、As4、As5)；用DMSO代替体系中的样品，测得空白吸光值(Ao)；用蒸馏水代替体系中的水杨酸,测得样品本底吸光值(Ac1、Ac2、Ac3、Ac4、Ac5)。根据公式，计算清除率，绘制趋势图。
结果表明，木槿黄酮的浓度与羟自由基清除率具有良好的线性关系，抗氧化率随着浓度的增加而上升呈现正相关,
本发明具有下列优点和特性：
1、组合技术新颖。采用50%乙醇水溶液为提取溶剂，控制料液比为1:40-60，提取时控制温度60-70℃，提取时间40-60min，结合超声波辅助提取，就是将溶解性不是很好的酚类物质尽快、尽量提取出来。然后采用蒸发浓缩去掉乙醇，便于下一步DM130大孔吸附树脂尽量吸附酚类物质，尽量去除木槿叶提取液中含有的果胶、糖类物质、氨基酸等。采用60%的乙醇水溶液洗脱，就是将被DM130大孔树脂吸附的酚类物质洗脱出来，确保木槿叶提取物中总酚含量为10%-15%。通过DPPH自由基清除试验，超氧阴离子清除实验，羟自由基清除实验，证明该提取物具有强抗氧化作用，可以作为食品、保健品、药品、化妆品的功效原料。这些技术特征组合在一起，顺序不能颠倒、密不可分、互相支持，共同作用，才能得到所属的技术效果，组合技术方案不是已知技术，不是简单的叠加，具有突出的实质性特点和显著的进步。
附图说明
图1：样品浓度与DPPH自由基清除率线性图
图2：样品浓度与超氧阴离子清除率线性图
图3：样品浓度与羟自由基清除率线性图。
具体实施方式
以下结合附图，进一步说明本发明。
实施例1
1、木槿叶的前处理
将购买的干木槿叶用高速组织捣碎机粉碎，得到粗粉；粗粉呈暗绿色，具有木槿特殊的气味。
2、超声波水-乙醇提取
采用超声波辅助提取，用50kHz 100W的超声波处理。
取10g木槿叶粗粉，加浓度为50%乙醇水溶液500mL，用超声波破碎仪超声50min，控制温度为70℃，功率100w，进行提取。提取结束后，将料液取出，用离心机在4000 r/min离心10min。取离心液，弃去残渣，用布氏漏斗过滤得到黄棕色提取液。
3、回收乙醇
将得到的黄棕色提取液用旋转蒸发仪回收乙醇，控制温度为60℃、转速为50r/min，得到木槿提取水溶液。
4、大孔树脂纯化
层析柱的规格是φ1.4cm×20cm，将得到的木槿提取水溶液缓慢流入DM130树脂柱中，提取水溶液在树脂中的流速为每秒滴液体2~3滴，结束后用清水缓慢压出提取液，再用大量清水冲洗树脂除去杂质经，最后用300mL 60%的乙醇洗脱，洗涤流速为每秒滴液体2~3滴，收集洗脱液。
5、浓缩干燥
将收集到的洗脱液用旋转蒸发仪蒸发浓缩，控制温度为60℃、转速为50 r/min，得到浓缩液；将浓缩液放进蒸发皿中，用烘箱烘干得到木槿叶提取物。
用福林酚法，将所得到的木槿叶提取物中总酚含量进行测定，检测结果为12.0%。
将所得的木槿叶提取物，做抗氧化实验。
1.DPPH自由基清除试验
实验步骤：取木槿叶提取物，用DMSO溶解，配制成浓度为3mg/mL、4.5mg/mL、6mg/mL、7.5mg/mL、9mg/mL的待测液。DPPH用无水乙醇配制成0.16 mmol/L，置于棕色瓶中备用。取5支干净的比色管分别加入5μL 0.16 mmol/L的DPPH溶液，再取不同浓度的样品溶液100 μL分别加入比色管中，再加入4.9mL蒸馏水，反应体系为10mL。加样后室温振荡15 min，用紫外分光光度计在517 nm波长处检测样品吸光度(As1、As2、As3、As4、As5)；取100 μL DMSO代替样品溶液测得空白吸光度(Ao)；以5mL无水乙醇代替DPPH溶液测得样品本底吸光度(Ac1、Ac2、Ac3、Ac4、Ac5)。根据公式，计算清除率，绘制线性图，见图1。
清除率=[A0-（As-Ac）]÷A0×100%
式中Ao:5mL DPPH+100μLDMSO+4.9mL 水
As: 5mL DPPH+100μL 样品+4.9mL 水
Ac：5mL 乙醇+100μL 样品+4.9mL 水
空白：5mL 乙醇+100μLDMSO+4.9mL 水
由图1可知，木槿提取物总酚的浓度与自由基的清除率具有良好的线性关系，自由基的清除率随着浓度的增加而上升呈现正相关。
2.超氧阴离子清除实验
