KR101924956B1

KR101924956B1 - 효소 처리된 무궁화 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 조성물

Info

Publication number: KR101924956B1
Application number: KR1020180004424A
Authority: KR
Inventors: 이태후; 박설웅; 양정은; 황은선; 박상용; 김슬아
Original assignee: (주)에스디생명공학
Priority date: 2017-03-07
Filing date: 2018-01-12
Publication date: 2018-12-04
Also published as: CN108834400B; WO2018164369A1; KR20180102485A; CN108834400A

Abstract

본 발명은 당분해 효소 처리된 무궁화 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 인간 진피 섬유 아세포들에서 MMP-1 단백질의 발현을 억제하고, 타입 Ⅰ 프로콜라겐의 생성을 증가시킴으로써, 피부 주름의 발생을 예방하고, 손상된 피부의 주름을 개선하는 효능을 나타낸다. 종합적으로, 본 발명의 조성물은 피부 주름을 예방하고 크게 개선시킬 수 있다.

Description

효소 처리된 무궁화 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 조성물{Composition for Improving Skin Wrinkle Comprising Mugunghwa Extract Treated by Enzyme as an Active Ingredient}

본 발명은 피부 주름 개선용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 효소 처리된 무궁화 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 조성물에 관한 것이다.

피부 주름은 피부 수분함량, 콜라겐 함량 및 외부 환경에 대한 면역력 등 여러 가지 요소들에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있으며, 이중 주름의 형성에 가장 큰 영향을 미치는 것은 콜라겐의 생성량 및 콜라겐 분해 효소인 콜라게네이즈의 발현과 활성이다.

콜라겐은 피부 진피층에 존재하는데, 피부 전체 건조 중량의 약 70 내지 80%를 차지하는 엘라스틴과 함께 피부에 탄력을 부여하는 주요 성분으로 알려져 있다. 콜라겐은 자연 노화에 따른 세포활성 저하와 같은 내부 요인에 의해 감소되고, 여러 유해 환경에서의 스트레스 증가나 태양 광선에 의한 활성 산소 종의 증가와 같은 외부 요인에 의하여 생합성이 감소되거나, 분해가 촉진되고 있다.

한편, 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 과생산은 UVB 노출 환경에서 보고된 바 있고, UVB 노출과 연관된 신호전달 체계는 MAPKs(mitogen activated protein kinases), ERK(extracellular signal-regulated kinase), p38 카이나아제, 및 JNK(c-Jun amino-terminal kinase) 등의 단백질과 관련되어 있는데, NF-B 및 AP-1 전사인자의 발현증가를 유도한다. 또한, AP-1 단백질은 MMP(matrix metalloproteinase) 유전자의 활성과 관련되어 있고, NF-B 단백질은 인터루킨과 같은 전염증 사이토카인(proinflammatory cytokines)의 발현에 영향을 미친다.

노화된 피부에서 콜라겐 및 엘라스틴의 붕괴는 주로 MMP 단백질과 같은 그 분해 효소의 증가된 발현에 의해 야기된다. 또한, 전염증 사이토카인은 콜라겐의 합성을 방해하고, 콜라겐의 붕괴를 촉진시킨다. 타입 I 콜라겐은 연결 조직의 세포외 기질에서 가장 풍부한 단백질이다. 세포외 기질에는 타입 III, V, 및 VII 콜라겐, 엘라스틴, 프로테오글라이칸, 파이브로넥틴과 같은 다른 유형의 단백질을 포함한다.

타입 I 콜라겐 단백질의 발현 수준을 조절하는 것은 피부 광노화를 예방하는데 있어서 가장 중요한 인자이다. UVB의 조사는 TGF-β/Smad 신호전달 체계의 억제를 통해 피부 섬유아세포에서 콜라겐 전구체인 프로콜라겐(procollagen)의 발현을 감소시키게 된다. 또한, TGF-β1 신호전달 체계는 인간 피부 섬유아세포에서 세포외 기질의 합성을 조절하는 중요한 인자의 하나이다.

따라서, AP-1 및 MAPKs 인자에 의해 조절되는 활성산소종(ROS)의 생성, 및 MMPs, ILs, TGF-β, 및 타입 I 프로콜라겐의 발현은 피부 광노화 연구에 있어서 유용한 마커로 작용한다.

이와 같이 콜라겐 감소를 저해하여 피부 주름개선에 효과가 있는 천연물질을 탐색하고자 하는 여러 다양한 시도가 있었다. 콜라겐의 주름개선 효과를 이용하기 위하여 화장품 또는 연고 등과 같은 피부외용제 조성물에 콜라겐을 배합한 제품들이 출시되었으나, 이들 제품들은 콜라겐 자체를 피부 표면에 도포하는 것으로 고분자 물질인 콜라겐의 경피 흡수가 어려워 본질적인 주름개선 효과를 나타낼 수 없었다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 콜라겐합성 촉진물질에 대한 관심이 높아졌으며, 종래 알려진 콜라겐합성 촉진물질로는 비타민C, 레티노익산, 형질전환생장인자(transforming growth factor, TGF), 동물태반 유래의 단백질(JP8-231370), 베툴린산(betulinic acid, JP8-208424), 클로렐라 추출물(JP9-40523, JP10-36283, 섬유아세포 증식 촉진작용) 등이 있다.

