KR20220059795A

KR20220059795A - 싸이클로덱스트린글루카노트란스퍼라제를 이용한 능이, 국화, 목련 복합 추출물의 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20220059795A
Application number: KR1020200145392A
Authority: KR
Inventors: 김지현; 서은경; 남승옥; 김동민
Original assignee: (주) 에이텍
Priority date: 2020-11-03
Filing date: 2020-11-03
Publication date: 2022-05-10
Also published as: KR102459512B1

Abstract

본 발명은 CGTase(Cyclodextrin Glucanotransferase)를 이용한 능이, 국화 및 목련 복합추출물의 유효성분을 함유하는 항산화, 피부미백 및 보습 화장료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이며, CGTase(Cyclodextrin Glucanotransferase)를 이용한 능이, 국화 및 목련 복합추출물의 유효성분으로 화장료 총중량에 대하여 0.01 내지 20.0중량% 함유한다.
본 발명의 항산화, 피부미백 및 보습 화장료 조성물은 피부에 안전하면서도 효소에 의한 능이, 국화 및 목련의 복합성분에 의한 상승작용으로 우수한 멜라닌생성 억제, 및 항산화 활성을 나타내므로 피부 미백, 주름개선과 탄력증진 및 보습력에 따른 효과가 우수하다.

Description

싸이클로덱스트린글루카노트란스퍼라제를 이용한 능이, 국화, 목련 복합 추출물의 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물{Method for preparing complex extracts of neungi, chrysanthemum, and magnolia using Cyclodextrin Glucanotransferas and cosmetic composition containing the same}

본 발명은 싸이클로덱스트린글루카노트란스퍼라제(CGTase)를 이용한 능이, 국화 및 목련의 복합추출물 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 항산화, 피부미백 및 보습 화장료 조성물에 관한 것이다.

최근 산업이 급속도로 발전하고 소득 수준이 향상되면서 외모의 아름다움 등의 유지와 함께 피부노화의 방지 내지 개선을 위한 관심이 높아지고 있으며, 이러한 이유로 바이오벤처 및 화장품, 생명공학 업계에서는 피부노화를 억제하기 위하여 천연소재의 고기능성을 활용하는 연구 개발이 활발하게 이루어지고 있다.

피부노화 현상의 지연 내지 개선을 위해서는 콜라겐합성 촉진 또는 세포재생 기능을 부여하거나 활성산소를 제거할 수 있는 항산화제의 사용이 필요하며, 대표적인 항산화제로서는 수퍼옥사이드디스뮤타제(SOD) 라는 효소와 비타민 C, 비타민 E(토코페롤), 플라보노이드 등이 있고 또한 콜라겐합성 촉진물질로는 비타민C, 비타민 A(retinoic acid), 피부성장인자(EGF) 등이 있지만, 이러한 항산화제들은 불안정하기 때문에 장기간의 유통기간을 갖는 화장품에 적용이 쉽지 않고, 과량 사용 시 피부에 부작용을 일으킬 수 있는 문제점이 있으며, 상기한 문제점을 개선하기 위하여 여러 종류의 천연물질을 유효성분으로 한 화장용 조성물이 개발되고 있으나, 대부분의 경우에 항산화작용, 안정성 등의 효과가 미흡한 것으로 알려져 있다.

화장품을 이용한 피부의 노화 지연을 위한 노력에 있어서 화장품 성분의 안정화 기술은 그 기능을 극대화 시키는데 있어서 중요하며, 마이크로캡슐화, 리포좀, 액정공법 등에 의해 화장료 유효성분의 안정성을 개선하고 있다.

한편, 싸이클로덱스트린글루카노트란스퍼라제는 환상의 사이클로덱스트린을 생성하는 효소이며, 환상의 사이클로덱스트린(cyclodextrin)은 그 구조적 특성을 이용하여 분자내 소수성 부위에 각종 소수성 화합물을 포접시켜 포접 복합체를 형성시켜 포접된 물질의 용해성 및 안정성 증진, 서방형(徐放型) 성질을 향상시켜 생체 이용률을 증가시키는 연구가 다양하게 진행되고 있다.

