KR101607593B1

KR101607593B1 - 피부 외관 개선용 조성물

Info

Publication number: KR101607593B1
Application number: KR1020130068020A
Authority: KR
Inventors: 허준혁; 최재환; 임영호; 박채규
Original assignee: 주식회사 한국인삼공사
Priority date: 2013-06-13
Filing date: 2013-06-13
Publication date: 2016-03-30
Also published as: KR20140145496A

Abstract

본 발명은 피부 외관 개선용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 홍삼의 물 또는 유기용매 추출물의 효소분해 정제물을 유효성분으로 포함하는 피부 외관 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 상기 홍삼의 물 또는 유기용매 추출물의 효소분해 정제물은 피부의 색소 침착 혹은 탄력 저하의 원인이 되는 염증 반응이나 알레르기 반응에 관여하는 효소인 5-리폭시게나아제의 활성을 억제하고, 일산화질소의 발생을 억제함으로써 피부 외관을 개선시켜주는 유효성분으로써 유용하게 사용할 수 있다.

Description

피부 외관 개선용 조성물{Composition for Improving Skin Appearances}

본 발명은 피부 외관 개선용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 홍삼의 물 또는 유기용매 추출물을 효소 분해시킨 후 크로마토그래피를 활용하여 정제시킨 조성물을 함유하며, 항염증 활성이 뛰어난 피부 외관 개선용 조성물에 관한 것이다.

인삼(Panax Ginseng)은 한의학뿐만 아니라 민간요법에서 자양강장제로 널리 사용되어 온 오가피(Araliaceae) 과의 인삼(Panax) 속에 속하는 식물로서, 수삼, 홍삼, 백삼, 산삼, 미삼, 원삼 등을 모두 포함하는 의미로 사용되고 있다. 현재까지 알려진 인삼의 약효로는 노화억제, 동맥경화 및 고지혈증 개선, 간기능항진, 방사선장애 제거, 면역증강, 항혈전, 뇌기능항진, 항스트레스, 혈당강하, 혈압강하, 항암 효과 등이 있다.

인삼은 가공방법에 따라 인삼의 원형을 유지하고 있는 수삼, 홍삼, 백삼 등 크게 3가지로 구분되는데, 수삼은 수확 후 건조되지 않은 인삼의 뿌리이며, 백삼은 수삼의 잔뿌리를 제거하고 껍질을 벗겨낸 다음, 햇볕에 말린 인삼의 뿌리이다. 홍삼은 인삼의 뿌리를 쪄서 말리는 방법에 의해 제조된다. 인삼의 사포닌은 부신에서 카테콜아민(Cartecholamine)의 분비를 촉진하고 지질의 과산화 과정을 저해함으로써 항산화 활성을 지니며 방사선에 대한 방어효과, 알킬화제에 의한 염색체 이상 및 미세핵 방어효과, 배양세포에서 돌연변이 감소 및 세포변형 감소 효과가 있음이 보고된 바 있다. 최근에는 홍삼에서 효능이 알려진 특정 진세노사이드의 함량을 집중적으로 높여 효과를 극대화 하는 연구도 진행되고 있다.

한편, 피부는 외부 환경에 직접적으로 노출되는 신체 부위로서, 과도한 자외선이나 오염물질 또는 자극원에 노출되면 활성산소의 발생이 급격히 증가하여 노화반응이 촉진되고 피부 자극 및 염증 반응이 유발된다. 이러한 활성산소 형성 및 염증 반응은 공통적으로 피부 자극 스트레스를 일으키며 이에 의한 피부 노화 및 염증 반응 과정에서 생성되는 물질들이 피부의 색소 침착과 피부 탄력 섬유의 붕괴를 촉진시켜 피부 주름의 증가에까지 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 1).

