CN108834400A - 含有酶处理的木槿提取物作为有效成分的用于改善皮肤皱纹的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含糖酵解酶处理的木槿提取物作为有效成分的用于改善皮肤皱纹的组合物。本发明的组合物抑制人真皮成纤维细胞中基质金属蛋白酶‑1的蛋白质的表达并增加I型前胶原的生成，从而呈现出预防皮肤皱纹的产生且改善受损的皮肤的皱纹的功效。综上所述，本发明的组合物可预防并极大改善皮肤皱纹。

Description

含有酶处理的木槿提取物作为有效成分的用于改善皮肤皱纹 的组合物

技术领域

本发明涉及用于改善皮肤皱纹的组合物，更详细地涉及含有酶处理的木槿提取物作为有效成分的用于改善皮肤皱纹的组合物。

背景技术

已知皮肤皱纹受各种因素的影响，如皮肤水分含量、胶原蛋白含量及对外部环境的免疫力等，其中，对皱纹的形成影响最大的为胶原蛋白的生成量及作为胶原蛋白分解酶的胶原酶的表达和活性。

已知胶原蛋白存在于皮肤真皮层，为与占皮肤干重的约70％至80％的弹性蛋白一同向皮肤赋予弹力的主要成分。胶原蛋白因内部因素而减少，例如由自然老化导致的细胞活性降低，并且因外部因素而导致生物合成减少或分解加速，例如各种有害环境中的应激增加或由太阳光线导致的活性氧簇的增加。

另一方面，曾报道过在紫外线B(UVB)暴露环境中活性氧簇(reactive oxygenspecies，ROS)过量产生，与紫外线B暴露相关的信号传递体系与丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs，mitogen activatedprotein kinases)、细胞外信号调节激酶(ERK，extracellularsignal-regulated kinase)、p38激酶、c-Jun氨基末端激酶(JNK，c-Jun amino-terminalkinase)等的蛋白质有关，并且诱导NF-B及AP-1转录因子的表达增加。并且，AP-1蛋白质与基质金属蛋白酶(MMP，matrix metalloproteinase)基因的活性有关，而NF-B蛋白质则影响如白细胞介素等的促炎细胞因子(proinflamMatory cytokines)的表达。

在老化的皮肤中的胶原蛋白及弹性蛋白的崩溃主要是由于如基质金属蛋白酶蛋白质等的其分解酶所增加的表达所致。并且，促炎细胞因子干扰胶原蛋白的合成并促进胶原蛋白的崩溃。I型胶原蛋白为结缔组织的细胞外基质中最丰富的蛋白质。细胞外基质中包含III型、V型及VII型胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖、纤维连接蛋白等的其他类型的蛋白质。

调节I型胶原蛋白的蛋白质的表达水平是防止皮肤光老化的最重要的因素。紫外线B的照射通过抑制TGF-β/Smad信号传递体系，来使皮肤成纤维细胞中的作为胶原蛋白前体的原骨胶原(procollagen)的表达减少。并且，TGF-β1信号传递体系为调节人皮肤成纤维细胞中的细胞外基质的合成的重要的因素之一。

因此，由AP-1及MAPKs因子调节的活性氧簇(ROS)的生成及基质金属蛋白酶(MMPs)、ILs、TGF-β及I型前胶原的表达用作皮肤光老化研究中的有用的标记。

如此，已经进行了各种尝试来寻找通过阻碍胶原蛋白减少来对皮肤皱纹的改善有效的天然物质。已市售为了利用胶原蛋白的皱纹改善效果而向化妆品或软膏等的皮肤外用药组合物中调配了胶原蛋白的产品，但是，由于这些产品是将胶原蛋白本身涂敷于皮肤表面，因此作为高分子物质的胶原蛋白的经皮吸收较难，从而无法表现出本质上的皱纹改善效果。为了解决这些问题，对胶原蛋白合成促进物质的关注度日益增加，作为现有的公知的胶原蛋白合成促进物质具有维生素C、维甲酸、转化生长因子(transforming growthfactor，TGF)、源自动物胎盘的蛋白质(JP8-231370)、桦木酸(betulinic acid，JP8-208424)、小球藻提取物(JP9-40523，JP10-36283，促进成纤维细胞增殖的作用)等。但是，当所述物质适用于皮肤时，存在因刺激性及变红等安全性问题而其使用量受限或者因其效果微乎其微而无法期待实质上的皱纹改善效果的问题。因此，切实需要比现有的用于改善皮肤皱纹的组合物对人体更安全且抗氧效果、皮肤炎症改善效果及皱纹改善效果更高的新型组合物的开发。

另一方面，据悉，作为韩国的国花的木槿(Mugunghwa；Hibiscus syriacus L.)仅在韩国国内就有约200多种，并且木槿皮(Hibisci cortex)作为木槿的根部及茎皮部分，自古以来在韩方中被用作具有消炎、抗菌等的功效的药用植物。然而，尽管木槿为韩国的国花，但至今在韩国国内仅以木槿的栽培及育种开展了研究，而利用木槿的多种生理活性的研究甚少，尤其，作为可适用于生活中的功能性化妆品或食品等的原料而可开展的研究结果却几乎没有。

近来，正在积极开展通过将生物转化技术适用于天然物质来开发多种功能性原料的研究。这种生物转化技术具有可增加天然物质的功能及可确保大量的功效物质的优点。

在韩国专利申请第10-2011-0125087号的“以韩方提取物作为有效成分的用于改善瘙痒症的组合物”中公开有以含有地黄、石菖蒲、黄柏、苦参、竹叶、紫草、扁蓄蓼、木槿皮、款冬花、将军皮及木瓜提取物作为有效成分的用于改善瘙痒症的组合物具有抗炎症效果、水分保湿效果及皱纹改善效果，但其效果仅通过组合11种韩方材料来具有的如上所述的效果，而且根本未提及木槿皮单一组合物本身所具有的皮肤皱纹改善的效果。