그러나 상기 물질은 피부 적용시 자극과 발적 등 안전성 문제로 사용량에 제한이 있거나 그 효과가 미미하여 실질적으로 주름개선 효과를 기대할 수 없다는 문제점이 있었다. 따라서 종래 피부 주름 개선용 조성물보다 생체에 안전하고 항산화 효과, 피부 염증개선 효과, 및 주름개선 효과가 높은 새로운 조성물의 개발이 절실히 요구되고 있다.

한편, 우리나라의 국화인 무궁화(Mugunghwa; Hibiscus syriacus L.)는 국내에서만 약 200여종이 있는 것으로 알려져 있으며, 목근피(Hibisci cortex)는 무궁화의 뿌리 및 줄기 껍질부분으로 예로부터 한방에서 소염, 항균 등의 효능을 가진 약용식물로 이용되어 왔다. 하지만, 무궁화가 우리나라의 국화임에도 불구하고 현재까지 국내에서는 무궁화의 재배 및 육종에 대한 연구만 주로 이루어지고 있으며, 무궁화를 이용한 다양한 생리활성 연구가 미흡하고, 특히 생활 속에 적용 가능한 기능성화장품 또는 식품 등의 원료로서 개발 가능한 연구 결과는 거의 없다.

최근 천연물에 생물전환기술을 적용하여 다양한 기능성 원료를 개발하기 위한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 이러한 생물전환 기술은 천연물의 기능성 증대 및 효능 물질을 다량 확보할 수 있다는 장점이 있다.

특허출원 제10-2011-0125087호 ‘한방추출물을 유효성분으로 하는 소양증 개선용 조성물’에는 지황, 석창포, 황백, 고삼, 죽엽, 자초, 편축, 목근피, 관동화, 장군피 및 목과 추출물을 유효성분으로 함유하는 소양증 개선용 조성물이 항염증 효과, 수분 보습 효과 및 주름개선 효과가 있음을 개시하고 있으나, 그 효과는 11가지 한방재료를 복합하여 상기와 같은 효과가 있을 뿐이며, 목근피 단일 조성물 자체가 갖는 피부주름개선의 효과는 전혀 언급되어 있지 않다.

현재까지 무궁화 단일 추출물을 이용하는 경우에는 항산화, 항염증, 또는 피부 주름개선 등에 유효한 효과를 얻기 힘든 것으로 알려져 있다. 이로 인해, 인체에 무해하여 안전하게 사용할 수 있고, 원료를 쉽게 구할 수 있는 장점을 갖는 무궁화를 화장료 조성물의 소재로 활용하기 위해서는 특허출원 제10-2011-0125087호와 같이 다른 식물소재들과 복합하여 사용하여야 하는 문제점이 있었다.

이에, 본 발명자들은 무궁화가 갖는 피부 주름 개선의 효과를 극대화하고, 화장료 조성물의 주원료로 활용하고자 예의 연구 노력한 결과, 무궁화 추출물을 당분해 효소로 처리하는 경우 UVB 조사에 의해 유도된 인간 섬유아세포(human dermal fibroblasts, NHDFs)의 광노화에 대응하여, 항산화, 항염증 및 피부 주름 개선에 뛰어난 효과가 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 효소 처리된 무궁화 추출물을 유효성분으로 하는 피부 주름 개선에 뛰어난 효과를 갖는 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 당분해 효소 처리 무궁화 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 피부 노화 방지, 염증개선, 및 주름 개선 등 피부상태 개선에 효능이 있는 물질을 찾고자 여러 가지 천연물질들 중에서 유효한 물질을 검색한 결과, 당분해 효소 처리된 무궁화 추출물의 피부 주름 개선 효과가 획기적으로 증가함을 발견하였고, 또한 피부에 적용시 안전성에도 문제가 없음을 확인하였다.

본 발명의 "무궁화(Hibiscus syriacus L.)"는 한반도 전역에서 자생하는 쌍떡잎식물 아욱목 아욱과의 낙엽관목을 의미하며, 이러한 무궁화를 추출하고 효소로 처리하는데 있어서, 상기 무궁화 전체 또는 잎, 꽃, 꽃받침, 수술, 암꽃술, 줄기, 뿌리 등의 일부를 사용할 수 있지만, 특별히 제한은 없다. 본 발명의 일 구체예에서는 줄기껍질, 뿌리껍질 또는 이들을 혼합하여 사용할 수 있다. 무궁화 나무의 줄기 및 뿌리껍질을 한방에서는 목근피 또는 천근피라고 지칭하기도 하며, 본 발명의 무궁화 추출물과 목근피 추출물은 동일한 의미로 사용된다.