이에, 본 발명자들은 홍삼의 물 또는 유기용매 추출물의 특정한 분획물이 뛰어난 항염 활성을 나타내는 것을 확인하고, 이를 피부 외관의 개선에 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

Toxicol In Vitro, 18:231-43 (2004); Irritant dermatitis, 87-111(1996)

본 발명의 목적은 피부 염증 작용 억제를 통해 피부 외관 개선 효과를 갖는 홍삼 추출물의 특정한 효소분해 정제물을 포함하는 피부 외관 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 홍삼의 물 또는 유기용매 추출물의 효소분해 정제물을 포함하는 피부 외관 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 홍삼은 수삼, 바람직하게는 6년근 수삼을 정선하여 껍질을 벗기지 않은 채 증기로 쪄서 건조시킨 담황갈색 또는 담적갈색의 인삼인 것이 바람직하다. 홍삼은 특수 가공기술로 증숙, 건조시키는 과정 중에 우리 몸에 유익한 항암성분(진세노사이드 Rh2), 암세포 독소 활성 억제성분(파낙사트리올), 혈소판 응집 억제성분(말톨), 비만 억제 성분 등 여러 생리활성 성분들이 생성되며, 미량의 정유 성분을 함유한다.

본 발명에 있어서, "피부"란 용어는 인체의 체표를 덮는 조직을 의미하는 것으로서, 얼굴 또는 몸뿐만 아니라 두피와 모발을 포함하는 가장 광범위한 개념을 포괄하는 의미로 사용된다. 또한, "피부 외관 개선"이란 표현은 피부 투명도를 증가시키고, 피부 거칠기와 피부 각질량을 감소시키는 작용을 포괄적으로 의미한다.

상기 홍삼의 물 또는 유기용매 추출물의 효소분해 정제물은 홍삼으로부터 추출 및 분리된 것으로서, 본 발명의 한 구현예에 따르면 홍삼을 물 또는 유기용매로 추출하고, 상기 추출물에 효소 처리를 한 후 크로마토그래피를 통해 특정 진세노사이드를 강화시켜 정제함으로써 수득할 수 있다. 그러나, 상기 홍삼 대신에 수삼, 백삼, 산삼, 미삼, 원삼 등의 다른 형태의 인삼도 제한없이 사용될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 효소로는 펙티나아제(pectinase), β-글루카나아제(glucanase), 셀룰라아제(cellulase), β-글루코시다아제(glucosidase)를 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 또한, 상기 유기용매로는 C₁ 내지 C₄의 알코올, 헥산, 에테르, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 에틸아세테이트, 메틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸아세테이트, 벤젠, 또는 이들의 혼합 용매뿐만 아니라 그 수용액이 제한없이 사용될 수 있다. 상기 홍삼은 재배한 것 또는 시판되는 것 등을 제한 없이 사용할 수 있으며, 깨끗하게 세척하고 건조하여 사용한다. 본 발명의 한 구현예에 따르면, 건조된 홍삼은 적당한 크기로 분쇄하여 추출용기에 넣고 적당한 양의 용매, 바람직하게는 정제수, C₁ 내지 C₄의 알코올, 헥산, 에테르, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 에틸아세테이트, 메틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸아세테이트, 벤젠 및 이들의 혼합 용매, 보다 바람직하게는 에탄올을 넣고 추출하여 추출물을 얻을 수 있다. 상기 추출 과정은 수회 반복될 수 있으며, 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류추출 또는 가열추출 등과 같이 본 기술분야에 알려진 임의의 추출 방법을 제한없이 사용할 수 있다. 선택적으로는, 이후에 농축 또는 동결건조 등의 방법을 추가적으로 거칠 수 있다. 상기 추출물에 효소를 처리를 한 후 크로마토크래피를 적용함으로써 특정 활성 성분의 함량을 높일 수 있다. 본 발명의 한 구현예에 따르면, 펙티나아제, β-글루카나아제, 셀룰라아제 및 β-글루코시다아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소 혼합물을 이용함으로써 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 등을 진세노사이드 Rd 등이 강화된 조성물을 얻을 수 있다.