据悉，至今在利用木槿单一提取物的情况下是难以取得抗氧化、抗炎症或皮肤皱纹改善等有效的效果。由此，为了将具有可安全无害地用于人体且可容易获取原料的优点的木槿有效地用作化妆品组合物的材料，存在如韩国专利申请第10-2011-0125087号的需要与其他植物材料组合使用的问题。

对此，本发明人为了使木槿所具有的皮肤皱纹改善的效果最大化且有效地用作化妆品组合物的主原料而锐意研究结果，证实了当将木槿提取物作为糖酵解酶来进行处理时，对应于由紫外线B照射诱导的人成纤维细胞(humanderma l fibroblasts，NHDFs)的光老化而呈现出抗氧化、抗炎症及皮肤皱纹改善的显著效果，并完成了本发明。

发明内容

技术问题

因此，本发明的主要目的在于，提供以酶处理的木槿提取物作为有效成分的对皮肤皱纹改善具有显著效果的组合物。

解决问题的方案

根据本发明一实施方式，本发明提供以包含糖酵解酶处理木槿提取物作为有效成分的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物。

本发明人为了寻找对预防皮肤老化、改善炎症及改善皱纹等改善皮肤状态具有功效的物质而从各种天然物质中检索有效物质的结果，发现了糖酵解酶处理的木槿提取物对皮肤皱纹改善效果显著增加，并且确认了适用于皮肤时也无安全性问题。

本发明的“木槿(Hibiscus syriacus L.)”是指原生于整个朝鲜半岛区域中的双子叶植物的锦葵目锦葵科的落叶灌木，当提取这种木槿并处理为酶时，可使用所述木槿的整体或叶、花、花萼、雄蕊、雌蕊、茎、根等的一部分，但无特别限定。在本发明一具体例中，可使用茎皮、根皮或它们的混合物。在韩方中，还将木槿树的茎皮及根皮指称为木槿皮或川槿皮，本发明的木槿提取物和木槿皮提取物以相同意思来使用。

本发明所使用的术语“提取物”包括利用通过植物的提取处理所取得的提取液、所述提取液的稀释液或浓缩液、通过干燥所述提取液来取得的干燥物、所述提取液的粗糙纯化产物或纯化产物或它们的混合物等的提取液本身及利用提取液所能够形成的所有剂型的提取物。优选地，本发明的所述提取物可在提取后制备成干燥粉末形态来使用。

在本发明一具体例中，所述木槿提取物可从木槿的天然、杂种或变种植物提取，还可从植物组织培养物提取，优选地，可从茎及根的皮部分提取。

制备所述提取物的方法可以为超声波提取法、浸出方法及回流提取方法等本发明所属技术领域的常规提取方法。用于提取的溶剂为水、酒精或它们的混合物，优选地，为甲醇或乙醇，但不限定于此。

以试样的重量为基准，提取溶剂的量可使用2倍至50倍，优选地，为2倍至20倍。为了提取，试样可放置于提取溶剂中1小时至72小时来用于浸出，优选地，可放置24小时至48小时。

本发明的术语“糖酵解酶(glycolytic enzyme)”是指用于催化相应反应的酶，在本发明中在广义上是指用于分解纤维素、直链淀粉、丹宁、果胶等的碳水化合物的酶。

在本发明中，作为所述糖酵解酶的例，可例举纤维素酶(cellulase)、半纤维素酶(hemicellulase)、果胶酶(pectinase)、葡萄糖苷酶(glucosidase)、丹宁酸酶(tannase)，但不限定于此，只要是具有用于分解存在于木槿提取物中的多糖类形态的高分子的活性的酶，就包含在本发明的糖酵解酶中。

在本发明一具体例中，优选地，所述糖酵解酶为选自由半纤维素酶(hemicellulase)、果胶酶(pectinase)、葡萄糖苷酶(glucosidase)及丹宁酸酶(tannase)组成的组中的一种以上的酶。并且，所述酶可单独使用或通过复合处理这些酶来使用。

在本发明的另一具体例中，优选地，所述糖酵解酶为混合果胶酶及半纤维素酶的酶，此时，作为以重量比为基准的优选混合比例为果胶酶对半纤维素酶的比例为1：1至1：5或果胶酶对半纤维素酶为1：1至5：1。当不满足所述混合比例时，糖酵解酶处理木槿提取物中的有效活性成分的含量相对减少。

除非另外提示，除了例示的所述酶之外，本发明中所提出的糖酵解酶处理的木槿提取物均包含用于催化相应反应的糖酵解酶处理的木槿提取物，并可用于皮肤皱纹改善的材料。

本发明中所使用的术语“皮肤皱纹改善”是指皮肤再生、皮肤弹力改善、预防或改善皮肤皱纹或改善皮肤炎症。

本发明中所使用的术语“皮肤老化”是指由反应性自由基增加所引起的所有疾病，作为所述皮肤老化的非限制性的示例，可例举有皱纹、皮肤的松弛、弹性降低等。

许多疾病状态和自由基损伤之间的相关关系已被广泛证实，包含酶、离子通道、结构蛋白质及膜脂质的许多细胞构成成分为反应性自由基物种的潜在靶标。所述潜在靶标和自由基的反应使特定范围的细胞功能受损，从而引发病理性变化并最终杀死细胞。

本发明的用于改善皮肤状态的组合物以优秀的自由基去除效果来保护DNA、蛋白质(包含脂蛋白)及膜脂质免受氧化性损伤。

本发明中所使用的术语“皮肤再生”或“改善皮肤弹力”或“预防或改善皮肤皱纹”是指通过增加胶原蛋白的生成或抑制胶原蛋白的分解来使胶原蛋白总量增加的所有作用，本发明中的术语“皮肤皱纹”是指因皮肤衰萎而产生的细纹，可由基因原因、存在于皮肤真皮中的胶原蛋白的减少、外部环境等引起。