본 발명에서 사용되는 용어, "추출물"은 식물의 추출 처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다. 본 발명의 상기 추출물은 바람직하게 추출 후 건조 분말 형태로 제조되어 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 무궁화 추출물은, 무궁화의 천연, 잡종 또는 변종 식물로부터 추출될 수 있고, 식물 조직 배양물에서도 추출이 가능하며, 바람직하게는 줄기 및 뿌리의 껍질부위에서 추출될 수 있다.

상기 추출물을 제조하는 방법은 초음파 추출법, 침출법 및 환류 추출법 등 당업계의 통상적인 추출 방법일 수 있다. 추출에 사용되는 용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물이며, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올이지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

추출 용매의 양은 시료의 중량 기준으로 2 내지 50배를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 20배이다. 추출을 위해 시료는 추출 용매에서 침출을 위해 1 내지 72 시간 동안 방치될 수 있으며, 바람직하게는 24 내지 48시간 동안 방치될 수 있다.

본 발명의 용어 "당분해 효소(glycolytic enzyme)"는 해당 반응을 촉매하는 효소를 의미하며, 본 발명에서는 넓은 의미에서 셀룰로오스, 아밀로오스, 탄닌, 펙틴 등의 탄수화물을 분해하는 효소를 의미한다.

본 발명에서, 상기 당분해 효소의 예로는 셀룰라아제(cellulase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase), 펙티나아제(pectinase), 글루코시다아제(glucosidase), 탄나아제(tannase) 효소를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 무궁화 추출물에 존재하는 다당류 형태의 고분자를 분해하는 활성을 갖는 효소이면 본 발명의 당분해 효소에 포함된다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 당분해 효소는 헤미셀룰라아제(hemicellulase), 펙티나아제(pectinase), 글루코시다아제(glucosidase), 및 탄나아제(tannase)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소인 것이 바람직하다. 또한, 상기 효소들은 단독으로 사용하거나, 또는 이들 효소들을 복합 처리하여 사용할 수도 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서 상기 당분해 효소는 펙티나아제 및 헤미셀룰라아제를 혼합한 효소인 것이 바람직하며, 이때 바람직한 혼합비는 중량비를 기준으로 펙티나아제 대 헤미셀룰라아제 1:1 내지 1:5 또는 펙티나아제 대 헤미셀룰라아제 1:1 내지 5:1인 것이 바람직하다. 상기 혼합비를 만족하지 않는 경우, 당분해 효소 처리 무궁화 추출물 중 유효 활성 성분의 함량이 상대적으로 감소한다.

본 발명에서 제시하는 당분해 효소 처리된 무궁화 추출물은 특별한 언급이 없는 한, 상기 예시된 효소 이외에도 해당 반응을 촉매하는 당분해 효소로 처리된 무궁화 추출물을 모두 포함하며, 피부 주름 개선의 소재로 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "피부 주름 개선" 이란 피부 재생, 피부 탄력 개선, 피부 주름 방지 또는 개선, 또는 피부 염증 개선을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "피부 노화" 란 반응성 자유 라디칼 증가에 의해 유발되는 모든 질환을 의미하며, 상기 피부 노화의 비제한적인 예로 주름, 피부의 쳐짐, 탄력성 감소 등을 들 수 있다.

많은 질환상태와 자유라디칼 손상과의 상관관계는 널리 입증되어 있으며 효소, 이온채널, 구조 단백질 및 막지질을 포함하는 많은 세포 구성성분이 반응성 자유 라디칼 종에 대한 잠재적인 표적물이다. 상기 잠재적인 표적물과 자유 라디칼의 반응은 특정범위의 세포기능을 손상시켜 병리학적 변화를 유발하여 궁극적으로 세포를 사멸시킨다.

본 발명의 피부상태 개선용 조성물은 우수한 자유라디칼 제거 효과로 산화적 손상으로부터 DNA, 단백질(지단백질 포함) 및 막지질을 보호한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "피부 재생" 또는 "피부 탄력 개선" 또는 "피부 주름 방지 또는 개선"이란 콜라겐의 생성을 증가시키거나, 콜라겐의 분해를 억제하여 콜라겐 총량을 증가시키는 모든 작용을 의미하며, 본 발명에서 용어, "피부 주름"이란, 피부가 쇠하여 생긴 잔줄을 의미하는데, 유전자에 의한 원인, 피부 진피에 존재하는 콜라겐의 감소, 외부 환경 등에 의해 유발될 수 있다.

본 발명에서 "피부 주름 방지 또는 개선"이란, 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화시키는 것을 말한다.