효소를 이용한 화장품 조성물의 제조방법과 관련한 선행기술로 예를 들면, 특허문헌1에 단백질 분해효소인 아라자임 0.01 내지 10중량%, 천연 한방식물 추출물 20 내지 30중량%, 양성계면활성제 5 내지 15중량% 및 정제수 20 내지 55중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 두발용 화장품 조성물을 개시하고 있으며, 특허문헌2에 백부자, 백지, 영릉향, 향부자, 백복령 및 감송향의 혼합생약재를 용매 추출하여 혼합생약재 조추출물을 제조한 다음, 상기 혼합생약재 조추출물을 탄수화물 가수분해효소와 펙틴 가수분해효소로 처리하여 얻는 것을 특징으로 하는 피부 주름개선용 혼합생약재 추출물을 개시하고 있다.

또 특허문헌3에는 당가수분해 효소 처리 홍삼 및 천마 추출물을 유효성분으로 포함하되, 상기 효소 처리 홍삼 추출물은 홍삼 물 추출물을 셀룰라아제 효소로 당가수분해한 홍삼 추출물이고, 상기 효소처리 천마 추출물은 천마 에탄올 추출물을 수용성 전분과 CGTase(Cyclodextrin glycosyltransferase)효소를 이용하여 말토올리고실글루코시드(maltooligosylglucoside)로 변환한 후, 글루코아밀라아제 효소를 이용하여 당가수분해된 천마 추출물이며, 상기 홍삼 및 천마 추출물은 1 : 9 내지 11의 중량비로 혼합된 것을 특징으로 하는 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 개시하고 있다.

본 발명의 발명자는 싸이클로덱스트린글루카노트란스퍼라제(CGTase)를 이용하여 능이, 국화 및 목련의 생리활성물질의 생성을 향상시키면서 안정성이 높은 항산화, 피부미백 및 보습 효과가 우수한 화장품을 개발하고 본 발명을 완성하게 되었다.

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10-0828379

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10-2139156

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본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 싸이클로덱스트린글루카노트란스퍼라제를 이용한 능이, 국화 및 목련의 복합추출물 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 항산화, 피부미백 및 보습 화장료 조성물의 제공에 관한 것이다.

보다 구체적으로는 능이, 국화 및 목련 복합추출물에 싸이클로덱스트린글루카노트란스퍼라제(Cyclodextrin glycosyltransferase; CGTase)를 첨가하여 유효성분인 복합추출물을 고농도로 함유시키면서 안정성을 향상시킨 항산화, 피부미백 및 보습 화장료 조성물의 제공을 목적으로 하는 것이다.

본 발명에서 과제의 해결수단으로 싸이클로덱스트린글루카노트란스퍼라제(CGTase)를 이용한 능이, 국화, 목련 복합 추출물의 제조방법은 능이, 국화, 및 목련의 복합 추출물을 얻는 공정 및 상기 복합 추출물에 싸이클로덱스트린글루카노트란스퍼라제를 첨가하여 유효성분인 능이, 국화, 및 목련의 복합 추출물을 포접시켜 복합추출물이 포접된 포접물을 제조하는 공정을 포함하는 것으로 이루어진다.

상기한 능이는 향이 매우 진해서 향이(향버섯)라고도 부르고 있으며, 본래 이름은 웅이(熊茸)이고 방언으로는 능이(能耳)라고 한다고 19세기 중엽의 문헌인 이규경(李圭景)의 『오주연문장전산고(五洲衍文長箋散稿)』에 기록되어 있으며 피부노화를 늦춰주며, 혈액을 맑게 해주는 효능이 있다. 능(能)도 곰이라는 뜻이 있으므로 결국 우리말로 곰버섯이었던 버섯이 한자식으로 웅이 또는 능이로 불리다가 능이로 정착된 것으로 보인다.