实验步骤：取5支比色管分别加入质量浓度为3mg/mL、6mg/mL、9mg/mL、12mg/mL、15 mg/mL的提取物100 μL，然后分别加入0.05 mol/L Tris-HC1缓冲溶液(pH8.2) 2.5mL，加分别入再蒸馏水6.9mL，摇匀，置于25 ℃水浴中预热20 min后，再分别加入500 μL用10 mmol/LHCl配成的25 mmol/L焦性没食子酸，混匀后于25℃水溶液中反应5 min，用紫外分光关光度计于299 nm处测吸光值(As1、As2、As3、As4、As5)；用DMSO代替体系中的样品，测得空白吸光值(Ao)；用10 mmol/L HCl代替体系中的焦性没食子酸，测得样品本底吸光值(Ac1、Ac2、Ac3、Ac4、Ac5)。根据公式，计算清除率，绘制线性图，见图2。
清除率=[A0-（As-Ac）]÷A0×100%
式中Ao：100μLDMSO +2.5mLTris+6.9mL水+500μL焦性没食子酸
As：100μL样品 +2.5mLTris+6.9mL水+500μL焦性没食子酸
Ac：100μL样品+2.5mLTris+6.9mL水+500μLHCl
空白：100μLDMSO +2.5mLTris+6.9mL水+500μLHCl
由图2可知，木槿提取物总酚的浓度与超氧阴离子清除率具有良好的线性关系，超氧阴离子清除率随着浓度的增加而上升呈现正相关，并且随着浓度的升高，清除率上升得很快。
3．羟自由基清除实验
实验步骤：取5支干净的比色管分别加入质量浓度为3mg/mL、6mg/mL、9mg/mL、12mg/mL、15 mg/mL的所得木槿提取物水溶液100μL，分别加入蒸馏水2.4mL，然后加入6 mmol/L的FeSO4溶液2.5mL，6 mmol/L的H2O2 2.5mL，摇匀，静置10 min后，再向其中分加入6 mmol/L的水杨酸溶液2.5mL，混匀。在37℃条件下反应30 min，然后用紫外分光关光度计于510nm波长处测吸光值(As1、As2、As3、As4、As5)；用DMSO代替体系中的样品，测得空白吸光值(Ao)；用蒸馏水代替体系中的水杨酸，测得样品本底吸光值(Ac1、Ac2、Ac3、Ac4、Ac5)。根据公式，计算清除率，绘制线性图，见图3。
清除率=[A0-（As-Ac）]÷A0×100%
式中A0：100μLDMSO +2.4mL蒸馏水+2.5mL Feso4+2.5mL H2O2+2.5mL水杨酸
As：100μL样品+2.4mL蒸馏水+2.5mL Feso4+2.5mL H2O2+2.5m L水杨酸
Ac：100μL样品+2.4mL蒸馏水+2.5mL Feso4+2.5mL H2O2+2.5mL蒸馏水
空白：100μLDMSO +9.9mL蒸馏水
由图3可知，木槿提取物总酚的浓度与羟自由基清除率具有良好的线性关系，抗氧化率随着浓度的增加而上升呈现正相关。
Claims (5)
1.一种抗氧化作用强的木槿叶提取物制备方法，以质量比计，采用如下工艺步骤：
1）木槿叶的前处理
将木槿叶烘干，或者采用干叶，用粉碎机粉碎，得粗粉；
2）超声波水-乙醇提取
采用超声波辅助提取；提取的溶剂为50%乙醇水溶液，提取条件组合为：以质量比计，料液比为1:40-60，提取时控制温度60-70℃，提取时间40-60min；
然后过滤或者离心，弃去残渣，得到黄棕色提取液；
3）回收乙醇
将得到黄棕色提取液浓缩，蒸发回收乙醇，得到木槿提取水溶液；
4）大孔树脂纯化
将得到木槿提取水溶液，过DM130树脂层析柱，结束后用清水压、冲洗树脂，除去杂质；再用60%的乙醇水溶液洗脱；收集洗脱液；
5）浓缩、干燥
将收集到的洗脱液浓缩得到浓缩液；将浓缩液进一步干燥，得到木槿叶提取物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤2）中所述提取条件组合为：温度70℃、配料比为1:50、乙醇水溶液浓度为50%、提取时间为50min。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤4）中所述层析柱规格是φ1.4cm×20cm，提取液在树脂中的流速为每秒滴液体2~3滴；用60%的乙醇水溶液洗脱，流速为每秒滴液体2~3滴。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤5）中所述木槿叶提取物总酚含量为12.0%。
5.根据权利要求1所述的制备方法所得到的木槿叶提取物。
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2016
- 2016-08-31 CN CN201610764459.8A patent/CN106176844B/zh active Active
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