KR102139156B1 - 효소처리된 홍삼 및 천마 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 예방 또는 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 당가수분해 효소 처리된 홍삼 및 천마 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 인간 진피 섬유 아세포들에서 MMP-1 단백질의 발현을 억제하고, 타입 Ⅰ 프로콜라겐의 생성을 증가시키며, IL-6 단백질의 발현을 억제함으로써, 피부 주름의 발생을 예방하고, 손상된 피부의 주름을 개선하는 효능을 나타낸다. 종합적으로, 본 발명의 조성물은 피부 주름을 예방하고 크게 개선시킬 수 있다.

Description

효소처리된 홍삼 및 천마 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 예방 또는 개선용 조성물{Composition Comprising Enzyme Treated Extract of Red Ginseng and Gastrodia for Preventing or Improving Skin Wrinkle as Active Ingredient}

본 발명은 피부주름 예방 또는 개선 개선용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 효소처리된 홍삼과 천마 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.

피부 주름은 피부 수분함량, 콜라겐 함량 및 외부 환경에 대한 면역력 등 여러 가지 요소들에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있으며, 이중 주름의 형성에 가장 큰 영향을 미치는 것은 콜라겐의 생성량 및 콜라겐 분해 효소인 콜라게네이즈의 발현과 활성이다.

콜라겐은 피부 진피층에 존재하는데, 피부 전체 건조 중량의 약 70 내지 80%를 차지하는 엘라스틴과 함께 피부에 탄력을 부여하는 주요 성분으로 알려져 있다. 콜라겐은 자연 노화에 따른 세포활성 저하와 같은 내부 요인에 의해 감소되고, 여러 유해 환경에서의 스트레스 증가나 태양 광선에 의한 활성 산소 종의 증가와 같은 외부 요인에 의하여 생합성이 감소되거나, 분해가 촉진된다.

한편, 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 과생산은 UVB 노출 환경에서 보고된 바 있고, UVB 노출과 연관된 신호전달 체계는 MAPKs(mitogen activated protein kinases), ERK(extracellular signal-regulated kinase), p38 카이나아제, 및 JNK(c-Jun amino-terminal kinase) 등의 단백질과 관련되어 있는데, NF-ĸB 및 AP-1 전사인자의 발현증가를 유도한다. 또한, AP-1 단백질은 MMP(matrix metalloproteinase) 유전자의 활성과 관련되어 있고, NF-ĸB 단백질은 인터루킨과 같은 전염증 사이토카인(proinflammatory cytokines)의 발현에 영향을 미친다.

노화된 피부에서 콜라겐 및 엘라스틴의 붕괴는 주로 MMP 단백질과 같은 그 분해 효소의 증가된 발현에 의해 야기된다. 또한, 전염증 사이토카인은 콜라겐의 합성을 방해하고, 콜라겐의 붕괴를 촉진시킨다. 타입 I 콜라겐은 연결 조직의 세포외 기질에서 가장 풍부한 단백질이다. 세포외 기질에는 타입 III, V, 및 VII 콜라겐, 엘라스틴, 프로테오글라이칸, 파이브로넥틴과 같은 다른 유형의 단백질을 포함한다.

타입 I 콜라겐 단백질의 발현 수준을 조절하는 것은 피부 광노화를 예방하는데 있어서 가장 중요한 인자이다. UVB의 조사는 TGF-β/Smad 신호전달 체계의 억제를 통해 피부 섬유아세포에서 콜라겐 전구체인 프로콜라겐(procollagen)의 발현을 감소시키게 된다. 또한, TGF-β1 신호전달 체계는 인간 피부 섬유아세포에서 세포외 기질의 합성을 조절하는 중요한 인자의 하나이다.

따라서, AP-1 및 MAPKs 인자에 의해 조절되는 활성산소종(ROS)의 생성, 및 MMPs, ILs, TGF-β, 및 타입 I 프로콜라겐의 발현은 피부 광노화 연구에 있어서 유용한 마커로 작용한다.

이와 같이 콜라겐 감소를 저해하여 피부 주름개선에 효과가 있는 천연물질을 탐색하고자 하는 여러 다양한 시도가 있었다. 콜라겐의 주름개선 효과를 이용하기 위하여 화장품 또는 연고 등과 같은 피부외용제 조성물에 콜라겐을 배합한 제품들이 출시되었으나, 이들 제품들은 콜라겐 자체를 피부 표면에 도포하는 것으로 고분자 물질인 콜라겐의 경피 흡수가 어려워 본질적인 주름개선 효과를 나타낼 수 없었다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 콜라겐합성 촉진물질에 대한 관심이 높아졌으며, 종래 알려진 콜라겐합성 촉진물질로는 비타민C, 레티노익산, 형질전환생장인자(transforming growth factor, TGF), 동물태반 유래의 단백질(JP08-231370), 베툴린산(betulinic acid, JP08-208424), 클로렐라 추출물(JP09-40523, JP10-36283, 섬유아세포 증식 촉진작용) 등이 있다. 그러나 상기 물질은 피부 적용시 자극과 발적 등 안전성 문제로 사용량에 제한이 있거나, 그 효과가 미미하여 실질적으로 주름개선 효과를 기대할 수 없다는 문제점이 있었다. 따라서 종래 주름개선용 조성물보다 생체에 안전하고 주름개선 효과가 높은 새로운 주름개선 조성물의 개발이 절실히 요구되고 있다.