피부 섬유아세포의 주된 기능으로 세포외기질 합성과 증식을 통한 손상된 피부 조직 재생 등을 들 수 있는데, 광노화와 같은 외인성 노화 요인 또는 유리 산소에 의한 손상 누적, 텔로미어 단절로 인한 세포 노화 등에 따른 내인성 노화 요인들은 진피층 내에 있는 피부섬유아세포의 생리 활성 기능을 저하시키게 된다. 피부 세포외기질 중 95% 이상을 차지하고, 세포의 부착분자(adhesion molecule) 및 세포 골격(cytoskeleton) 등과의 상호 작용과 신호 교류를 통해 섬유아세포의 생리 활성에 매우 주요한 부분을 담당하는 제I형 콜라겐의 합성이 저하될 경우, 피부 조직 내 콜라겐 양이 감소되고, 이에 따라 표면 장력이 감소되어 피부 탄력이 저하되고 피부 주름이 형성될 뿐만 아니라, 세포의 증식 및 재생 기능을 포함하는 생리 활성 기능이 감소하는 악순환의 원인이 된다.

따라서, 피부섬유아세포의 콜라겐은 피부 재생, 피부 탄력, 피부 주름 형성 및 피부 손상 시 조직의 수복 또는 재생과 직접적인 관련이 있다고 볼 수 있다.

즉, 피부 섬유아세포의 콜라겐 또는 프로콜라겐의 합성이 촉진되거나, 콜라겐을 분해하는 기질 단백질 분해효소(matrix metallo-proteinase, 이하 'MMP'라 함)의 합성이 저해되면, 피부 탄력 개선, 피부 재생, 피부 주름 개선, 상처 치유, 손상된 피부 조직의 수복 및 재생; 및 피부 노화 방지 등의 효과를 얻을 수 있다.

본 발명의 당분해 효소 처리 무궁화 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 타입 I 프로콜라겐 단백질의 발현을 증가시키고, MMP-1 단백질 및 MMP-3 단백질의 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.

구체적으로, 본 발명의 상기 효소 처리된 무궁화 추출물을 포함하는 조성물은 자외선 조사된 정상 인간 진피 섬유아세포(NHDF)에서 세포 독성을 저감시키고, 콜라겐 분해를 촉진시키는 MMP-1 및 MMP-3의 발현을 억제시키면서, 타입 Ⅰ 프로콜라겐의 생성을 증가시키는바, 피부 탄력 증가, 피부 재생, 피부 주름 개선, 상처 치유, 손상된 피부 조직의 수복 및 재생; 및 피부 노화 방지 등의 효과 등을 가질 수 있다. 구체적으로는 피부주름의 예방 또는 개선의 효과를 가질 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "개선"이란 상태의 완화 또는 치료와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 피부 주름 개선용 화장료 조성물에 함유된 효소 처리된 무궁화 추출물은 그 자체로 피부 주름 개선에 효과가 있으며, 기존에 알려진 피부 주름 개선에 효과가 있다고 공지된 물질들과 혼합하여 사용하는 경우에도 피부 주름 개선의 효과를 지속적으로 유지할 수 있다.

상기 피부 주름 개선에 효과가 있는 물질로는 이에 제한되지는 않으나, 캐모마일 꽃 추출물, 로즈마리 잎 추출물, 할미꽃 잎 추출물, 어스니어 추출물, 인삼 추출물, 제라늄 꽃 추출물, 고삼 추출물, 성모초 추출물, 타임 추출물, 쐐기풀 추출물, 야로우 추출물, 클로브 추출물, 펜넬 추출물, 파파야잎 추출물, 해바라기 추출물, 유칼립투스 추출물, 및 안젤리카 추출물 등이 있다.

이외에도 본 발명의 화장료 조성물은 수용성 비타민, 지용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스 등을 더 포함할 수 있다.

상기 수용성 비타민으로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것도 될 수 있으나, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염(티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체(아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 상기 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물 배양물의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

상기 지용성 비타민으로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것도 될 수 있으나, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체(팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산dl-알파 토코페롤, 니코틴산dl-알파 토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 지용성 비타민에 포함된다.

상기 고분자 펩티드로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것도 될 수 있으나, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 상기 고분자 펩티드는 미생물 배양액의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견 섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

상기 고분자 다당에는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것도 될 수 있으나, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 콘드로이틴 황산 또는 그 염(나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

상기 스핑고 지질로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것도 될 수 있으나, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당 지질 등을 들 수 있다. 상기 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

상기 해초 엑기스로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것도 될 수 있으나, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조엑기스, 녹조 엑기스 등을 들 수 있으며, 또한, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨 등도 본 발명에서 사용되는 해초 엑기스에 포함된다. 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다.

본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합할 수 있다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 자외선 흡수제, pH 조정제, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한제, 정제수 등을 들 수 있다.

상기 유지 성분으로는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

상기 에스테르계 유지로는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

상기 탄화 수소계 유지로는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로 크리스탈린 왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.

상기 실리콘계 유지로는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산 메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산 메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

상기 불소계 유지로는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

상기 동물 또는 식물 유지로는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 난황유, 우지, 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

상기 보습제로는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

상기 수용성 저분자 보습제로는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

상기 지용성 저분자 보습제로는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

상기 수용성 고분자로는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

상기 지용성 고분자로는 폴리비닐피롤리돈 에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈 헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.