상기 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 세파덱스 컬럼 크로마토그래피 또는 이온교환수지 컬럼 크로마토그래피 등이 제한없이 사용될 수 있고, 바람직하게는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피가 사용될 수 있다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 시 이동상으로는 클로로포름, 메탄올, 부탄올 및 에틸아세테이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유기 용매의 혼합 용매를 사용할 수 있고, 바람직하게는 클로로포름:메탄올 혼합 용매, 클로로포름:메탄올:물 혼합 용매 및 부탄올:에틸아세테이트 혼합 용매를 순차적으로 사용할 수 있다. 본 발명의 한 구현예에 따르면, 이때 사용되는 상기 클로로포름:메탄올 혼합 용매의 부피비는 10:1 내지 1:1 범위이고, 클로로포름:메탄올:물 혼합 용매의 부피비는 50:10:1 내지 1:1:1 범위이며, 부탄올:에틸아세테이트 혼합 용매의 부피비는 1:1 내지 1:5 범위인 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 크로마토그래피는 특정 활성 성분의 함량을 높이기 위해 1회 내지 수회에 걸쳐 수행할 수 있으며, 필요에 따라 결과물에 대한 농축, 재결정을 실시할 수도 있다.

본 발명의 피부 외관 개선용 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되지 않고, 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 조성물은, 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 에센스, 로션, 영양 크림, 마사지 크림, 팩, 페이스트, 젤, 파우더, 스프레이, 연고, 패치, 분무제, 리니먼트제, 파스타아제 또는 카타플라스마제 등과 같은 화장료 조성물의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있고, 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있으며, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용될 수 있고, 예를 들어 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으며, 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다. 구체적으로, 유연화장수는 프로필렌글리콜, 글리세린 등의 다가알코올류 1.0 내지 10.0 중량%, 및 폴리에틸렌올레일에테르, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유 등의 계면활성제 0.05 내지 2.0 중량%를 함유할 수 있다. 영양화장수 및 영양 크림은 홍삼오일 이외에 스쿠알란, 바셀린, 옥틸도데칸올과 같은 오일류 5.0 내지 20.0 중량%, 및 세탄올, 스테아릴알코올, 밀납 등의 왁스성분 3.0 내지 15.0 중량%를 함유하고, 에센스는 글리세린, 프로필렌글리콜 등 다가알코올류 5.0 내지 30.0 중량%를 함유한다. 마사지 크림은 홍삼 오일 이외에 유동파라핀, 바셀린, 이소노닐이소노나노에이트 등의 오일을 30.0 내지 70.0 중량% 함유하여 제조되며, 팩은 폴리비닐알코올을 5.0 내지 20.0 중량% 함유하는 필오프(peel off) 팩 또는 일반유화형 화장료에 카올린, 탈크, 산화아연, 이산화티탄 등의 안료가 5.0 내지 30.0 중량% 함유된 워시오프(wash off) 팩으로 제조될 수 있다. 이외에도 본 발명의 화장료 조성물에는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알코올, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 정제수 등을 배합 성분으로서 추가로 첨가할 수 있으며, 총 중량에 대해 바람직하게는 0.001 내지 5.0 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 3.0 중량%로 첨가될 수 있다.

본 발명의 한 구현예에 따르면, 홍삼추출물에 일반적으로 함유되어 있는 사포닌 중 파낙사디올계인 진세노사이드 Rb1, Rb2 및 Rc는 5-리폭시게나아제(lipoxygenase)의 활성을 감소시키는 효과가 없는 것과 대조적으로, 진세노사이드 Rd는 5-리폭시게나아제의 활성을 현저히 감소시키는 것으로 확인된다(표 1 및 도 1 참조). 상기 5-리폭시게나아제는 아라키돈산으로부터 생체내 염증반응이나 알레르기 반응 등에 관여하는 다양한 화학적인 매개체 역할을 하는 여러 물질들을 생성한다. 따라서, 5-리폭시게나아제를 저해하는 물질은 각종 화학적 매개자(chemical mediator)의 생성을 억제하는 결과를 가져오게 되므로, 염증, 알레르기 억제에 유효하게 작용할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 홍삼의 물 또는 유기용매 추출물의 효소분해 정제물은 농도에 상관없이 사람 섬유아세포에 대해 세포독성이 없는 안전한 물질인 것으로 확인된다(표 2 참조).