한편, 홍삼은 오래 전부터 한방에서는 약용으로 사용되었고, 최근에는 자양강장, 항암 등의 각종 약리작용이 입증되어 세계적으로 가장 우수한 건강기능식품으로 인정받고 있다. 홍삼의 주요성분으로는 배당체(glycosides), 홍삼향성분(panacen), 폴리아세틸렌계 화합물, 플라보노이드, 비타민(B군), 미량원소, 효소, 항산화 물질과 유기산 및 아미노산 등이 함유된 것으로 알려져 있다. 홍삼의 약리 효과로는 중추신경에 대해서 진정작용과 흥분작용이 알려져 있고, 순환계에 작용하여 고혈압이나 동맥경화의 예방효과가 있는 것으로 알려져 있다. 이외에도, 조혈작용과 혈당저하, 간 보호 효과 등이 알려져 있고, 내분비계에 작용하여 성행동이나 생식효과에 간접적으로 유효하게 작용하고, 항염 및 항종양작용이 있으며, 방사선에 대한 방어효과와 피부를 보호하며 부드럽게 하는 작용도 있는 것으로 알려져 있다.

홍삼의 피부주름 개선 효과와 관련하여, 한국공개특허공보 제10-2011-0060001호, 한국공개특허공보 제10-2011-0048699호, 한국공개특허공보 제10-2011-063912호, 한국공개특허공보 제10-2011-0063916호 등은 홍삼 및 홍삼 유래 사포닌이 갖는 피부상태 개선 기능 등에 대하여 공개하고 있다. 또한, 본 발명자들이 출원하여 등록받은 한국특허등록공보 제10-1431882호는 효소 처리된 홍삼 추출물이 갖는 피부노화방지 및 피부주름개선 효과가 공개되어 있다.

한편, 천마(Gastrodia elata Blume, Gastrodia)는 난초과(Orcbidaceae)에 속하는 다년초 식물로, 엽록소가 없어서 탄소동화 작용을 이용한 영양물질의 광합성이 불가능하고, 뿌리가 없는 관계로 뽕나무 버섯속(Armillarilla) 균사와 공생하며 땅속 괴경을 형성하여 영양을 공급받아 생장하는 식물이다. 천마는 적근, 귀독우, 난모, 신초, 정풍초 등의 다른 명칭으로 부르기도 하는데, 주로 고혈압, 두통, 마비, 신경성 질환과 당뇨병 등의 심각한 성인병뿐만 아니라, 스트레스와 피로 등의 증상에 대하여 효능이 있는 것으로 알려져 있다.

그러나, 천마가 갖는 피부 주름의 개선 효과에 대하여 아직까지 상세히 연구되지 않은 상황이며, 천마의 유효성분으로 종래 피부 주름에 효과가 있는 것으로 공지된 가스트로다이제닌(4-하이드록시 벤질알코올) 성분의 주름개선 효과는 현장에서 사용되기에는 그 효과가 충분하지 않은 것으로 연구된 바 있다. 따라서, 천마를 피부 주름 개선 또는 예방 소재로 활용하기 위해서는, 본 발명자들이 연구하여 출원한 특허공개 제10-2016-0167064호의 방법과 같이, 천마에서 가스트로다이제닌을 분리하고 글루코오스를 α-글리코시드 형태로 결합시켜, α-가스트로딘 형태로 가공 및 변형하여 신물질을 생성하는 경우에 비로소 산업적으로 활용할 수 있는 정도의 주름개선 효과를 갖는 것으로 공지되어 있다.

따라서, 현재까지 홍삼 및 천마 추출물을 이용하는 경우에는 피부 미백 또는 주름 개선 등에 충분한 효과를 얻기 어려운 실정이며, 이로 인해, 인체에 해가 없으며 안전하게 사용할 수 있고, 원료를 쉽게 구할 수 있는 장점이 있는 홍삼과 천마를 산업적으로 활용하는데 어려운 문제점이 있었다.

이에, 본 발명자들은 홍삼 및 천마가 갖는 피부 주름 개선의 효과를 극대화하고, 화장료 조성물의 주원료로 활용하고자 예의 연구 노력한 결과, 홍삼 및 천마 추출물을 당가수분해 효소로 효소처리하고, 이들이 갖는 시너지 효과를 극대화할 수 있는 혼합비율을 찾기 위해 예의 연구노력한 결과, 효소처리된 홍삼 및 천마 추출물이 UVB 조사에 의해 유도된 인간 섬유아세포(human dermal fibroblasts, NHDFs)의 광노화에 대응하여 피부 주름 예방 및 개선에 뛰어난 효과가 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 효소 처리된 홍삼 및 천마 추출물을 유효성분으로 하여 피부 주름의 예방 또는 개선에 뛰어난 효과가 있는 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 당가수분해 효소 처리 홍삼 및 천마 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 피부 주름개선 및 피부노화 방지에 효능이 있는 물질을 찾고자 여러 가지 천연물질들 중에서 유효한 물질을 검색하고, 이들이 갖는 시너지 효과를 극대화할 수 있는 혼합비율을 찾기 위해 예의 연구노력한 결과, 당가수분해 효소 처리된 홍삼 및 천마 추출물의 피부 주름 예방 및 개선 효과가 획기적으로 증가함을 발견하였고, 또한 피부에 적용시 안전성에도 문제가 없음을 확인하였다.

본 발명의 "홍삼(red ginseng)"은 두릅나무과의 인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)을 엄선하여 껍질을 벗기지 않은 상태로 장시간 증기로 쪄서 건조시킨 담황갈색 또는 담적갈색을 띠는 인삼을 의미한다. 홍삼을 물로 세척하여 사용하거나, 시판되는 것을 사용할 수 있으며, 상기 홍삼을 제조하는데 사용되는 인삼은 천삼, 지삼 및 양삼으로 이루어진 군으로부터 1 종 이상 선택될 수 있다.