本发明中的“预防或改善皮肤皱纹”是指抑制或阻隔皮肤中产生皱纹或者缓解已生成的皱纹。

作为皮肤成纤维细胞的主要功能，可例举通过细胞外基质合成和增殖的受损的皮肤组织再生等，但如光老化等的外源性老化因素或因游离氧所导致的损伤累积、因端粒断裂导致的细胞老化等的内源性老化因素可使真皮层内的皮肤成纤维细胞的生理活性功能降低。当占有皮肤细胞外基质中的95％以上且通过细胞的黏附分子(adhesionmolecule)及细胞骨架(cytoskeleton)等之间的相互作用与信号交流对成纤维细胞的生理活性担当着非常重要的部分的第I型胶原蛋白的合成降低时，皮肤组织内的胶原蛋白量减少，由此表面张力减少且皮肤弹力下降，因此形成皮肤皱纹，并且还成为降低包括细胞的增殖及再生功能的生理活性功能的恶循环的原因。

因此，可视为皮肤成纤维细胞的胶原蛋白直接与皮肤再生、皮肤弹力、皮肤皱纹形成及皮肤损伤时组织的修复或再生有关联。

即，皮肤成纤维细胞的胶原蛋白或原骨胶原的合成得以促进或用于分解胶原蛋白的基质金属蛋白酶(matrix metallo-proteinase，以下称为‘MMP’)的合成受到抑制，则可取得皮肤弹力改善、皮肤再生、皮肤皱纹改善、伤口治愈、受损皮肤组织的修复及再生及预防皮肤老化等的效果。

本发明的包含糖酵解酶处理木槿提取物作为有效成分的组合物的特征在于，使I型前胶原蛋白质的表达增加并抑制基质金属蛋白酶-1蛋白质及基质金属蛋白酶-3蛋白质的表达。

具体而言，本发明的包含酶处理的所述木槿提取物的组合物抑制用于降低受紫外线照射的正常人真皮成纤维细胞(NHDF)中的细胞毒性且促进胶原蛋白分解的基质金属蛋白酶-1及基质金属蛋白酶-3的表达并增加Ⅰ型前胶原的生成，从而可具有增加皮肤弹力、皮肤再生、皮肤皱纹改善、伤口治愈、受损皮肤组织的修复及再生及预防皮肤老化等的效果等。具体而言，可具有预防或改善皮肤皱纹的效果。

本发明中所使用的术语“改善”是指与状态的缓和或治疗相关的参数，例如，至少使症状的程度减少的所有行为。

本发明的包含在用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物中的酶处理的木槿提取物的本身具有改善皮肤皱纹的效果，当与以往已知的具有改善皮肤皱纹效果的公知物质相混合使用时，也可持续性地保持改善皮肤皱纹的效果。

作为具有改善皮肤皱纹效果的所述物质，虽不限定于此，但具有洋甘菊花提取物、迷迭香叶提取物、朝鲜白头翁叶提取物、须松萝提取物、人参提取物、老鹳草花提取物、苦参提取物、羽衣草提取物、麝香草提取物、荨麻提取物、西洋蓍草提取物、丁香提取物、茴香提取物、番木瓜叶提取物、向日葵提取物、桉树提取物、欧白芷提取物等。

此外，本发明的化妆品组合物还可包含水溶性维生素、脂溶性维生素、聚合肽，聚合多糖，鞘脂及海藻提取物等。

作为所述水溶性维生素，只要可调配于化妆品中的，即可随意使用，但优选地，可例举有维生素B1、维生素B2、维生素B6、吡哆醇、盐酸吡哆醇、维生素B12、泛酸、烟酸、烟酸酰胺、叶酸、维生素C、维生素H等，它们的盐(硫胺素盐酸盐、抗坏血酸钠盐等)或衍生物(抗坏血酸-2-磷酸钠盐、抗坏血酸-2-磷酸镁盐等)也包含在本发明中可使用的水溶性维生素。所述水溶性维生素可通过常规方法获得，例如微生物转化方法、纯化微生物培养物的方法、酶方法或化学合成方法等。

作为所述脂溶性维生素，只要可调配于化妆品中的，即可随意使用，但优选地，可例举有维生素A、胡萝卜素、维生素D2、维生素D3，维生素E等，它们的衍生物(棕榈酸抗坏血酸酯、硬脂酸抗坏血酸酯、二棕榈酸抗坏血酸酯、dl-α生育乙酸酚、dl-α生育酚烟酸酯维生素E、DL-泛醇、D-泛醇、泛酸醇乙基醚等)等也包含于本发明中所使用的脂溶性维生素。

作为所述聚合肽，只要可调配于化妆品中的，即可随意使用，但优选地，可例举有胶原蛋白、水解胶原蛋白、明胶、弹性蛋白、水解弹性蛋白、角蛋白等。所述聚合肽可通过常规方法提纯获得，例如纯化微生物培养液的方法、酶方法或化学合成方法等或者通常可从猪或牛等的真皮、蚕丝纤维等的天然物质提纯使用。

所述聚合多糖只要可调配于化妆品中的，即可随意使用，但优选地，可例举有羟乙基纤维素、黄原胶、硫酸软骨素或其盐(钠盐等)等。例如，硫酸软骨素或其盐等通常可从哺乳动物或鱼类提纯使用。

作为所述鞘脂，只要可调配于化妆品中的，即可随意使用，但优选地，可例举有神经酰胺、植物鞘氨醇、神经鞘糖脂(sphingoglycolipid)等。所述鞘脂通常可通过常规方法从哺乳类、鱼类、贝类、酵母或植物等提纯或通过化学合成法取得。

作为所述海藻提取物，只要可调配于化妆品中的，即可随意使用，但优选地，可例举有褐藻提取物、红藻提取物、绿藻提取物等，并且从它们的海藻提取物提纯的角叉菜胶、藻酸、藻酸钠、藻酸钾等也包含在本发明所使用的海藻提取物中。海藻提取物可通过常规方法由海藻提纯获取。