상기 에몰리엔트제로는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

상기 자외선 흡수제로는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

상기 pH 조정제로는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01 내지 5 중량부, 보다 바람직하게는 0.01 내지 3 중량부로 배합될 수 있다.

본 발명의 조성물을 함유하여 제조된 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 안료 및 천연향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 피부 주름 개선의 효과를 갖는 화장품 또는 세안제 등에 다양하게 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩 등과 같은 화장품류와 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 여성청결제, 손세정제, 및 바디클린저 등이 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판, 부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 당분해 효소 처리 무궁화 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 피부 주름 개선용 약학적 조성물에서, 상기 당분해 효소 처리된 무궁화 추출물은 타입 I 프로콜라겐 단백질의 발현을 증가시키고, MMP-1 및 MMP-3 단백질의 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합하여 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명의 조성물은 피부에 적용할 수 있는 피부 외용제 제형으로서 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태로 피부에 직접 투여될 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 혼합 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있으며, 바람직하게는 0.01 ㎍/㎖ 내지 25 ㎍/㎖의 용량으로 투여될 수 있다. 외용투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 화장료 및 약학적 조성물은 그 자체적으로 피부 주름개선, 항산화 및 항염증에 대한 효과가 있으므로 피부 주름 개선용 조성물로 바로 이용될 수 있고, 피부 주름 개선에 효과가 있는 천연 추출물들을 함유하는 다른 성분과 혼합하여 사용하는 형태로도 이용이 가능하여 기존에 사용하고 있는 소재들의 피부 주름 개선 효과를 좀 더 높여줄 수 있을 것으로 기대된다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 당분해 효소 처리 무궁화 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 인간 진피 섬유아세포에서 MMP-1 및 MMP-3의 발현을 억제하고, 타입 Ⅰ 프로콜라겐의 생성을 증가시킴으로써, 피부 주름의 발생을 예방하고, 손상된 피부의 주름을 개선하는 효능을 나타낸다.

또한, 본 발명의 조성물은 피부 노화, 및 피부 염증을 예방하거나 개선 또는 치료하는 효능이 우수하다.

또한, 본 발명의 조성물은 천연물 유래의 물질이어서 독성이 없으며, 인체에 적용하여도 부작용을 유발하지 않아 화장료, 의약외품, 식품 또는 약학 조성물로의 활용도가 높다.

도 1은 당분해 효소 처리된 무궁화 추출물 및 효소 처리되지 않은 무궁화 추출물이 세포 생존에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 2는 당분해 효소 처리된 무궁화 추출물과 효소 처리되지 않은 무궁화 추출물의 Chromatography 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 3은 당분해 효소 처리된 무궁화 추출물 및 효소 처리되지 않은 무궁화 추출물의 라디칼 소거 활성 효과(DPPH assay)를 비교한 그래프이다.
도 4는 당분해 효소 처리된 무궁화 추출물 및 효소 처리되지 않은 무궁화 추출물의 항염증 활성을 비교한 그래프이다.
도 5는 UVB 조사된 인간섬유아세포에서 당분해 효소 처리 무궁화 추출물과 효소 처리되지 않은 무궁화 추출물이 MMP-1 단백질 발현에 미치는 영향을 비교한 그래프이다.
도 6은 UVB 조사된 인간섬유아세포에서 당분해 효소 처리 무궁화 추출물과 효소 처리되지 않은 무궁화 추출물이 타입 I 프로콜라겐 단백질의 발현에 미치는 영향을 비교한 그래프이다.
도 7은 실시예 1의 당분해 효소 처리 무궁화 추출물과 비교예 2 및 3의 기타 효소로 처리된 무궁화 추출물의 라디칼 소거 활성 효과(ABTS assay)를 비교한 그래프이다.
도 8은 UVB 조사된 인간섬유아세포에서 실시예 1의 당분해 효소 처리 무궁화 추출물과 비교예 2 및 3의 기타 효소로 처리된 무궁화 추출물이 MMP-1 단백질 발현에 미치는 영향을 비교한 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 : 효소 처리된 무궁화 추출물의 제조

실시예 1. 효소( 펙티나아제 및 헤미셀룰라아제 1:1 중량비) 처리된 무궁화 추출물의 제조

무궁화의 줄기 및 뿌리 껍질 1kg을 정제수로 세척하고 건조시킨 다음, 분쇄하고 세말화하여 분말을 얻었다. 분말화된 무궁화에 10배 중량의 에탄올을 가한 후, 하룻밤 동안 교반시키며 에탄올 용매 추출한 후, 여과하여 그 상등액을 동결건조하여 추출물을 수득하였다. 수득한 추출물에 10배 부피의 물을 첨가한 후, 1M HCl과 1M NaOH를 이용하여 용액이 pH 5 내지 8 사이가 되도록 조절하였다. 여기에 효소(펙티나아제 및 헤미셀룰라아제 1:1 중량비로 혼합, 비전바이오사, 한국)를 무궁화 분말의 중량 대비 10%로 첨가하였다. 그리고, 효소 첨가된 용액을 항온수조에 넣고 60℃에서 24시간 동안 교반하여 효소와 반응시켰다. 반응 종료 후, 다시 14배 중량의 100% 에탄올을 첨가한 후, 하룻밤 동안 교반시키며 추출한 후, 여과하여 그 상등액을 동결건조하여 실시예로 이용하였다.