또한, 본 발명의 천마(Gastrodia elata Blume, Gastrodia)는 난초과(Orcbidaceae)에 속하는 다년초로서 적근, 귀독우, 난모, 신초, 정풍초 등으로 불리기도 한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "추출물"은 식물의 추출 처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다. 본 발명의 상기 추출물은 바람직하게 추출 후 건조 분말 형태로 제조되어 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 홍삼 및 천마 추출물은, 인삼의 천연, 잡종 또는 변종 식물로부터 가공된 홍삼이나, 천마의 천연, 잡종 또는 변종 식물로부터 추출될 수 있고, 천마의 식물 조직 배양물에서도 추출이 가능하며, 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 열매 등의 부위에서 추출한 추출물을 포함한다.

본 발명의 용어 "당가수분해 효소(glycolytic enzyme)"는 해당 반응을 촉매하는 효소를 의미하며, 본 발명에서는 넓은 의미에서 셀룰로오스, 아밀로오스, 탄닌, 펙틴 등의 올리고당을 분해하는 효소를 의미한다.

본 발명에서, 상기 당가수분해 효소의 예로는 셀룰라아제(cellulase), 글루코아밀라아제(glucoamylase), 펙티나아제(pectinase), 글루코시다아제(glucosidase), 탄나아제(tannase) 효소를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 홍삼 및 천마 추출물에 존재하는 올리고당 형태의 고분자를 분해하는 활성을 갖는 효소이면 본 발명의 당가수분해 효소에 포함된다. 상기 효소들은 단독으로 사용하거나, 또는 이들 효소들를 복합 처리하여 사용할 수도 있다. 본 발명에서 제시하는 당가수분해 효소 처리된 홍삼 및 천마 추출물은 특별한 언급이 없는 한, 상기 예시된 효소 이외에도 해당 반응을 촉매하는 당가수분해 효소로 처리된 홍삼 및 천마 추출물을 모두 포함하며, 피부주름개선 소재로 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어, "피부 주름"이란, 피부가 쇠하여 생긴 잔줄을 의미하는데, 유전자에 의한 원인, 피부 진피에 존재하는 콜라겐의 감소, 외부 환경 등에 의해 유발될 수 있다.

본 발명에서 "피부 주름 예방 또는 개선"이란, 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화시키는 것을 말한다.

피부 섬유아세포의 주된 기능으로 세포외기질 합성과 증식을 통한 손상된 피부 조직 재생 등을 들 수 있는데, 광노화와 같은 외인성 노화 요인 또는 유리 산소에 의한 손상 누적, 텔로미어 단절로 인한 세포 노화 등에 따른 내인성 노화 요인들은 진피층 내에 있는 피부섬유아세포의 생리 활성 기능을 저하하게 된다. 피부 세포외기질 중 95% 이상을 차지하고, 세포의 부착분자(adhesion molecule) 및 세포 골격(cytoskeleton) 등과의 상호 작용과 신호 교류를 통해 섬유아세포의 생리 활성에 매우 주요한 부분을 담당하는 제I형 콜라겐의 합성이 저하될 경우, 피부 조직 내 콜라겐 양이 감소하고, 이에 따라 표면 장력이 감소하여 피부 탄력이 저하되고 피부 주름이 형성될 뿐만 아니라, 세포의 증식 및 재생 기능을 포함하는 생리 활성 기능이 감소하는 악순환의 원인이 된다.

따라서, 피부섬유아세포의 콜라겐은 피부 재생, 피부 탄력, 피부 주름 형성 및 피부 손상 시 조직의 수복 또는 재생과 직접적인 관련이 있다고 볼 수 있다.

즉, 피부 섬유아세포의 콜라겐 또는 프로콜라겐의 합성이 촉진되거나, 콜라겐을 분해하는 기질 단백질 분해효소(matrix metallo-proteinase, 이하 'MMP'라 함)의 합성이 저해되면, 피부 탄력 개선, 피부 재생, 피부 주름 개선, 상처 치유, 손상된 피부 조직의 수복 및 재생; 및 피부 노화 방지 등의 효과를 얻을 수 있다.

본 발명의 당가수분해 효소 처리 홍삼 및 천마 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 타입 I 프로콜라겐 유전자의 발현을 증가시키고, MMP-1((matrix metallo-proteinase 1) 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.

구체적으로, 본 발명의 상기 효소 처리된 홍삼 및 천마 추출물을 포함하는 조성물은 자외선 조사된 정상 인간 진피 섬유아세포(NHDF)에서 세포 독성을 저감시키고, 콜라겐 분해를 촉진시키는 기질 단백질 분해효소-1(matrix metallo-proteinase)의 발현을 억제시키면서, 타입 Ⅰ 프로콜라겐의 생성을 증가시키는바, 피부 탄력 증가, 피부 재생, 피부 주름 개선, 상처 치유, 손상된 피부 조직의 수복 및 재생; 및 피부 노화 방지 등의 효과 등을 가질 수 있다. 구체적으로는 피부주름의 예방 또는 개선의 효과를 가질 수 있다(도 2 내지 도 7 참조).

본 발명의 당가수분해 효소 처리 홍삼 및 천마 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에서, 상기 홍삼과 천마는 1 : 9 내지 11의 중량비로 혼합되는 것이 바람직하며, 1 : 10의 비율로 혼합되는 것이 가장 바람직하다. 상기 효소 처리된 홍삼 및 천마의 복합 추출물은 홍삼 1 대비 천마 9 내지 11의 중량비로 혼합될 때 높은 항산화 효과가 있는 것으로 나타났고, 홍삼 1 대비 천마 10의 중량비로 혼합될 때 가장 높은 항산화 활성을 갖는 것으로 측정되었으며, 이러한 항산화 효과의 수치들은 양성대조군인 알부틴과 비교하였을 때도 더 우수한 것으로 나타났다(도 6 참조). 또한, 효소 처리된 홍삼 및 천마의 복합 추출물은 홍삼 1 대비 천마 9 내지 11의 중량비로 혼합될 때 우수한 MMP-1 단백질 생성 억제 효과가 있는 것으로 나타났고, 홍삼 1 대비 천마 10의 중량비로 혼합될 때 가장 높은 MMP-1 단백질 생성 억제 활성을 갖는 것으로 측정되었다. 특히, 홍삼 1 대비 천마 10의 중량비로 혼합한 실험군에서 나타난 피부주름 개선 효과는 UVB를 조사하지 않은 음성대조군에서 측정된 MMP-1 단백질 생성 수치를 약간 상회하는 수준으로 나타났으며, 이를 통해 홍삼 1 대비 천마 9 내지 11의 중량비로 혼합되는 조합이 갖는 시너지 효과는 매우 우수한 것을 확인할 수 있었다(도 7 참조).