与所述必要成分一同，根据需要，向本发明的化妆品中可调配用于调配常规化妆品的其他成分。

作为除此之外可添加的调配成分，可例举有油脂成分、保湿剂、润肤剂、紫外线吸收剂、pH调节剂、香料、血液循环促进剂、冷却剂、止汗剂、纯净水等。

作为所述油脂成分，可例举有酯类油脂、烃类油脂、硅类油脂、氟类油脂、动物油脂、植物油脂等。

作为所述酯类油脂，可列举有三-2-乙基己酸甘油基、2-乙基己酸十六烷基酯、肉豆蔻酸异丙酯、肉豆蔻酸丁酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸乙酯、棕榈酸辛酯、异十六烷基异硬脂酸酯、硬脂酸丁酯、亚油酸乙酯、亚油酸异丙酯、油酸乙酯、肉豆蔻酸异冰片、异硬脂酸肉豆蔻酸酯、异硬脂酸棕榈酸酯、十八烷基十四烷基酯、异十六烷基异硬脂酸酯、癸二酸二乙酯、己二酸二异丙酯、异新戊酸酯、三(辛酸，癸酸)甘油、三羟甲基丙烷三-2-乙基己酸酯、三羟甲基丙烷三异硬脂酸酯、四-2-乙基己酸季戊四醇、辛酸十六烷基酯、月桂酸癸基酯、月桂酸己基酯、肉豆蔻酸癸基酯、肉豆蔻酸肉豆蔻基酯、肉豆蔻酸鲸蜡酯、硬脂酸硬脂酸酯、癸油酸酯、十六烷基蓖麻油酸酯、月桂酸异硬脂酰、肉豆蔻酸异十三醇、异槲皮素棕榈酸酯、硬脂酸辛酯、异十六烷基硬脂酸酯、异癸基油酸酯、辛基十二烷基油酸酯、亚油酸辛基十二烷基酯、异硬脂酸异丙酯、2-乙基己酸十六烷基硬脂酸酯、2-乙基己酸硬脂醇、己基异硬脂酸酯、乙二醇二辛酸酯、乙二醇二油酸酯、二羧酸丙二醇、丙二醇二辛酸酯、二羧酸新戊二醇、新戊二醇二辛酸酯、三羧酸甘油基、十三烷酸甘油基、三异棕榈酸甘油基、三异硬脂酸甘油基、新戊酸辛基十二烷基、辛酸异硬脂酰、异壬酸辛酯、己基癸基新癸酸酯、新癸酸辛基十二烷基、异十六烷基异硬脂酸酯、异硬脂酸异硬脂酸酯、辛基癸基异硬脂酸酯、聚甘油油酸酯、聚甘油异硬脂酸酯、柠檬三异氰酸酯、三异羧酸、柠檬酸三异辛酯、乳酸月桂基酯、乳酸肉豆蔻基、乳酸鲸蜡酯、辛基癸基乳酸盐、柠檬酸三乙酯、柠檬酸乙酰基三乙酯、乙酰基柠檬酸三丁酯、柠檬酸三辛酯、二异硬脂基苹果酸酯、2-乙基己基羟基硬脂酸酯、二-2-乙基己基琥珀酸酯、己二酸二异丁酯、二异丙基癸二酸酯、二辛基癸二酸酯、硬脂酸胆固醇、胆固醇异硬脂酸酯、羟基硬脂酸胆固醇、油酸胆固醇酯、油酸二氢胆固醇、异硬脂酸植物甾醇，油酸植物甾醇，异十六烷基12-硬脂酰羟基硬脂酸酯、硬脂酰12-硬脂酰羟基硬脂酸酯、12-硬脂酰羟基硬脂酸异硬脂等的酯类等。

作为所述烃类油脂，可例举有角鲨烯、液体石蜡、α-烯烃低聚物、异构烷烃、地蜡、石蜡、流动异构烷烃、聚丁烯、微晶蜡、凡士林等的烃类油脂等。

作为所述硅类油脂，可例举有聚甲基硅、甲基苯基硅、甲基环聚硅氧烷、八甲基聚硅氧烷、十甲基聚硅氧烷、十二甲基环硅氧烷、二甲基硅氧烷甲基硅氧烷氧基硅氧烷共聚物、二甲基硅氧烷甲基硬脂氧基硅氧烷共聚物、烷基改性硅油、氨基改性硅油等。

所述氟类油脂，可例举全氟聚醚等。

作为所述动物或植物油脂，可例举鳄梨油、杏仁油、橄榄油、芝麻油、米糠油、大豆油、玉米油、油菜花油、杏仁油、棕榈仁油、棕榈油、蓖麻油、葵花籽油、葡萄籽油、棉籽油、椰子油、黄瓜坚果油、小麦胚芽油、米胚芽油、乳木果油、月见草油、澳洲坚果油、蛋黄油、牛油、马油、水貂油、深海鱼油、荷荷巴油、小烛树蜡、巴西棕榈蜡、液体羊毛脂、氢化蓖麻油(HydrogenatedCastor Oil)等的动物或植物油脂。

作为所述保湿剂，可例举水溶性低分子量保湿剂、脂溶性分子保湿剂、水溶性高分子、脂溶性高分子等。

作为所述水溶性低分子保湿剂，可例举丝氨酸、谷氨酰胺、山梨糖醇、甘露醇、吡咯烷酮-羧酸钠、甘油、丙二醇、1，3-丁二醇、乙二醇、聚乙二醇B(聚合度n＝2以上)、聚丙二醇(聚合度n＝2以上)、聚甘油B(聚合度n＝2以上)、乳酸、乳酸盐等。

作为所述脂溶性低分子保湿剂，可例举胆固醇、胆固醇酯等。

作为所述水溶性高分子，羧基乙烯基聚合物、聚天冬氨酸盐、黄芪胶、黄原胶、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、水溶性壳多糖、壳聚糖、糊精等。