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 홍삼의 물 또는 유기용매 추출물의 효소분해 정제물과 일반 홍삼 추출물에서 정제한 조사포닌의 일산화질소(nitric oxide) 생성량을 비교한 결과, 상기 홍삼의 물 또는 유기용매 추출물의 효소분해 정제물이 항염증 작용 억제를 증진시킬 수 있음을 확인할 수 있다(표 3, 표 4 및 도 2 참조). 실험에 활용된 조사포닌과 상기 홍삼의 물 또는 유기용매 추출물의 효소분해 정제물의 개별 사포닌을 분석한 결과, 진세노사이드 Rd를 제외한 대부분의 개별 사포닌이 조사포닌에 많이 함유되어 있음에도 일산화질소의 생성량은 상기 홍삼의 물 또는 유기용매 추출물의 효소분해 정제물에서 높게 나타남으로써 진세노사이드 Rd가 유효성분 중 하나로 작용할 수 있음을 알 수 있다(도 3 참조).

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 홍삼의 물 또는 유기용매 추출물의 효소분해 정제물의 실제 피부 효과를 확인하기 위해서 피부염을 앓고 있는 피험자를 대상으로 상기 효소분해 정제물을 포함하는 조성물이 함유된 제형을 피부에 8주간 도포한 결과, 피부 염증이 완화됨으로써 피부 외관이 개선됨을 확인할 수 있다(도 4 참조).

종래에 있어서, 주로 연구 목적 등을 위해 수차례의 정제를 거쳐 순도 95% 이상의 특정한 진세노사이드 성분(예컨대, 진세노사이드 Rd)을 분리한 후 이를 이용하여 소정의 실험 결과를 얻은 것과 대조적으로, 본 발명의 방법에 있어서는 상업적 목적을 위하여 특정 진세노사이드 성분에 대한 정제 과정은 최소화시킨 후 대량 생산이 가능하고 비용이 적은 효소분해 반응을 통해 특정한 진세노사이드 성분의 함량이 상대적으로 높은 홍삼 추출물물의 효소분해 정제물을 얻고 있으며, 이를 이용하여 상업적으로 제품화가 가능한 수준의 항염 및 피부 임상 결과를 얻을 수 있다.

따라서, 본 발명의 홍삼의 물 또는 유기용매 추출물의 효소분해 정제물을 포함하는 화장료 조성물은 염증 작용을 효과적으로 억제시킬 수 있으므로, 염증으로 인해 유발되는 피부자극, 피부 손상 등을 억제하여 외관을 개선하는데 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명에 따른 홍삼의 물 또는 유기용매 추출물의 효소분해 정제물은 염증을 유발하는데 관여하는 효소인 5-리폭시게나아제의 활성과 염증 과정에서 발생하는 일산화질소의 발생을 억제할 수 있으므로, 염증 반응 억제를 통한 피부 외관 개선에 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은 파낙사디올계에 속하는 다양한 진세노사이드들의 5-리폭시게나아제 활성 억제 정도를 보여주는 그래프이다.
도 2는 홍삼에서 추출한 조사포닌과 본 발명에 따른 홍삼 유기용매 추출물의 효소분해 정제물의 일산화질소 생성량 억제 효능을 비교한 그래프이다.
도 3은 도 2에서 이용된 조사포닌과 본 발명에 따른 홍삼 유기용매 추출물의 효소분해 정제물의 주요 사포닌 함량을 보여주는 그래프이다.
도 4는 피부염을 앓고 있는 피험자를 대상으로 본 발명에 따른 홍삼 유기용매 추출물의 효소분해 정제물을 피부에 8주간 도포한 결과 피부 염증이 완화됨으로써 피부 외관이 개선됨을 보여주는 사진이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 홍삼 추출물의 효소분해 정제물의 제조