또한, 본 발명의 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물에 함유된 효소 처리된 홍삼 및 천마 추출물은 그 자체로 피부 주름을 제거하는 효과가 있으며, 기존에 알려진 피부 주름 예방 및 개선에 효과가 있다고 공지된 물질들과 혼합하여 사용하는 경우에도 피부 주름의 예방 및 개선 효과를 지속적으로 유지할 수 있다.

상기 피부 주름개선에 효과가 있는 물질로는 이에 제한되지는 않으나, 캐모마일 꽃 추출물, 로즈마리 잎 추출물, 할미꽃 잎 추출물, 어스니어 추출물, 인삼 추출물, 제라늄 꽃 추출물, 고삼 추출물, 성모초 추출물, 타임 추출물, 쐐기풀 추출물, 야로우 추출물, 클로브 추출물, 펜넬 추출물, 파파야잎 추출물, 해바라기 추출물, 및 안젤리카 추출물 등이 있다.

이외에도 본 발명의 화장료 조성물은 수용성 비타민, 지용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스 등을 더 포함할 수 있다.

상기 수용성 비타민으로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것도 될 수 있으나, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염(티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체(아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 상기 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물 배양물의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

상기 지용성 비타민으로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것도 될 수 있으나, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체(팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산dl-알파 토코페롤, 니코틴산dl-알파 토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 지용성 비타민에 포함된다.

상기 고분자 펩티드로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것도 될 수 있으나, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 상기 고분자 펩티드는 미생물 배양액의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견 섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

상기 고분자 다당에는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것도 될 수 있으나, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 콘드로이틴 황산 또는 그 염(나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

상기 스핑고 지질로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것도 될 수 있으나, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당 지질 등을 들 수 있다. 상기 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

상기 해초 엑기스로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것도 될 수 있으나, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조엑기스, 녹조 엑기스 등을 들 수 있으며, 또한, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨 등도 본 발명에서 사용되는 해초 엑기스에 포함된다. 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다.

본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합할 수 있다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 자외선 흡수제, pH 조정제, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한제, 정제수 등을 들 수 있다.

상기 유지 성분으로는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

상기 에스테르계 유지로는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

상기 탄화 수소계 유지로는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로 크리스탈린 왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.

상기 실리콘계 유지로는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산 메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산 메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

상기 불소계 유지로는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

상기 동물 또는 식물 유지로는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 난황유, 우지, 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

상기 보습제로는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

상기 수용성 저분자 보습제로는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

상기 지용성 저분자 보습제로는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

상기 수용성 고분자로는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

상기 지용성 고분자로는 폴리비닐피롤리돈 에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈 헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.

상기 에몰리엔트제로는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

상기 자외선 흡수제로는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

상기 pH 조정제로는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01 내지 5 중량부, 보다 바람직하게는 0.01 내지 3 중량부로 배합될 수 있다.

본 발명의 조성물을 함유하여 제조된 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 안료 및 천연향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 피부 주름 예방 및 개선 효과를 갖는 화장품 또는 세안제 등에 다양하게 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 마스크팩 등과 같은 화장품류와 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 및 바디클린저 등이 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판, 부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 당가수분해 효소 처리 홍삼 및 천마 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "당가수분해 효소(glycolytic enzyme)"는 해당 반응을 촉매하는 효소를 의미하며, 본 발명에서는 넓은 의미에서 셀룰로오스, 아밀로오스, 탄닌, 펙틴 등의 올리고당을 분해하는 효소를 의미한다.

본 발명에서, 상기 당가수분해 효소는 셀룰라아제(cellulase), 펙티나아제(pectinase), 글루코시다아제(glucosidase), 및 탄나아제(tannase)로 이루어진 군에서 선택된 효소 또는 이들의 복합 효소를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 홍삼 및 천마 추출물에 존재하는 올리고당 형태의 고분자를 분해하는 활성을 갖는 효소이면 본 발명의 당가수분해 효소에 포함된다.

또한, 본 발명의 피부 주름 예방 또는 개선용 약학적 조성물에서, 상기 당가수분해 효소 처리된 홍삼 및 천마 추출물은 타입 I 프로콜라겐 유전자의 발현을 증가시키고, MMP-1 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 당가수분해 효소 처리 홍삼 및 천마 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물에서, 상기 홍삼 및 천마는 1 : 9 내지 11의 중량비로 혼합된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합하여 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명의 조성물은 피부에 적용할 수 있는 피부 외용제 제형으로서 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태로 피부에 직접 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 혼합 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있으며, 바람직하게는 0.01㎍/㎖ 내지 25㎍/㎖의 용량으로 투여될 수 있다. 외용투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 당가수분해 효소 처리 홍삼 및 천마 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물을 건강기능식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 건강기능식품 또는 건강기능식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 바람직하게는 15 중량부 이하, 보다 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 조절 및 위생을 목적으로 하는 장기 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안정성 면에서 문제가 없으므로 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 조성물을 첨가할 수 있는 건강기능식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 사탕류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농 제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있고, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함할 수 있으며, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물이 음료의 형태로 사용될 때는 통상의 음료와 같이 여러 가지 감미제, 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스와 같은 디사카라이드, 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨과 같은 당알코올일 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 이에 제한되지는 않으나, 본 발명의 조성물 100㎖ 당 바람직하게는 약 0.01 내지 0.04g, 보다 바람직하게는 0.02 내지 0.03g 일 수 있다. 상기 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제 및 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제일 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 화장료, 약학, 및 식품 조성물은 그 자체적으로 피부 주름 예방 또는 개선의 효과가 있으므로 피부 주름 예방 또는 개선용 조성물로 바로 이용될 수 있고, 피부 주름 예방 및 개선에 효과가 있는 천연 추출물들을 함유하는 다른 성분과 혼합하여 사용하는 형태로도 이용될 수 있어 기존의 피부 주름 예방 또는 개선 효과를 좀 더 높여줄 수 있을 것으로 기대된다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 당가수분해 효소 처리 홍삼 및 천마 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 인간 진피 섬유 아세포에서 MMP-1의 발현을 억제하고, 타입 Ⅰ 프로콜라겐의 생성을 증가시키며, IL-6 단백질의 발현을 억제함으로써, 피부 주름의 발생을 예방하고, 손상된 피부의 주름을 개선하는 효능을 나타낸다. 종합적으로, 본 발명의 조성물은 피부 주름을 예방하고 크게 개선시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 인체에 매우 안전할 뿐만 아니라, 안정성도 매우 탁월하다.