作为所述脂溶性高分子，可例举聚乙烯吡咯烷酮二十碳烯共聚物、聚乙烯吡咯烷酮十六烯共聚物、硝基纤维素、糊精脂肪酸酯、聚合硅等。

作为所述润肤剂，可例举长链酰基谷氨酸胆固醇酯、羟基硬脂酸胆固醇酯、12-羟基硬脂酸、硬脂酸、松香酸、羊毛脂脂肪酸胆固醇酯等。

作为所述紫外线吸收剂，可例举对氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸乙酯、对氨基苯甲酸戊酯、对氨基苯甲酸辛酯、乙二醇水杨酸酯、水杨酸苯酯、水杨酸苄酯、水杨酸丁基苯酯、水杨酸长庚酯、肉桂酸苄酯、对甲氧基肉桂酸2-乙氧基乙酯、甲基丙烯酸辛酯、二对甲氧基肉桂酸单-2-乙基己烷甘油基、对甲氧基肉桂酸异丙酯、二异丙基-二异丙基肉桂酸酯混合物、尿甘露酸、尿酸乙酯、羟基甲氧基二苯甲酮、羟基甲氧基二苯甲酮磺酸及其盐、二羟甲氧基二苯甲酮、二羟甲氧基二苯甲酮二磺酸钠、二羟基二苯甲酮、四羟基二苯甲酮、4-叔丁基-4'-甲氧基二苯甲酰甲烷、2，4，6-三油基-对-(碳-2'-乙基己基-1'-氧基)-1，3，5-三嗪、2-(2-羟基-5-甲基苯基)苯并三唑等。

作为所述pH调节剂，可例举柠檬酸、柠檬酸钠、苹果酸、苹果酸钠、富马酸、富马酸钠、琥珀酸、琥珀酸钠、氢氧化钠、磷酸一氢钠等。

并且，除此之外还可添加的调配成分不限定于此，并且，所述任一种成分也在不损伤本发明的目的及效果的范围内进行调配，但相对于总重量，优选地，为0.01重量份至5重量份，更优选地，可调配为0.01重量份至3重量份。

含有本发明的组合物所制备的化妆品可具有溶液、乳化物、粘性混合物等的形态。

并且，除了所述成分之外，作为有效成分，包含在本发明的所述化妆品组合物中的成分还可包含通常包含于化妆品组合物中的多种成分，例如，稳定剂、颜料及天然香料等的常规佐剂及载体。

本发明的组合物能够以各种方式利用于具有改善皮肤皱纹的效果的化妆品或洁面剂等。

作为可添加本发明的组合物的产品为例如，润肤液、柔肤水、爽肤水、收敛水、乳液、润肤乳液、保湿乳液、滋养乳液、按摩霜、滋养霜、保湿霜、护手霜、粉底、精华素、营养精华素、膜等的化妆品类和皂剂、洁面泡沫、洁面乳、洁面霜、润肤霜、女性清洁剂、洗手液及洁肤剂等。

在膏状、霜剂或凝胶剂的情况下，本发明的剂型作为载体成分，可利用动物纤维、植物纤维、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌等。

当本发明的剂型为粉剂或喷剂时，作为载体成分，可利用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末，尤其，在喷剂的情况下，还可包含如氯氟烃、丙烷、丁烷或二甲醚等的推进剂。

当本发明的剂型为溶液或乳状液时，作为载体成分，利用溶剂、溶剂化剂或乳剂化剂，例如，具有水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇油、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇或山梨糖醇的脂肪酸酯。

当本发明的剂型为悬浮液时，作为载体成分，可利用如水、乙醇或丙二醇等的液态稀释剂、乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯及如聚氧乙烯山梨糖醇酯等的悬浮剂、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄芪胶等。

根据本发明的另一实施方式，本发明提供包含糖酵解酶处理木槿提取物作为有效成分的用于改善皮肤皱纹的药学组合物。

在本发明一具体例中，优选地，所述糖酵解酶为选自由半纤维素酶(hemicellulase)、果胶酶(pectinase)、葡萄糖苷酶(glucosidase)及丹宁酸酶(tannase)组成的组中的一种以上的酶。并且，可单独使用多个所述酶或者还可通过复合这些酶来使用。

在本发明的另一具体例中，优选地，所述糖酵解酶为由果胶酶及半纤维素酶混合而成的酶，其中，以重量比为基准，优选混合比例为果胶酶对半纤维素酶为1：1至1：5或果胶酶对半纤维素酶为1：1至5：1。当未满足所述混合比例时，糖酵解酶处理木槿提取物中的有效活性成分的含量相对减少。

并且，本发明的用于改善皮肤皱纹的药学组合物的特征在于，所述糖酵解酶处理的木槿提取物可使I型前胶原蛋白质的表达增加并使基质金属蛋白酶-1及抑制基质金属蛋白酶-3的蛋白质的表达。

本发明的组合物还可包含通常用于药学组合物的制备的适当的载体、赋形剂及稀释剂。

本发明的组合物的药学给药形态还可用于它们的药学上可接受的盐的形态，并且可单独或与其他药学活性化合物相结合而使用。

作为可包含在本发明的组合物中的载体、赋形剂及稀释剂，可例举有乳糖、右旋糖、蔗糖、低聚糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油。

当对本发明的组合物进行制剂化时，利用通常所使用的填充剂、增量剂、粘合剂、保湿剂、崩解剂、表面活性剂来制备。

本发明的组合物作为可适用于皮肤的皮肤外用药剂剂型，能够以霜剂、凝胶剂、贴片、喷雾剂、软膏剂、膏药、洗剂、搽剂、糊剂及泥敷剂的皮肤外用药剂形态直接施用于皮肤，但不限定于此。

本发明的混合组合物的优选剂量根据患者的状态及体重、疾病的程度、药物形态、给药途径及期间而不同，但可由本发明所属技术领域的普通技术人员来适当选择，优选地，能够以0.01μg/mL至25μg/mL的用量给药。外用剂量可以为一日一次，还可分为数次给药。

本发明的化妆品及药学组合物其本身具有对改善皮肤皱纹、抗氧化及炎症的效果，因此可直接用作改善皮肤皱纹的组合物，也能够以与含有具有改善皮肤皱纹的效果的天然提取物的其他成分混合使用的形态，因此预期可进一步提高以往所使用的材料的皮肤皱纹改善效果。