6년근 홍삼 1 ㎏을 건조하여 세절한 후 실온에서 에탄올 2.5 ℓ를 사용하여 3 일 동안 냉침을 5 회 반복한 후 필터링을 통해 잔사를 제거하고 10 ℓ 물 포화 부탄올로 추출한 후 농축시켜 정제된 홍삼 추출물 분말을 얻었다. 0.4 g의 정제된 홍삼 추출물 분말을 5 ㎖의 에탄올에 분산시킨 후 0.8 g의 효소 혼합물(펙티나아제, β-글루카나아제, 셀룰라아제, β-글루코시다아제)과 섞어주었다. 여기에 10 ㎖의 나트륨 아세테이트 버퍼를 첨가하고 부피가 50 ㎖가 될 때까지 정제수를 섞은 후 37℃에서 72시간 동안 효소 반응시켰다. 이후, 2 배 부피의 에탄올을 첨가한 후 10 분간 끓여서 효소 반응을 중단시킨 후 원심분리하여 상층액만을 얻어내었다. 상기 상층액을 부탄올로 3 회 추출하였고, 상기 부탄올 분획물을 감압 농축한 후 10 배에 해당하는 정제수를 넣어 수분산시켰다. 이후, 동량의 에테르를 첨가하여 에테르층과 수층으로 나눈 후, 수층을 역상 실리카겔을 이용하여 4 개의 분획층을 얻었다. 그 중 3 번째 분획층에서 얻은 분획물을 실리카겔 컬럼에 CHCl₃-MeOH-H₂0(65:35:10)을 이동상으로 이동시켰고, 이를 다시 BuOH-EtOAc-H₂O(4:1:5)로 재이동시킨 후 정제함으로써 정제된 진세노사이드 강화 추출물을 얻었다.

실시예 2. 홍삼추출물의 효소분해 정제물을 포함하는 제형의 제조

실시예 1에서 제조한 홍삼추출물의 효소분해 정제물을 70℃로 가온한 정제수에 카르복실비닐폴리머를 분산시킨 후 실시예 1에서 제조한 홍삼추출물의 효소분해 정제물을 첨가하였다. 상기 효소분해 정제물이 충분히 용해된 후에 트리에탄올아민으로 pH를 6 까지 중화시켰다. 점증이 완료된 후, 미생물 오염을 방지하기 위하여 1,2-헥산디올을 1%를 첨가하여 홍삼추출물의 효소분해 정제물을 포함하는 제형을 제조하였다.

실험예 1. 개별 진세노사이드의 5-리폭시게나아제 활성 억제 효과 측정

개별 진세노사이드의 5-리폭시게나아제 활성 억제도를 측정하기 위하여, 200 mM 농도의 트리스(히드록시메틸) 아미노메탄(Sigma, USA) HCl를 이용하여 pH를 8.6로 맞춘 완충 용액과 기질 역할을 하는 리놀레산(Sigma, USA)을 에탄올에 300 μM로 녹인 기질 용액을 준비하였다. 상기 완충 용액 3 ㎖과 기질 용액 100 ㎕를 잘 섞어준 후 평가할 개별 진세노사이드 시료 혹은 대조군(NDGA: nordihydro- guaiaretic acid) 100 ㎕를 잘 혼합하였다. 이후, 100,000 유닛/㎖의 대두 리폭시게나아제(Sigma, USA) 60 ㎕를 첨가한 후 상온에서 20 분 동안 효소 반응시켰다. 효소 반응이 종료된 후 UV/Vis 분광광도계를 이용하여 234 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 다양한 진세노사이드 중에서 진세노사이드 Rd를 처리할 경우 0.25, 0.5 및 1 ㎎/㎖의 농도에서 각각 61.3%, 69.5% 및 81.2%의 5-리폭시게나아제 활성 저해도를 나타내었다(표 1 및 도 1).

시료 농도	5-리폭시게나아제 활성 저해도(%)
시료 농도	Rb2	Rc	Rb1	Rd	NDGA
0.25 ㎎/㎖	9.2	18.1	13.4	61.3	0.0
0.5 ㎎/㎖	10.3	28.0	25.1	69.5	50.2
1 ㎎/㎖	10.6	32.3	34.0	81.2	0.0