도 1은 효소처리 홍삼 및/또는 천마 추출물이 세포 생존에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 2는 효소 처리 홍삼과 천마의 복합 추출물이 갖는 항산화 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 인간섬유아세포에서 효소 처리 홍삼과 천마의 복합 추출물이 갖는 MMP-1 단백질의 발현 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 인간섬유아세포에서 효소 처리 홍삼과 천마의 복합 추출물이 갖는 타입 I 프로콜라겐 단백질의 발현 촉진 효과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 인간섬유아세포에서 효소 처리 홍삼과 천마의 복합 추출물이 갖는 IL-6 단백질의 발현 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 배합비율을 달리한 효소 처리 홍삼과 천마의 복합 추출물이 갖는 항산화 활성을 나타낸 그래프이다.
도 7은 배합비율을 달리한 효소 처리 홍삼과 천마의 복합 추출물이 갖는 MMP-1 단백질의 발현 억제 효과를 나타내는 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 당가수분해 효소 처리된 홍삼 및 천마 추출물의 제조

홍삼 1kg을 20-40 메쉬로 분쇄하여 플라스크 또는 유리 용기에 담았다. 분말화된 홍삼에 10L의 증류수를 가한 후, 1M HCl과 1M NaOH를 이용하여 용액이 pH 5-8 사이가 되도록 조절하였다. 여기에 효소로 셀룰라아제를 홍삼 분말의 중량 대비 1%로 첨가하였다. 그리고, 셀룰라아제가 첨가된 용액을 항온수조에 넣고 50℃에서 3시간 동안 교반하여 효소와 반응시켰다. 효소와 반응시킨 반응물을 여과하고, 그 상등액을 동결건조하여 효소 처리된 홍삼 추출물을 제조하였다. 상기와 같은 방식으로 추출하되, 셀룰라아제 효소로 처리되지 않은 홍삼 추출물을 동결건조하여 비교예로 사용하였다.

천마 전초 15kg을 분쇄한 뒤 50% 에탄올을 10배수 첨가하여 70℃에서 4시간 환류 추출하여 약 0.92kg의 추출물을 수득하였다(수득율 6.13%). 당가수분해 효소 반응은 당 수용체로서 천마 추출물 300g(4HBA기준 : 3.6g)을 사용하였고, 당 공여체로 수용성 전분(soluble starch) 4.6g을 사용하였다. 준비된 당 수용체와 공여체를 0.1 CaCl₂ 용액 0.91 mL에 혼합하고, CGTase(Cyclodextrin glycosyltransferase) 2,250U를 가한 다음 0.1 M phosphate 초산 완충용액(pH 6.0)을 가하여 700 mL로 정용하였다. 상기 정용한 반응액을 50℃의 암소에서 교반하면서 48 시간 반응시킨 다음, 비등 수욕조에서 10분간 가열하여 CGTase 효소를 불활화 하였다. 이어서 CGTase 효소 반응에 의해 생성된 maltooligosylglucoside들을 monoglucoside를 가수분해시키기 위하여 1.0 M 초산 수용액을 사용하여 반응액의 pH를 5.0으로 조절하고, 글루코아밀라아제(Glucoamylase)(80 U)를 가하고 50℃에서 교반하면서 8시간 동안 가수분해하였다. 상기 가수분해 반응을 마친 반응액을 10분간 오토클래이브(Autoclaving) 하여 글루코아밀라아제(Glucoamylase)를 불활화시킨 반응물을 여과하고, 그 상등액을 동결건조하여 이용하였다. 상기와 같은 방식으로 추출하되, 효소 처리되지 않은 천마 추출물을 동결건조하여 비교예로 사용하였다.

상기 제조된 효소 처리된 홍삼과 천마 추출물을 혼합하여 효소 처리된 홍삼과 천마의 복합 추출물을 제조하였다.

실시예 2. 세포 독성 확인

세포독성은 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 비색정량분석법(colorimetric assay)을 사용하여 측정하였다. MTT(Methyl thiazol tetrazolium) 분석은 세포 생존 능력을 측정하기 위해 사용되는 것으로, MTT가 보라색을 생성하는 포마르잔 염색으로 바꾸는 것이다. 인큐베이션 72시간 후, 배지의 부피는 1㎖로 감소하였고, 1㎎/㎖ MTT의 100㎕는 각 벽에 첨가되었다. 이후, 세포는 37℃에서 2시간 동안 5%의 CO₂ 및 95%의 O₂ 존재 하에 배양되었다. 기질-함유 배지는 제거되었고, 1㎖의 DMSO는 포마르잔 결정을 용해시키기 위해 각 벽에 첨가되었다. 또한, 상온에서 30분 동안 오비탈 쉐이커로 플레이트를 흔들었다. 100㎕의 부분 표본의 흡수율은 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices E09090; 샌프란시스코, CA, 미국)를 사용하여 570㎚에서 흡수율을 측정함으로써 정량화하였다.