发明的效果

如上所述说明，本发明的包含糖酵解酶处理木槿提取物作为有效成分的组合物在人真皮成纤维细胞中抑制基质金属蛋白酶-1及基质金属蛋白酶-3的表达并增加I型前胶原的生成，从而呈现出预防皮肤皱纹的产生并改善受损的皮肤的皱纹的功效。

并且，本发明的组合物对预防或改善或治疗皮肤老化及皮肤炎症的功效优秀。

并且，本发明的组合物为源自天然产物的物质，因而无毒性，从而作用于人体也不引起副作用，因此在化妆品、医药外用品、食品或药学组合物方面上的利用度高。

附图说明

图1为示出糖酵解酶处理的木槿提取物及未经酶处理的木槿提取物对细胞生存的影响的图表。

图2为对糖酵解酶处理的木槿提取物和未经酶处理的木槿提取物的色谱(Chromatography)分析结果进行比较的图表。

图3为对糖酵解酶处理的木槿提取物及未经酶处理的木槿提取物的自由基消除活性效果(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼测定(DPPH assay))进行比较的图表。

图4为对糖酵解酶处理的木槿提取物及未经酶处理的木槿提取物的抗炎症活性进行比较的图表。

图5为比较照射紫外线B的人成纤维细胞中的糖酵解酶处理木槿提取物和未经酶处理的木槿提取物对基质金属蛋白酶-1的蛋白质表达的影响的图表。

图6为对比照射紫外线B的人成纤维细胞中的糖酵解酶处理木槿提取物和未经酶处理的木槿提取物对I型前胶原蛋白质的表达的影响的图表。

图7为比较实施例1的糖酵解酶处理木槿提取物与比较例2及3的用其他酶进行处理的木槿提取物的自由基消除活性效果(ABTS assay)的图表。

图8为比较照射紫外线B的人成纤维细胞中的实施例1的糖酵解酶处理木槿提取物和比较例2及3的用其他酶进行处理的木槿提取物对基质金属蛋白酶-1蛋白质表达的影响的图表。

具体实施方式

以下，通过实施例来进一步详细说明本发明。这些实施例仅用于例示本发明，因此不应被解释为本发明的范围受这些实施例限定。

实施例：酶处理的木槿提取物的制备

实施例1.酶(果胶酶及半纤维素酶的重量比为1：1)处理的木槿提取物的制备

用纯化水清洗木槿的茎及根皮1kg，干燥之后，粉碎，使之细末化之后取得了粉末。经粉末化的木槿中加入10倍重量的乙醇之后，搅拌一晚，然后用乙醇溶剂提取之后，过滤，将冻干上清液之后，取得提取物。所取得的提取物中添加10倍体积的水之后，利用1M的HCl和1M的NaOH来将溶液调节为pH5至8之间。其中，以相对于木槿粉末的重量的10％来添加酶(果胶酶及半纤维素酶以1：1的重量比混合，BISION Coporation，韩国)。并且，将添加了酶的溶液放入恒温水槽，在60℃温度条件下搅拌24小时，使得与酶反应。反应结束后，重新添加14倍重量的100％乙醇之后，搅拌一晚，提取之后过滤，冻干其上清液，并利用于实施例中。

实施例2.经酶(半纤维素酶)处理的木槿提取物的制备

代替在所述实施例1中的作为酶的以1：1重量比混合的果胶酶及半纤维素酶而单独使用半纤维素酶之外，以相同的方法制备了木槿提取物。

比较例1.未经酶处理的木槿提取物的制备

除了未经所述实施例1中使用酶来进行处理的过程之外，以相同的方法制备了木槿提取物。

比较例2.酶(糖化酶)处理的木槿提取物的制备

代替在所述实施例1中的作为酶的以1：1重量比混合的果胶酶及半纤维素酶而使用糖化酶之外，以相同的方法制备了木槿提取物。

比较例3.酶(乳糖酶)处理的木槿提取物的制备

代替在所述实施例1中的作为酶的以1：1重量比混合的果胶酶及半纤维素酶而使用乳糖酶之外，以相同的方法制备了木槿提取物。

实验例1.木槿提取物对皮肤成纤维细胞中的细胞生长的影响效果的验证

以如下方法确认了木槿提取物对人皮肤成纤维细胞(NHDF，normal humandermalfibroblasts)的生长的效果。

首先，在40mM大小的细胞培养皿中以1.2×10⁵浓度向作为包含10％胎牛血清(FBS，fetal bovine serum，Cambrex)的专用培养基的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM，Dulbeccos modified Eagles medium)中接种皮肤成纤维细胞之后，在37℃温度、5％的CO₂湿润条件下培养了24小时。然后，去除培养基，添加300μl容量的磷酸缓冲盐溶液(PBS)，照射紫外线B(紫外线B峰值范围：312nm，紫外线(dose)：144mJ/cm²)之后，将以无血清杜尔贝科改良伊格尔培养基稀释的实施例1的酶处理木槿提取物按照各个浓度(1、10及100μg/mL)处理并培养了72小时。72小时之后，处理1mg/mL的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)，2小时之后，将通过MTT处理生成的甲瓒(formazan)用二甲基亚砜(DMSO)溶解之后，在570nm下测定了吸光度。

其结果，对人皮肤成纤维细胞处理了实施例1的糖酵解酶处理的木槿提取物之后，发现酶处理的木槿提取物未对人皮肤成纤维细胞的细胞生存率产生影响，由此可确认酶处理的木槿提取物对人体不呈现出毒性(参照图1)。

实验例2.酶处理的木槿提取物和木槿提取物的成分比较分析

使用色谱设备将所述实施例1及比较例1中所制备的提取物成分按照下列表1的条件进行了分析。

表1

其结果，可确认了实施例1的酶处理的木槿提取物与比较例1的未经酶处理的木槿提取物相比，在停留时间5分钟至10分钟所检测到的成分的量相对增加(图2)。

实验例3.酶处理的木槿提取物的自由基消除活性效果(DPPH assay)验证

根据利用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，西格玛(Sigma)公司，美国)的还原能力的相等的记载于文献(Sang S et al.，J.Agric.FoodChem.50(8)，p2459-2463，2002)中的方法，测定了本发明的酶处理的木槿提取物的抗氧化活性。