실험예 2. 홍삼추출물의 효소분해 정제물의 세포독성 측정

상기 실시예 1에서 제조된 홍삼추출물의 효소분해 정제물의 세포독성을 확인하기 위하여, MTT 환원법(3(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide reduction method)을 수행하였다. 구체적으로, 소 혈청 10%를 함유하는 DMEM 배지(Dulbeco's modified eagle medium; Gibco, USA)를 사용하여 사람 섬유아세포(ATCC 2076)를 1×10⁵ 세포수의 밀도로 24-웰 플레이트에 분주하였다. 1 일 후 새로운 배지(DMEM, 소 혈청 0%)로 갈아주면서 실시예 1에서 제조한 홍삼추출물의 효소분해 정제물을 0.5, 1.0, 2.5 및 5.0 ㎎/㎖의 농도로 처리한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이때, 상기 효소분해 정제물을 처리하지 않은 시료를 대조군으로 사용하였다. 그 후, 세포를 PBS로 세척하였고, MTT(2.5 ㎎/㎖)를 DMEM 배지에 10배 희석시킨 희석액을 1 ㎖ 첨가한 후 37℃에서 4 시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후 배지를 버렸고, DMSO 0.5 ㎖를 첨가하여 상온에서 10 분 동안 완전히 녹인 후 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 상기 실험을 3회 반복하여 세포독성을 측정하였다.

그 결과, 실시예 1에서 제조된 홍삼추출물의 효소분해 정제물은 모든 농도에서 세포독성이 없는 안전한 물질인 것으로 확인되었다(표 2).

추출물	농도(㎍/㎖)	세포생존도(%)
대조군	0	100.0±0.00
실시예 1의 효소분해 정제물	0.5	103.0±0.26
	1.0	102.5±0.33
	2.5	100.2±0.21
	5.0	101.4±1.53

실험예 3. 홍삼 조사포닌과 홍삼추출물의 효소분해 정제물의 일산화질소 생성 억제 효능 비교

상기 실시예 1에서 제조된 홍삼추출물의 효소분해 정제물과 일반적인 홍삼 조사포닌의 항염 효능을 평가하기 위하여, 염증 반응의 주요 지표로 활용되는 일산화질소의 생성 억제 효능을 비교하였다.

대식세포에서 유래된 RAW 264.7 세포주를 소 혈청 10%를 함유하는 DMEM을 사용하여 1×10⁶ 세포수의 밀도로 48-웰 플레이트에 분주하였다. 1 일 후 새로운 배지에 대장균에서 유래된 지질당(Lipopolysaccharide; Sigma-Aldrich, USA) 1 ㎍/㎖과 상기 실시예 1에서 제조된 홍삼추출물의 효소분해 정제물 또는 일반적인 홍삼 조사포닌 시료를 1, 10 및 100 ㎍/㎖의 농도로 함께 처리하였다. 상기 홍삼 조사포닌을 얻기 위하여, 홍삼 미분 1 ㎏을 에탄올 10 ㎏에 3 회 환류 추출하였다. 추출 온도는 75∼80℃에서 수행하였으며, 1 회당 추출은 5 시간씩 추출하였다. 추출이 완료된 후 냉각 후 추출액을 회수하여 감압농축시킨 후 농축 분말을 수분산시켰다. 상기 수층을 다시 수포화 부탄올(n-butanol)로 3 회 추출한 후 부탄올 분획물을 감압 농축하고, 105℃에서 2 시간 건조하여 약 70 g의 홍삼 조사포닌 건조 분말을 회수하였다. 상기 홍삼추출물의 효소분해 정제물 또는 일반적인 홍삼 조사포닌 시료 처리군을 37℃에서 1 일 동안 배양한 후, 배양된 배지 100 ㎕를 96-웰 프레이트로 옮겨놓았고, Griess reagents Ⅰ과 Ⅱ(Intron biotech, Korea)를 각각 50 ㎕씩 처리하여 상온에 10 분 정도 반응 시킨 후, 540 ㎚에서 흡광도를 측정하여 일산화질소의 생성량을 확인하였다.

그 결과, 일반적인 조사포닌의 경우 농도에 따라 19.8% 내지 34.8% 정도 일산화질소의 생성량을 억제시킨 반면, 본 발명의 홍삼추출물의 효소분해 정제물은 농일 농도에서 45.4% 내지 63.9% 정도 일산화질소의 생성량을 억제시켜 훨씬 효과적인 항염 효능을 보임을 확인하였다(표 3, 표 4 및 도 2).