효소처리 홍삼, 효소처리 천마, 및 이들의 조합이 처리된 세포(처리 후 72시간)들의 세포 독성을 확인하고자, UVB 조사된 정상 인간 진피 섬유 아세포들에서 MTT 분석을 실시하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, UVB 조사 후, 효소처리 홍삼 및/또는 효소처리 천마의 처리는 인간 진피 섬유상세포들의 세포 생존을 억제하지 않고 오히려 생장을 촉진하는 것을 확인할 수 있었다(도 1).

실시예 3. 효소처리된 홍삼 및 천마 추출물의 항산화 효과 검증

인간 피부섬유아세포에서 효소처리된 홍삼 및 천마 추출물이 갖는 활성산소종(ROS, Reactive Oxygen Species) 생성 억제 효과를 확인하는 실험을 수행하였다.

실험은 인간 피부섬유아세포에 UVB(UVB Peak range: 312 nm, UV dose: 144 mJ/cm²)를 조사한 다음, 무혈청 DMEM 배지로 희석한 효소처리된 홍삼 및 천마 추출물을 농도별(0.1, 1, 10 ㎍/㎕)로 처리하여 30분 동안 배양하고, 여기(excitation) 480 nm, 방출(emission) 530 nm 조건에서 형광도를 측정하여 DCF 형광 강도(DCF fluorescence intensity)를 비교하여 수행하였다. 통계처리는 GraphPad Prism 프로그램을 사용하여 실시하였으며, ANOVA(one-way analysis of variance)를 이용하여 평균값의 유의성을 5% 미만의 한계로 조사하였다.

그 결과, 효소처리된 홍삼, 또는 효소처리된 천마 추출물의 단독 처리에 비해 효소처리된 홍삼 및 천마의 복합 추출물(1:1 중량비)의 항산화 효과가 더욱 우수한 것으로 나타났으며, 이러한 현상은 UV 처리된 인간 피부섬유아세포 실험에서 더욱 뚜렷하게 관찰되었다. 따라서, 효소처리된 홍삼 및 천마의 복합 추출물은 음성대조군에 비하여 ROS 생성을 유의하게 억제하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다(도 2 참조).

실시예 4. MMP -1 단백질의 합성 저해

40mm 세포 배양 접시에 2㎖의 DMEM 배양액을 넣고, 인간섬유아세포를 약 1.2x10⁵의 농도로 접종한 후, 37℃, 5% CO₂ 환경에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, UVB를 144mJ/cm² 조건으로 조사한 후, 실시예 1에서 제조된 당가수분해 효소 처리된 홍삼과 천마의 복합 추출물(1:1 중량비, 각각 1, 10, 및 100㎍/㎖)을 포함한 배지로 교체하여 3일간 배양하였다. 이후 배양액을 회수(harvest)하여 4℃, 7500rpm 환경에서 5분간 원심분리(centrifuge)하여 ELISA 방법을 이용하여 MMP-1(Human Total MMP-1 kit, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)의 단백질 발현량 변화를 확인하였다(도 3 참조).

먼저, 자외선 조사 없는 인간섬유아세포 실험에서, 당가수분해 효소 처리된 홍삼 및 천마의 복합 추출물 처리군은 MMP-1 단백질의 생성을 농도 의존적으로 억제하고 있음을 알 수 있었다. 이러한 효과는 효소 처리되지 않은 홍삼 및 천마 추출물을 처리한 군과 비교할 때, 월등한 효과가 있는 것으로 나타났고(미도시), 홍삼 또는 천마 추출물의 단독 추출물에 비해서도 우수한 것으로 나타났다. 또한, 1, 10, 및 100㎍/㎖ 처리군 모두에서 당가수분해 효소 처리된 실시예의 홍삼 및 천마의 복합추출물이 효소 처리된 홍삼 추출물의 단독처리군과 효소처리된 천마 추출물의 단독 처리군에 비해 큰 폭으로 개선된 MMP-1 단백질의 생성 저해 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다(도 3).

또한, 144mJ/cm² 용량으로 자외선 조사 처리한 인간섬유아세포는 자외선 무처리 군에 비해 MMP-1 단백질의 생성이 2배 이상 증가하였다. 이렇게 자외선 조사 처리로 인한 MMP-1 단백질의 생성 증가는 효소처리된 홍삼 및 천마의 복합 추출물 처리에 의해서 감소하는 현상을 나타내었다. 이러한 MMP-1 단백질 발현 감소 효과는 효소 처리되된 홍삼과 천마의 복합 추출물에서 월등한 것으로 나타났는데, 1, 10, 및 100㎍/㎖ 처리군 모두에서 당가수분해 효소 처리된 실시예의 홍삼 및 천마의 복합추출물이 효소 처리되지 않은 천마 추출물에 비해 큰 폭으로 개선된 MMP-1 단백질의 생성 저해 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다(미도시). 또한, 당가수분해 효소 처리된 실시예의 홍삼 및 천마의 복합추출물이 효소 처리된 홍삼 추출물의 단독처리군과 효소처리된 천마 추출물의 단독 처리군에 비해 큰 폭으로 개선된 MMP-1 단백질의 생성 저해 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다(도 3).