실시예 2. 효소( 헤미셀룰라아제 ) 처리된 무궁화 추출물의 제조

상기 실시예 1에서 효소로서 1:1 중량비로 혼합한 펙티나아제 및 헤미셀룰라아제 대신에 헤미셀룰라아제를 단독으로 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 무궁화 추출물을 제조하였다.

비교예 1. 효소 처리하지 않은 무궁화 추출물의 제조

상기 실시예 1에서 효소를 사용하여 처리하는 과정을 거치지 않은 것을 제외하고는 동일한 방법으로 무궁화 추출물을 제조하였다.

비교예 2. 효소( 글루코아밀라아제 ) 처리된 무궁화 추출물의 제조

상기 실시예 1에서 효소로서 1:1 중량비로 혼합한 펙티나아제 및 헤미셀룰라아제 대신에 글루코아밀라아제를 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 무궁화 추출물을 제조하였다.

비교예 3. 효소(락타아제) 처리된 무궁화 추출물의 제조

상기 실시예 1에서 효소로서 1:1 중량비로 혼합한 펙티나아제 및 헤미셀룰라아제 대신에 락타아제를 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 무궁화 추출물을 제조하였다.

실험예 1. 피부섬유아세포에서 무궁화 추출물이 세포성장에 미치는 효과 검증

무궁화 추출물이 인간 피부섬유아세포(NHDF, normal human dermal fibroblasts)의 생장에 미치는 효과를 아래와 같은 방법으로 확인하였다.

우선, 10% FBS(fetal bovine serum, Cambrex)가 포함된 전용 배지인 DMEM(Dulbeccos modified Eagles medium) 배지에 피부섬유아세포를 40mm 크기의 세포 배양 접시에 1.2×10⁵ 농도로 접종한 후 24시간 동안, 37℃, 5% CO₂ 습윤 조건 하에서 배양하였다. 이후, 배지를 제거하고 300㎕ 용량의 PBS를 가하고, UVB(UVB Peak range: 312nm, UV dose: 144mJ/cm²)를 조사한 다음, 무혈청 DMEM 배지로 희석한 실시예 1의 효소처리 무궁화 추출물을 농도 별(1, 10, 및 100 ㎍/mL)로 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 후, 1 mg/mL의 MTT를 처리하고 2시간 후, 세포에 MTT 처리로 인해 생성된 포마잔(formazan)을 DMSO로 녹여 570nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 인간 피부섬유아세포에 실시예 1의 당분해 효소 처리된 무궁화 추출물을 처리한 경우, 효소 처리된 무궁화 추출물이 인간 피부섬유아세포의 세포 생존율에 크게 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었으며, 이를 통해 효소 처리된 무궁화 추출물이 인체에 독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다(도 1 참조).

실험예 2. 효소 처리된 무궁화 추출물과 무궁화 추출물의 성분 비교 분석

상기 실시예 1 및 비교예 1에서 제조한 추출물 성분을 크로마토그래피 장비를 이용하여 하기 표 1의 조건에 따라 분석하였다.

그 결과, 실시예 1의 효소 처리한 무궁화 추출물이 비교예 1의 효소 처리하지 않은 무궁화 추출물에 비해 머무름 시간 5분에서 10분에서 검출되는 성분의 양이 상대적으로 크게 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 2).

실험예 3. 효소처리된 무궁화 추출물의 라디칼 소거 활성 효과( DPPH assay) 검증

DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, Sigma, USA)의 환원력을 이용하는 상 등의 문헌(Sang S et al., J.Agric. Food Chem. 50(8), p2459-2463, 2002)에 기재된 방법에 따라, 본 발명에 따른 효소처리된 무궁화 추출물의 항산화 활성을 측정하였다.

메탄올에 녹인 0.2 mM DPPH 용액 180 ul와 증류수 20 ul에 녹인 무궁화 추출물(음성 대조군), 당분해 효소처리된 무궁화 추출물, 및 알부틴(양성대조군)(1, 10, 50, 100, 250 ㎍/㎖)을 96-웰 마이크로플레이트에 넣고 37℃에서 30 분간 배양한 후, 환원된 DPPH의 양을 분광 광도계(Precision microplate reader; Molecular Devices, VersaMax)를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하여 시료를 가하지 않는 무첨가 대조군과 활성을 비교하였다. 상기 실험은 3회 반복하여 수행되었다.

그 결과, 도 3 및 아래 표 2를 참조하면, 당분해 효소 처리된 무궁화 추출물은 효소처리되지 않은 무궁화 추출물에 비해 각각 1, 10, 50, 100, 및 250 ㎍/㎖ 용량 처리시, 271%, 136%, 308%, 422%, 및 249% 개선된 우수한 항산화 효과를 보이는 것을 관찰할 수 있었고, 이러한 항산화 효과의 수치들은 양성대조군인 알부틴과 거의 동등한 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다.