540 ㎚에서의 흡광도

	대조군	DMSO	LPS	시료의 농도(㎍/㎎)
	대조군	DMSO	LPS	100	10	1
조사포닌	0.074	0.072	0.250	0.189	0.202	0.215
실시예 1의 정제물	0.072	0.072	0.272	0.144	0.178	0.181

일산화질소 억제 효능(%)

	시료의 농도(㎍/㎎)
	100	10	1
조사포닌	34.8%	27.2%	19.8%
실시예 1의 정제물	63.9%	47.1%	45.4%

실험예 4. 홍삼 조사포닌과 홍삼추출물의 효소분해 정제물의 주요 사포닌 함량

홍삼 조사포닌과 본 발명의 홍삼추출물의 효소분해 정제물의 주요 사포닌 함량을 비교하기 위하여, 측정 시료를 HPLC용 메탄올 5 ㎖에 용해시킨 후 0.45 ㎛ 주사기 여과기(Millipore, Billerica, MA, USA)로 여과하였고, 이를 HPLC(Younglin ACME 9000 system, Anyang, Korea)로 분석하였다. 이 때, 칼럼은 Mightysil RP-18 GP(4.6 ㎜×250 ㎜, 5 ㎛, Kanto Chemical Co. INC, Tokyo, Japan), 이동상은 용매 A를 아세토니트릴, B를 H₂O로 사용하여 A:B의 초기비율을 18:82로 시작하여 42 분에 24:76, 46 분에 29:71, 75 분에 40:60, 100 분에 65:35, 135 분에 85:15, 150 분에 85:15, 151 분에 18:82의 비율로 단계적으로 흘려주었고, 유속은 0.6 ㎖/분, 주사 부피(injection volume)는 20 ㎕를 사용하였다. 검출기는 UV-검출기(203 ㎚)를 사용하였으며, 검량선을 작성하기 위하여 개별 진세노사이드 표준품(앰보연구소, Daejeon, South Korea) 을 구입하여 정량하였다.

그 결과, 홍삼 조사포닌에 있어서는 진세노사이드 Rb1의 함량이 다른 진세노사이드와 비교하여 상대적으로 높고, Rg1, Re, Rc 및 Rb2 등의 진세노사이드가 그 다음 비중을 차지하고 있는 것과 대조적으로, 본 발명의 홍삼추출물의 효소분해 정제물은 진세노사이드 Rd의 함량 비중이 상대적으로 높고, 그 다음으로 Rb2의 비중이 높은 것으로 나타났다(도 3).

실험예 5. 홍삼추출물의 효소분해 정제물이 포함된 제형을 통한 피부 외관 개선 효능 평가

상기 실시예 2에서 제조된 본 발명의 홍삼추출물의 효소분해 정제물을 포함하는 제형을 피부염을 앓고 있는 피험자의 환부에 8 주간 하루 2 회 도포한 후 도포 전과 도포 후의 외관을 촬영하여 염증으로 인한 붉어짐, 상처 등의 외관이 개선되는 효능을 육안으로 평가하였다.

그 결과, 본 발명의 효소분해 정제물을 도포한 피험자의 피부 염증이 완화되어 피부 외관이 개선됨을 확인하였다(도 4).

제조예 1. 화장료 조성물의 제조

1-1. 유연 화장수의 제조

본 발명의 홍삼의 물 또는 유기용매 추출물의 효소분해 정제물을 유효성분으로 함유하는 유연 화장수를 하기 표 5의 조성과 같이 제조하였다.

원료	함량(중량부)
실시예 1의 홍삼 추출물의 효소분해 정제물	10.00
1,3-부틸렌글리콜	1.00
디소듐이디티에이	0.05
알란토인	0.10
디포타슘글리시리제이트	0.05
시트릭애씨드	0.01
소듐시트레이트	0.02
글리세레스-26	1.00
알부틴	2.00
하이드로제네이티드캐스터오일	1.00
에탄올	30.00
보존제	미량
착색제	미량
착향제	미량
정제수	잔량

1-2. 영양 크림의 제조

본 발명의 홍삼의 물 또는 유기용매 추출물의 효소분해 정제물을 유효성분으로 함유하는 영양 크림를 하기 표 6의 조성과 같이 제조하였다.