상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 당가수분해 효소 처리된 홍삼 및 천마의 복합 추출물은 주름생성의 원인이 되는 MMP-1 단백질의 생성을 효과적으로 억제하여 피부 주름의 예방 및 개선에 효과적으로 사용될 수 있었고, 효소처리된 홍삼과 효소처리된 천마의 조합으로 인하여 시너지 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 타입 1 프로콜라겐 단백질의 합성 촉진

40mm 세포 배양 접시에 2㎖의 DMEM 배양액을 넣고, 인간섬유아세포를 약 1.2x10⁵의 농도로 접종한 후, 37℃, 5% CO₂ 환경에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, UVB를 144mJ/cm² 조건으로 조사한 후, 실시예 1에서 제조된 당가수분해 효소 처리된 홍삼 및 천마의 복합 추출물(각각 1, 10, 및 100㎍/㎖)을 포함한 배지로 교체하여 3일간 배양하였다. 이후 배양액을 회수(harvest)하여 4℃, 7500rpm 환경에서 5분간 원심분리(centrifuge)하여 ELISA 방법을 이용하여 타입 1 프로콜라겐(Procollagen Type I C Peptide EIA Kit, Takara, Shiga, Japan)의 단백질 발현량 변화를 확인하였다(도 4 참조).

먼저, 자외선 조사 없는 인간섬유아세포 실험에서, 당가수분해 효소 처리된 홍삼 및 천마의 복합 추출물 처리군은 타입 1 프로콜라겐 단백질의 생성을 농도 의존적으로 증가시키고 있음을 알 수 있었다. 이러한 효과는 효소 처리되지 않은 홍삼 및 천마 추출물을 처리한 군과 비교할 때, 월등하게 개선된 타입 1 프로콜라겐 단백질의 생성 증가를 나타내어, 효소 처리된 홍삼 및 천마의 복합추출물 처리시 타입 1 프로콜라겐 단백질의 생성 증가 효과가 더욱 큰 것으로 나타났다(미도시).

또한, 144mJ/cm² 용량으로 자외선 조사 처리한 인간섬유아세포는 자외선 무처리 군에 비해 타입 1 프로콜라겐 단백질의 생성이 약 2.3배 감소하였다. 이렇게 자외선 조사 처리로 인한 타입 1 프로콜라겐 단백질의 생성 감소는 효소처리된 홍삼과 천마의 복합 추출물의 처리에 의해서 다시 증가하는 현상을 나타내었다. 이 때, 당가수분해 효소 처리된 홍삼과 천마의 복합 추출물 처리군은 효소 처리되지 않은 군과 비교할 때 월등하게 개선된 타입 1 프로콜라겐 단백질의 생성 증가 효과를 나타내었다(미도시). 또한, 당가수분해 효소 처리된 실시예의 홍삼 및 천마의 복합추출물이 효소 처리된 홍삼 추출물의 단독처리군과 효소처리된 천마 추출물의 단독 처리군에 비해 큰 폭으로 개선된 타입 1 프로콜라겐 단백질의 생성 증가 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다(도 4).

상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 당가수분해 효소 처리된 홍삼과 천마의 복합 추출물을 포함하는 조성물은 TGF-β/Smad 신호전달체계에 작용하여 타입 1 프로콜라겐의 생성을 촉진시키고, 콜라겐 분해 효소인 MMP-1의 발현을 억제하는 작용을 통해, 주름 생성을 효과적으로 예방하고, 생성된 주름을 개선하는 효과가 있음을 확인할 수 있었으며, 효소처리된 홍삼과 효소처리된 천마의 조합으로 인하여 시너지 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 6. IL-6 단백질 발현 억제효과 검증

피부세포 손상에 의해 발생되는 염증반응 메커니즘에서 IL-6 등의 염증매개 물질들이 관여하게 되며, 염증매개 물질들의 작용에 의해 염증반응이 증폭되게 되며, IL-6의 발현을 억제하는 경우 염증반응을 효과적으로 차단할 수 있게 된다.

효소처리된 홍삼과 천마의 복합 추출물이 IL-6 단백질의 발현에 미치는 영향을 검증하기 위해 마우스 대식세포주(mouse macrophage)인 RAW264.7 세포를 대상을 실험을 수행하였다. RAW264.7 세포를 96 well plate에 1.0×10⁵ 농도로 접종한 후 24시간 동안, 37℃, 5% CO2 습윤 조건 하에서 배양하였다. 이후, PBS 용액으로 세척한 후, 각 well에 LPS 1 ㎍/㎖을 단독 혹은 다양한 농도의 시료와 함께 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 정상 대조군에는 배지만을 처리하였다.

배양이 끝나고, 상등액을 취하여 IL-6 단백질 생성량을 효소결합 면역흡수 분석법(ELISA, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 키트를 사용하여 분석하였다.

그 결과, 효소처리된 홍삼 및 천마의 복합 추출물 처리시 LPS로 유도된 IL-6 단백질의 생성이 억제되는 것으로 나타났으며, 이러한 IL-6 단백질 생성 억제능은 농도 의존적인 것으로 나타났다(도 5 참조). 또한, 당가수분해 효소 처리된 실시예의 홍삼 및 천마의 복합추출물이 효소 처리된 홍삼 추출물의 단독처리군과 효소처리된 천마 추출물의 단독 처리군에 비해 큰 폭으로 개선된 IL-6 단백질 생성 억제 효과를 나타내는 것으로 관찰되어, 효소처리된 홍삼과 효소처리된 천마의 조합으로 인하여 시너지 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 7. 효소 처리된 홍삼 및 천마 복합 추출물의 최적 조합비 도출

상기 실시예 3 내지 6의 실험을 통해 효소처리된 홍삼과 효소처리된 천마의 조합이 갖는 피부 주름 개선 및 항산화에 대한 시너지 효과를 확인할 수 있었고, 더 나아가 효소 처리된 홍삼 및 천마 복합 추출물의 최적 조합비 도출을 위해 이들의 배합 비율을 달리하여 실험하였다.