무궁화 추출물 및 효소 처리된 무궁화 추출물의 DPPH 시험 결과

처리농도	1ug/ml	10ug/ml	50ug/ml	100ug/ml	250ug/ml
비교예 1 (흡광도)	0.811	1.59	1.09	5.89	16.4
실시예 1 (흡광도)	2.20	2.17	3.38	24.8	40.7
효소처리 후 효능 개선율	271%	136%	308%	422%	249%

실험예 4. 효소처리된 무궁화 추출물의 라디칼 소거 활성 효과( ABTS assay) 검증

PBS를 용매로 하여 1.0 mM의 ABTS (2,2-azobis-(2-amidinopropane)HCl)과 2.5 mM의 ABTS 2,2-azino-bis (3-ethylbenzthiazol- line-6-sulfonic acid) diammonium salt) 혼합용액을 만들고 70에서 30분간 반응시킨 뒤 상온에서 천천히 식도록 하였다. 그 후 용액의 상층액을 0.45 ㎛ PVDF 실린지 필터(SmartiLAB, Korea)로 여과하여 여과액의 흡광도가 734 nm의 0.650±0.020이 되는 것을 확인 한 후 실험에 사용하였다.

실시예 1의 효소처리 무궁화 추출물을 각각 1, 10, 50, 100 및 250 ㎍/mL의 농도로 제조하여 96-웰 플레이트에 분주한 뒤 ABTS 용액과 혼합하여 빛을 차단시키고 37에서 10분간 반응시킨 후 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices FilterMax F5; San Francisco, CA, USA)를 사용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 잘 알려진 항산화물질인 알부틴을 같은 농도로 처리하여 양성대조군으로 사용하였으며, 시료의 항산화능은 무첨가군의 흡광도를 구하여 아래와 같이 백분율로 표시하였다.

상기 실험 결과 실시예 1의 효소 처리 무궁화 추출물의 라디칼 소거 활성은 양성대조군인 알부틴과 거의 동등한 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다.또한, 본원발명에 사용된 무궁화 추출물의 라디칼 소거 활성 효과를 비교 확인하기 위하여 실시예 1의 당분해 효소 처리 무궁화 추출물과 글루코아밀라아제로 처리된 비교예 2 및 락타아제로 처리된 비교예 3의 무궁화 추출물의 ABTS를 비교하여 도 7에 나타내었다. 도 7의 도시된 내용으로부터 본원발명에 사용된 당분해 효소로 처리된 무궁화 추출물이 글루코 아밀라아제 또는 락타아제로 처리된 무궁화 추출물에 비하여 우수한 라디칼 소거 활성을 가지며 알부틴과도 거의 동등한 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

실험예 5. MMP -1 및 MMP -3 단백질의 합성 저해

40 mm 세포 배양 접시에 2 ㎖의 DMEM 배양액을 넣고, 인간섬유아세포를 약 1.2x10⁵의 농도로 접종한 후, 37℃, 5% CO₂ 환경에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, UVB를 144 mJ/cm² 조건으로 조사한 후, 실시예 1에서 제조된 당분해 효소 처리된 무궁화 추출물(각각 10, 및 100 ㎍/㎖)을 포함한 배지로 교체하여 3일간 배양하였다. 이후 배양액을 회수(harvest)하여 4℃, 7500rpm 환경에서 5분간 원심분리(centrifuge)하여 ELISA 방법을 이용하여 MMP-1 및 MMP-3(Human Total MMP-1 kit, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)의 단백질 발현량 변화를 확인하였다.

144 mJ/cm² 용량으로 자외선 조사 처리한 인간섬유아세포는 자외선 무처리 군에 비해 MMP-1 및 MMP-3 단백질의 생성이 각각 2배 및 3배 증가하였다. 이렇게 자외선 조사 처리로 인한 MMP-1 및 MMP-3 단백질의 생성 증가는 당분해 효소 처리된 무궁화 추출물의 처리에 의해서 감소하는 현상을 나타내었다(도 4 및 도 5). 이때, MMP-1 단백질의 경우에는 각각 1, 10, 및 100 ㎍/㎖ 용량에서 45%, 53%, 및 91% 의 발현 억제 효과를, MMP-3 단백질의 경우에는 각각 1, 10, 및 100㎍/㎖ 용량에서 50%, 67% 및 85% 개선된 단백질 발현 억제 효과를 나타내었으며, 이를 표 3 및 표 4에 각각 나타내었다.