원료	함량(중량부)
실시예 1의 홍삼 추출물의 효소분해 정제물	10.0
1,3-부틸렌 글리콜	7.0
글리세린	1.0
D-판테놀	0.1
식물 추출물	3.2
마그네슘알루미늄실리케이트	0.3
PEG-40 스테아레이트	1.2
스테아릭애씨드	2.0
폴리소르베이트 60	1.5
친유형글리세릴스테아레이트	2.0
소르비탄세스퀴올리에이트	1.5
세테아릴알코올	3.0
미네랄오일	4.0
스쿠알란	3.8
카르릴릭/카프릭트리글리세라이드	2.8
식물성 오일	1.8
디메치콘	0.4
디포타슘글리시리제이트	미량
알란토인	미량
소듐 히아루로네이트	미량
토코페릴아세테이트	적량
트리에탄올아민	적량
보존제	적량
착향제	적량
정제수	잔량

1-3. 로션의 제조

본 발명의 홍삼의 물 또는 유기용매 추출물의 효소분해 정제물을 유효성분으로 함유하는 로션을 하기 표 7의 조성과 같이 제조하였다.

원료	함량(중량부)
실시예 1의 홍삼 추출물의 효소분해 정제물	3.5
세토스테아릴알코올	1.6
스테아린산	1.4
친유형모노스테아린산글리세린	1.8
피이지-100 스테아레이트	2.6
세스퀴올레인산소르비탈	0.6
스쿠알렌	4.8
마카다이아오일	2
호호바오일	2
초산토코페롤	0.4
메칠폴리실록산	0.2
에칠파라벤	0.1
초산토코페롤	0.4
메칠폴리실록산	0.2
에칠파라벤	0.1
프로필파라벤	0.1
1,3-부칠렌글리콜	4
메칠파라벤	0.1
산탄검	0.1
글리세린	4
d-판데놀	0.15
알란토인	0.1
카르보머(2% aq. Sol)	4
트리에탄올아민	0.15
에탄올	3
pt 41891	0.1
p-H20	48.3

Claims

홍삼의 유기용매 추출물의 효소분해 정제물을 포함하는 피부 염증 완화에 의한 피부 외관 개선용 화장료 조성물로서,
상기 홍삼의 유기용매 추출물의 효소분해 정제물은
(1) 홍삼을 유기용매로 추출한 후, 에탄올에 분산시키고, 펙티나아제, β-글루카나아제, 셀룰라아제 및 β-글루코시다아제로 이루어진 효소 혼합물로 효소 처리 단계;
(2) 상기 효소 처리물의 상층액을 부탄올로 추출하여 얻어진 부탄올 분획물을 농축하는 단계;
(3) 상기 농축된 부탄올 분획물을 정제수로 수분산시키고, 정제수와 동량의 에테르를 첨가하여 에테르층과 수층으로 나눈 후, 상기 수층을 역상 실리카겔 컬럼을 이용하여 4 개의 분획층을 얻는 단계; 및
(4) 상기 분획층 중 3 번째 분획층의 분획물을 실리카겔 컬럼에 클로로포름:메탄올:물 혼합용매를 이동상으로 하여 이동시키고, 이를 다시 부탄올:에틸아세테이트:물 혼합용매를 이동상으로 하여 재이동시켜 정제하는 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 피부 염증 완화에 의한 피부 외관 개선용 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 유기용매는 에탄올 또는 그 수용액인 화장료 조성물.
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청구항 1에 있어서,
상기 클로로포름:메탄올:물 혼합 용매의 부피비는 50:10:1 내지 1:1:1 범위인 화장료 조성물.
청구항 8에 있어서,
상기 클로로포름:메탄올:물 혼합 용매의 부피비는 65:35:10인 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서,
부탄올:에틸아세테이트:물 혼합 용매의 부피비는 4:1:5인 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서,
5-리폭시게나아제의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서,
유연화장수, 영양화장수, 에센스, 로션, 영양 크림, 마사지 크림, 팩, 페이스트, 젤, 파우더, 스프레이, 연고, 패치, 분무제, 리니먼트제, 파스타아제 및 카타플라스마제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 한 제형을 갖는 화장료 조성물.