将溶解于甲醇的0.2mM的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼溶液180ul和溶解于蒸馏水20ul中的木槿提取物(阴性对照组)、糖酵解酶处理的木槿提取物及熊果苷(阳性对照组)(1μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、250μg/mL)放入96-微孔板，在37℃温度条件下培养30分钟之后，将还原的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼的量利用分光光度计(Precisionmicroplate reader；美谷分子仪器(Molecular Devices)，VersaMax)在520nm测定吸光度，并与未添加试样的无添加对照组比较了活性。所述实验重复三次进行。

其结果，参照图3及下列表2，糖酵解酶处理的木槿提取物与未经酶处理的木槿提取物相比，分别处理1μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、250μg/mL容量时，可观察到271％、136％、308％、422％及249％得以改善的优秀的抗氧化效果，并且这种抗氧化效果的数值呈现出几乎与作为阳性对照组的熊果苷相同的效果。

表2

木槿提取物及酶处理的木槿提取物的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼实验结果

处理浓度	1μg/mL	10μg/mL	50μg/mL	100μg/mL	250μg/mL
						比较例1(吸光度)	0.811	1.59	1.09	5.89	16.4
实施例1(吸光度)	2.20	2.17	3.38	24.8	40.7
						酶处理后功效改善率	271％	136％	308％	422％	249％

实验例4.酶处理的木槿提取物的自由基消除活性效果(总抗氧化能力检测试剂盒 (ABTS assay))验证

将磷酸缓冲盐溶液作为溶剂，来制备1.0mM的ABTS(2，2-偶氮二异丁脒盐酸盐-(2-脒基丙烷)盐酸)(2，2-azobis-(2-amidinopropane)HCl)与2.5mM的ABTS(2，2-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐)(2，2-azino-bis(3-ethylbenzthiazol-line-6-sulfonicacid)diammoniumsalt)混合溶液，在70℃反应30分钟之后，常温下缓慢冷却。之后，利用0.45μm的PVDF注射器过滤器(SmartiLAB，韩国)过滤溶液的上清液，在确认滤液的吸光度为734nm的0.650±0.020之后，用于实验中。

将实施例1的酶处理的木槿提取物分别按照1μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、250μg/mL的浓度制备并分注于96-孔板之后，与ABTS溶液混合阻挡光之后，在37℃下反应10分钟，然后，微孔板阅读器(MolecularDevices FilterMax F5；旧金山，加利福尼亚州，美国)在734nm下测定了吸光度。此时，以相同浓度处理作为周知的抗氧化物质的熊果苷来用作阳性对照组，试样的抗氧化能力通过求出无添加组的吸光度并以百分率如下示出。

从所述实验结果观察到了实施例1的酶处理的木槿提取物的自由基消除活性呈现出几乎与作为阳性对照组的熊果苷相同的效果。并且，为了比较本发明中所使用的木槿提取物的自由基消除活性效果，对实施例1的糖酵解酶处理木槿提取物和糖化酶处理的比较例2及乳糖酶处理的比较例3的木槿提取物的ABTS进行比较之后在图7中示出。从图7的所示内容可确认到本发明中所使用的糖酵解酶处理的木槿提取物与糖化酶或乳糖酶处理的木槿提取物相比，具有优秀的自由基消除活性，并呈现出也几乎与熊果苷相同的效果。

实验例5.基质金属蛋白酶-1及基质金属蛋白酶-3的蛋白质的合成的抑制

在40mM的细胞培养皿中放入2mL的DMEM培养液，并约以1.2×10⁵的浓度接种人成纤维细胞之后，37℃温度下5％的CO₂环境下培养了24小时。然后，将紫外线B以144mJ/cm²条件照射之后，替换为包含实施例1中所制备的糖酵解酶处理的木槿提取物(分别为10μg/m及100μg/mL)的培养基之后培养了3天。然后，回收培养液(harvest)，在4℃温度，7500rpm环境下，离心分离(centrifuge)5分钟，并利用ELISA方法来确认了基质金属蛋白酶-1及基质金属蛋白酶-3(HumanTotalMMP-1kit，R&D Systems，Inc.，Minneapolis，MN，USA)的蛋白质表达量的变化。

以144mJ/cm²容量照射紫外线之后，与无紫外线处理组相比，人成纤维细胞的基质金属蛋白酶-1及基质金属蛋白酶-3蛋白质的生成分别增加了2倍及3倍。通过这种紫外线照射处理的基质金属蛋白酶-1及基质金属蛋白酶-3的蛋白质的生成增加，因糖酵解酶处理的木槿提取物的处理而呈现出了减少的现象(图4及图5)。其中，在基质金属蛋白酶-1的蛋白质的情况下，分别在1μg/mL、10μg/mL及100μg/mL容量下呈现出45％、53％及91％的表达抑制效果，在基质金属蛋白酶-3的蛋白质的情况下，分别在1μg/mL、10μg/mL及100μg/mL容量下呈现出50％、67％及85％得以改善的蛋白质表达抑制效果，并且将此结果分别在表3及表4中示出。

表3

木槿提取物及酶处理的木槿提取物的基质金属蛋白酶-1的蛋白质的合成抑制的实验结果

处理浓度	1μg/mL	10μg/mL	100μg/mL
				比较例1(pg/ml)	13456	10543	8546
实施例1(pg/ml)	7803.181	6654.074	1306.355
				酶处理后功效改善率	45％	53％	91％

表4

木槿提取物及酶处理的木槿提取物的基质金属蛋白酶-3的蛋白质的合成抑制实验结果

处理浓度	1μg/mL	10μg/mL	100μg/mL
				比较例1(pg/ml)	2691.87	2429.77	1005.38
实施例1(pg/ml)	1602.5	1057.6	475.4
				酶处理后功效改善率	50％	67％	85％