무궁화 추출물 및 효소 처리된 무궁화 추출물의 MMP -1 단백질의 합성 저해 시험 결과

처리농도	1ug/ml	10ug/ml	100ug/ml
비교예 1 (pg/ml)	13456	10543	8546
실시예 1 (pg/ml)	7803.181	6654.074	1306.355
효소처리 후 효능 개선율	45%	53%	91%

무궁화 추출물 및 효소 처리된 무궁화 추출물의 MMP -3 단백질의 합성 저해 시험 결과

처리농도	1ug/ml	10ug/ml	100ug/ml
비교예 1 (pg/ml)	2691.87	2429.77	1005.38
실시예 1 (pg/ml)	1602.5	1057.6	475.4
효소처리 후 효능 개선율	50%	67%	85%

상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 당분해 효소 처리된 무궁화 추출물은 주름생성의 원인이 되는 MMP-1 및 MMP-3 단백질의 발현을 효과적으로 억제하여 피부 주름의 예방 및 개선에 효과적으로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 본원발명에 사용된 당분해 효소의 활성을 비교 확인하기 위하여 UVB 조사된 인간섬유아세포에서 실시예 1의 당분해 효소 처리 무궁화 추출물과 글루코아밀라아제로 처리된 비교예 2 및 락타아제로 처리된 비교예 3의 무궁화 추출물이 MMP-1 단백질 발현에 미치는 영향을 비교하여 도 8에 나타내었다. 도 8의 내용으로부터 본원발명에 사용된 당분해 효소로 처리된 무궁화 추출물이 글루코 아밀라아제 또는 락타아제로 처리된 무궁화 추출물에 비하여 MMP-1 단백질의 발현을 보다 효과적으로 억제함을 확인할 수 있었다.

실험예 6. 타입 1 프로콜라겐 단백질의 합성 촉진

40 mm 세포 배양 접시에 2 ㎖의 DMEM 배양액을 넣고, 인간섬유아세포를 약 1.2x10⁵의 농도로 접종한 후, 37℃, 5% CO₂ 환경에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, UVB를 144 mJ/cm² 조건으로 조사한 후, 실시예 1에서 제조된 당분해 효소 처리된 무궁화 추출물(각각 10, 및 100 ㎍/㎖)을 포함한 배지로 교체하여 3일간 배양하였다. 이후 배양액을 회수(harvest)하여 4℃, 7500rpm 환경에서 5분간 원심분리(centrifuge)하여 ELISA 방법을 이용하여 타입 1 프로콜라겐(Procollagen Type I C Peptide EIA Kit, Takara, Shiga, Japan)의 단백질 발현량 변화를 확인하였다.

144 mJ/cm² 용량으로 자외선 조사 처리한 인간섬유아세포는 자외선 무처리 군에 비해 타입 1 프로콜라겐 단백질의 생성이 2.1배 감소하였다. 이렇게 자외선 조사 처리로 인한 타입 1 프로콜라겐 단백질의 생성 감소는 무궁화 추출물의 처리에 의해서 다시 증가하는 현상을 나타내었다.

이때, 당분해 효소 처리된 무궁화 추출물 처리군은 효소 처리되지 않은 군과 비교할 때 월등한 증가 효과를 나타내는데, 각각 10, 및 100 ㎍/㎖ 용량에서 130% 및 177%의 타입 1 프로콜라겐 단백질의 생성 증가 효과를 나타내었다(도 6).

상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 당분해 효소 처리된 무궁화 추출물을 포함하는 피부 주름 개선용 조성물은 알부틴과 동등한 항산화 효과를 갖고, TGF-β/Smad 신호전달체계에 작용하여 타입 1 프로콜라겐의 생성을 촉진시키고, 콜라겐 분해 효소인 MMP-1 및 MMP-3 단백질의 발현을 억제하는 작용을 통해, 주름 생성을 효과적으로 예방하고, 생성된 주름을 개선하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다.

따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

펙티나아제와 헤미셀룰라아제를 1:1의 중량비로 혼합한 효소에 의해 당분해 효소 처리된 무궁화(Hibiscus syriacus L.)의 줄기 또는 뿌리껍질 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 당분해 효소 처리된 무궁화의 줄기 또는 뿌리껍질 추출물은 타입 I 프로콜라겐 단백질의 발현을 증가시키고, MMP-1 및 MMP-3 단백질의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 캐모마일 꽃 추출물, 로즈마리 잎 추출물, 할미꽃 잎 추출물, 어스니어 추출물, 인삼 추출물, 제라늄 꽃 추출물, 고삼 추출물, 성모초 추출물, 타임 추출물, 쐐기풀 추출물, 야로우 추출물, 클로브 추출물, 펜넬 추출물, 파파야잎 추출물, 해바라기 추출물, 유칼립투스 추출물 및 안젤리카 추출물에서 선택된 하나 이상의 식물 추출물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 여성청결제, 손세정제, 및 바디클린저에서 선택된 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
펙티나아제와 헤미셀룰라아제를 1:1의 중량비로 혼합한 효소에 의해 당분해 효소 처리된 무궁화의 줄기 또는 뿌리껍질 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 약학적 조성물.
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제7항에 있어서, 상기 당분해 효소 처리된 무궁화의 줄기 또는 뿌리껍질 추출물은 타입 I 프로콜라겐 단백질의 발현을 증가시키고, MMP-1 단백질의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제에서 선택된 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.