국화에는 인체에 유용한 성분인 쿠산테논과 같은 정유와 아데닌, 프린, 베아틴, 황색색소인 크리사세민 등이 많이 함유되어 있어 해열, 해독, 감기로 인한 두통, 현기증, 귀울음, 눈의 충혈, 종기 등을 해소하는 효과가 있어 주로 한방 약재나 차로 많이 애용되어 오고 있다.

목련은 우리나라를 비롯하여 일본 등지에 서식하는 낙엽활엽교목으로 주로 정원수로 사용되고 목련에 대한 추출성분으로는 α-pinene, β-pinene, cineol, limonene 등이 있으며, 성분 중에는 신미성인 것, 방향성인 것, 진통작용을 갖는 것 등 그 작용이 다양하며, 현재까지 알려진 약리작용은 혈압을 낮추어 주는 성분이 있고 휘발성 성분 중에는 국소수렴의 효과도 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명에 따른 싸이클로덱스트린글루카노트란스퍼라제(CGTase)를 이용한 능이, 국화, 목련 복합 추출물의 제조방법의 일 실시형태는 a). 능이, 국화 및 목련을 정제수 또는 온천수로 가온 추출하여 능이, 국화 및 목련의 복합추출물을 얻는 제1공정, b). 상기 제1공정의 복합추출물에 싸이클로덱스트린글루카노트란스퍼라제을 함유하는 덱스트린을 첨가하여 상기 복합추출물을 포접시켜 능이, 국화, 목련의 복합추출물이 포접된 사이클로 덱스트린을 제조하는 제2공정을 포함하는 것으로 이루어진다.

본 발명에 따른 싸이클로덱스트린글루카노트란스퍼라제(CGTase)를 이용한 능이, 국화, 목련 복합 추출물의 제조방법의 또 다른 실시형태는 a) 능이 1 ~ 10중량부, 국화 1 ~ 10중량부 및 목련 1 ~ 10중량부를 온천수로 가온 추출하여 능이, 국화 및 목련의 복합추출물을 얻는 제1공정, b) 상기 제1공정의 복합추출물 100중량부에 대하여 싸이클로덱스트린글루카노트란스퍼라제 0.01 ~ 1.0W/V% 농도로 함유하는 덱스트린 1.0 ~ 5.0중량부를 첨가하여 상기 제1 공정의 복합추출물을 포접시켜 능이, 국화 및 목련의 복합추출물이 포접된 사이클로덱스트린(cyclodextrin)을 제조하는 제2공정을 포함하는 것으로 이루어진다.

상기 본 발명의 온천수는 대전광역시 유성구에서 관리하는 유성온천의 온천수가 바람직하며, 유성온천의 온천수 수질은 수온 31 ~ 35℃, pH 7.95의 약알칼리성으로 수질유형은 Na-HCO₃ 형이며, 대장균 등 오염물에 노출되지 않은 것으로 조사되고 있으며 대한온천학회 자료에 따르면 우리나라 온천성분을 평균이상으로 함유하고 있어 온천수화장품을 연구개발하기에 최적의 상태라고 발표하고 있다.

그리고 본 발명의 또 다른 과제의 해결수단으로 싸이클로덱스트린글루카노트란스퍼라제(CGTase)를 이용한 능이, 국화, 목련의 복합추출물을 유효성분으로 하는 화장품 조성물은 싸이클로덱스트린글루카노트란스퍼라제의 효소작용에 의해 생성되는 사이클로덱스트린의 구조적 특성을 이용하여 유효성분인 능이, 국화 및 목련의 복합추출물을 포접시킨 사이클로덱스트린을 화장료의 유효성분으로 조성하는 것으로 이루어진다.

본 발명에 따른 싸이클로덱스트린글루카노트란스퍼라제(CGTase)를 이용한 능이, 국화, 목련의 복합추출물을 유효성분으로 하는 화장품 조성물의 일 실시형태는 상기 싸이클로덱스트린글루카노트란스퍼라제(CGTase)를 이용한 능이, 국화, 목련 복합 추출물의 제조방법에 따라 제조된 능이, 국화 및 목련의 복합추출물이 포접된 사이클로덱스트린(cyclodextrin)을 유효성분으로 하여 화장료 전체 중량에 대하여 0.01 ~ 20중량% 함유하는 화장료 조성물로 이루어진다.