通过如上所述的结果可知，本发明的糖酵解酶处理的木槿提取物有效地抑制作为皱纹生成的原因的基质金属蛋白酶-1及基质金属蛋白酶-3的蛋白质的表达，并且能够用于有效地预防及改善皮肤皱纹中。

并且，为了比较确认本发明所使用的糖酵解酶的活性，对照射紫外线B的人成纤维细胞中的实施例1的糖酵解酶处理木槿提取物和糖化酶处理的比较例2及乳糖酶处理的比较例3的木槿提取物对基质金属蛋白酶-1的蛋白质表达的影响进行比较，并在图8中示出。从图8的内容可确认到，与糖化酶或乳糖酶处理的木槿提取物相比，本发明所使用的糖酵解酶处理的木槿提取物可更有效地抑制基质金属蛋白酶-1蛋白质的表达。

实验例6.I型前胶原蛋白质的合成的促进

在40mM的细胞培养皿中放入2mL的DMEM培养液，并以约1.2×10⁵的浓度接种人成纤维细胞之后，在37℃温度，5％的CO₂环境下培养了24小时。然后，以144mJ/cm²条件照射紫外线B之后，替换为包含实施例1所制备的糖酵解酶处理的木槿提取物(分别为10μg/mL及100μg/mL)的培养基并培养了三天。之后，回收(harvest)培养液，在4℃温度，7500rpm环境下离心分离(centrifuge)5分钟，利用ELISA方法来确认了I型前胶原(Procollagen Type IC Peptide EIA Kit，Takara，Shiga，Japan)的蛋白质表达量的变化。

以144mJ/cm²容量照射紫外线的人成纤维细胞与无紫外线处理组相比，I型前胶原蛋白质的生成减少了2.1倍。如此，通过紫外线照射处理的I型前胶原蛋白质的生成减少呈现出了通过木槿提取物的处理而重新增加的现象。

此时，糖酵解酶处理的木槿提取物处理组比未经酶处理的组呈现出显著增加效果，在分别为10μg/mL及100μg/mL容量下呈现出130％及177％的I型前胶原蛋白质的生成增加效果(图6)。

通过如上所述的结果可确认如下，即，本发明的包含糖酵解酶处理的木槿提取物的用于改善皮肤皱纹的组合物具有等同于熊果苷的抗氧化效果，并作用于TGF-β/Smad信号传递体系中来促进I型前胶原的生成，从而具有通过抑制作为胶原蛋白分解酶的基质金属蛋白酶-1及基质金属蛋白酶-3的蛋白质的表达的作用来有效地预防皱纹生成并改善所生成的皱纹的效果。

以上，对本发明的特定部分进行了详细说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员这种具体叙述仅为优选实例，本发明的范围并不由此而受限是显而易见的。

因此，本发明的实质上的范围应由所附的权利要求范围及其的等同替代物来进行定义。

产业上的可利用性

本发明的组合物对预防或改善或治疗皮肤老化及皮肤炎症的功效优秀，并且因其源自天然产物的物质而无毒性，从而作用于人体也不引起副作用，因此在化妆品、医药外用品、食品或药学组合物方面上的利用度高。

Claims (11)

1.一种用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物，其特征在于，包含糖酵解酶处理的木槿提取物作为有效成分。

2.根据权利要求1所述的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物，其特征在于，所述糖酵解酶为选自由半纤维素酶、果胶酶、葡萄糖苷酶及丹宁酸酶组成的组中的一种以上的酶。

3.根据权利要求1所述的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物，其特征在于，所述糖酵解酶为由果胶酶及半纤维素酶混合而成的酶。

4.根据权利要求1所述的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物，其特征在于，所述糖酵解酶处理的木槿提取物使I型前胶原蛋白的表达增加并抑制基质金属蛋白酶-1及基质金属蛋白酶-3蛋白质的表达。

5.根据权利要求1所述的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物，其特征在于，所述组合物还包含选自洋甘菊花提取物、迷迭香叶提取物、朝鲜白头翁叶提取物、须松萝提取物、人参提取物、老鹳草花提取物、苦参提取物、羽衣草提取物、麝香草提取物、荨麻提取物、西洋蓍草提取物、丁香提取物、茴香提取物、番木瓜叶提取物、向日葵提取物、桉树提取物及欧白芷提取物中的一种以上的植物提取物。

6.根据权利要求1所述的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物，其特征在于，所述用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物为选自润肤液、柔肤水、爽肤水、收敛水、乳液、润肤乳液、保湿乳液、滋养乳液、按摩霜、滋养霜、保湿霜、护手霜、粉底、精华素、营养精华素、膜剂、皂剂、洁面泡沫、洁面乳、洁面霜、润肤霜、女性清洁剂、洗手液及洁肤剂中的一种剂型。

7.一种用于改善皮肤皱纹的药学组合物，其特征在于，包含糖酵解酶处理的木槿提取物作为有效成分。

8.根据权利要求7所述的糖酵解酶药学组合物，其特征在于，所述糖酵解酶为选自由半纤维素酶、果胶酶、葡萄糖苷酶及丹宁酸酶组成的组中的一种以上的酶。

9.根据权利要求7所述的用于改善皮肤皱纹的药学组合物，其特征在于，所述糖酵解酶为由果胶酶及半纤维素酶混合而成的酶。

10.根据权利要求7所述的用于改善皮肤皱纹的药学组合物，其特征在于，所述糖酵解酶处理木槿提取物使I型前胶原蛋白的表达增加并抑制基质金属蛋白酶-1蛋白质的表达。

11.根据权利要求7所述的用于改善皮肤皱纹的药学组合物，其特征在于，所述用于改善皮肤皱纹的药学组合物为选自霜剂、凝胶剂、贴片、喷雾剂、软膏剂、膏药、洗剂、搽剂、糊剂及泥敷剂中的一种剂型。