7-1. 항산화 최적 비율

DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, Sigma, USA)의 환원력을 이용하는 상 등의 문헌(Sang S et al., J.Agric. Food Chem. 50(8), p2459-2463, 2002)에 기재된 방법에 따라, 본 발명에 따른 효소처리된 홍삼과 효소처리된 천마의 배합 비율을 달리하여 이들의 항산화 효과를 측정하였다.

실험은 메탄올에 녹인 0.2mM DPPH 용액 180ul와 증류수 20ul에 녹인 효소처리된 홍삼 및 천마의 복합 추출물과 알부틴(양성대조군)(50, 및 250㎍/㎖)을 96-웰 마이크로플레이트에 넣고 37℃에서 30 분간 배양한 후, 환원된 DPPH의 양을 분광 광도계(Precision microplate reader; Molecular Devices, VersaMax)를 이용하여 520nm에서 흡광도를 측정하여 시료를 가하지 않는 무첨가 대조군과 활성을 비교하였다.

상기 효소처리된 홍삼 및 천마의 복합 추출물은 12:1 내지 1:12의 중량 비율로 혼합하여 실험하였고, 상기 실험은 3회 반복하여 수행되었다.

그 결과, 효소 처리된 홍삼 및 천마의 복합 추출물은 홍삼 1 대비 천마 9 내지 11의 중량비로 혼합될 때 높은 항산화 효과가 있는 것으로 나타났고, 홍삼 1 대비 천마 10의 중량비로 혼합될 때 가장 높은 항산화 활성을 갖는 것으로 측정되었으며, 이러한 항산화 효과의 수치들은 양성대조군인 알부틴과 비교하였을 때도 더 우수한 것으로 나타났다(도 6 참조).

7-2. 피부주름 개선의 최적 비율

본 발명에 따른 효소처리된 홍삼과 효소처리된 천마의 배합 비율을 달리하여 이들의 주름개선 효과를 측정하였다.

실험은 실시예 4의 방법과 동일한 방법으로 수행하되, 상기 효소처리된 홍삼 및 천마의 복합 추출물은 12:1 내지 1:12의 중량 비율로 혼합하여 실험하였고, 상기 실험은 3회 반복하여 수행되었다.

그 결과, 효소 처리된 홍삼 및 천마의 복합 추출물은 홍삼 1 대비 천마 9 내지 11의 중량비로 혼합될 때 우수한 MMP-1 단백질 생성 억제 효과가 있는 것으로 나타났고, 홍삼 1 대비 천마 10의 중량비로 혼합될 때 가장 높은 MMP-1 단백질 생성 억제 활성을 갖는 것으로 측정되었다.

특히, 홍삼 1 대비 천마 10의 중량비로 혼합한 실험군에서 나타난 피부주름 개선 효과는 UVB를 조사하지 않은 음성대조군에서 측정된 MMP-1 단백질 생성 수치를 약간 상회하는 수준으로 나타났으며, 이를 통해 홍삼 1 대비 천마 9 내지 11의 중량비로 혼합되는 조합이 갖는 시너지 효과는 매우 우수한 것을 확인할 수 있었다(도 7 참조).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다.

따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

1. 당가수분해 효소 처리 홍삼 및 천마 추출물을 유효성분으로 포함하되,
   상기 효소 처리 홍삼 추출물은 홍삼 물 추출물을 셀룰라아제 효소로 당가수분해한 홍삼 추출물이고,
   상기 효소처리 천마 추출물은 천마 에탄올 추출물을 수용성 전분과 CGTase(Cyclodextrin glycosyltransferase) 효소를 이용하여 말토올리고실글루코시드(maltooligosylglucoside)로 변환한 후, 글루코아밀라아제 효소를 이용하여 당가수분해된 천마 추출물이며,
   상기 홍삼 및 천마 추출물은 1 : 9 내지 11의 중량비로 혼합된 것을 특징으로 하는,
   피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 당가수분해 효소 처리 홍삼 및 천마 추출물은 타입 I 프로콜라겐 유전자의 발현을 증가시키고, MMP-1((matrix metallo-proteinase 1) 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
4. 삭제
5. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 마스크팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저에서 선택된 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
6. 당가수분해 효소 처리 홍삼 및 천마 추출물을 유효성분으로 포함하되,
   상기 효소 처리 홍삼 추출물은 홍삼 물 추출물을 셀룰라아제 효소로 당가수분해한 홍삼 추출물이고,
   상기 효소처리 천마 추출물은 천마 에탄올 추출물을 수용성 전분과 CGTase(Cyclodextrin glycosyltransferase) 효소를 이용하여 말토올리고실글루코시드(maltooligosylglucoside)로 변환한 후, 글루코아밀라아제 효소를 이용하여 당가수분해된 천마 추출물이며,
   상기 홍삼 및 천마 추출물은 1 : 9 내지 11의 중량비로 혼합된 것을 특징으로 하는,
   피부 주름 예방 또는 개선용 약학적 조성물.
7. 삭제
8. 삭제
9. 제6항에 있어서,
   상기 약학적 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제에서 선택된 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 피부 주름 예방 또는 개선용 약학적 조성물.
10. 당가수분해 효소 처리 홍삼 및 천마 추출물을 유효성분으로 포함하되,
    상기 효소 처리 홍삼 추출물은 홍삼 물 추출물을 셀룰라아제 효소로 당가수분해한 홍삼 추출물이고,
    상기 효소처리 천마 추출물은 천마 에탄올 추출물을 수용성 전분과 CGTase(Cyclodextrin glycosyltransferase) 효소를 이용하여 말토올리고실글루코시드(maltooligosylglucoside)로 변환한 후, 글루코아밀라아제 효소를 이용하여 당가수분해된 천마 추출물이며,
    상기 홍삼 및 천마 추출물은 1 : 9 내지 11의 중량비로 혼합된 것을 특징으로 하는,
    피부 주름 예방 또는 개선용 식품 조성물.

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