상기 환상의 사이클로덱스트린을 생성하는 효소인 싸이클로덱스트린글루카노트란스퍼라제는 잘 알려진 공지물질이며, 본 발명에서는 싸이클로덱스트린글루카노트란스퍼라제에 의해 생성되는 사이클로덱스트린의 구조적 특성을 이용하여 유효성분인 능이, 국화 및 목련의 복합추출물을 포접시킨 사이클로덱스트린을 화장료의 유효성분으로 조성함으로써 화장료에 상대적으로 유효성분의 함량 증가와 함께 안정화시킬 수 있으며 또 유효성분의 용해도를 향상시키는 것으로 이루어진다.

상기 본 발명에 따른 화장료 조성물은 화장료 제조의 통상의 방법에 따라 제조되는 것으로 이루어지며, 예를 들면 약학적, 화장학적 또는 피부학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 화장수, 유액, 크림, 에센스, 팩, 마스크, 파운데이션, 자외선차단제, BB크림, 샴푸, 트리트먼트, 바디워시, 바디로션, 핸드로션 또는 피부 세정제 제형 등에 적용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 능이, 국화 및 목련의 복합추출물을 포접시킨 사이클로덱스트린을 유효성분으로 조성하여 화장료에 유효성분의 함량을 상대적으로 증가시킬 수 있는 효과와 함께 유효성분의 안정성과 용해도를 향상시키는 특징을 나타낸다.

또한 피부에 안전하면서도 고농도로 함유된 유효성분에 의한 상승작용으로 우수한 멜라닌생성 억제 및 항산화 활성을 나타내므로 우수한 피부미백, 노화지연 및 보습 효과를 나타낸다.

도 1은 본 발명에 따른 CGTase(Cyclodextrin Glucanotransferase)를 이용한 능이, 국화 및 목련 복합추출물의 Tyrosinase 저해 활성을 나타내는 그래프

이하에서는 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용, 실시예 및 시험예를 통하여 본 발명을 구체적으로 설명하지만 아래 기재에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 싸이클로덱스트린글루카노트란스퍼라제(CGTase)를 이용한 능이, 국화, 목련 복합 추출물의 제조방법은 a). 능이 1 ~ 10중량부, 국화 1 ~ 10중량부 및 목련 1 ~ 10중량부를 정제수 또는 온천수로 가온 추출하여 능이, 국화 및 목련의 복합추출물을 얻는 제1공정, b). 상기 제1공정의 복합추출물 100중량부에 대하여 싸이클로덱스트린글루카노트란스퍼라제 0.01 ~ 1.0W/V% 농도로 함유하는 덱스트린 1.0 ~ 5.0중량부를 첨가하여 상기 제1 공정의 복합추출물을 포접시켜 능이, 국화 및 목련의 복합추출물이 포접된 사이클로덱스트린(cyclodextrin)을 제조하는 제2공정을 포함하는 것으로 이루어진다.

본 발명에 따른 상기 제1공정은 능이, 국화 및 목련의 복합추출물을 얻는 추출공정이며, 능이 1 ~ 10중량부, 국화 1 ~ 10중량부 및 목련 1 ~ 10중량부로 조합하여 추출하며, 능이, 국화 및 목련을 동일 중량비로 조합 사용하는 것이 바람직하다.

상기 제1공정의 추출공정은 능이, 국화 및 목련의 혼합물을 정제수 또는 온천수로 10 ~ 100℃의 온도에서 8시간 ~ 1일, 보다 바람직하게는 10시간 ~ 18시간, 가장 바람직하게는 12시간 ~ 16시간 동안 추출하며, 상기 추출시간이 12시간 미만이면 원하는 성분의 추출이 미흡하고, 추출시간이 1일을 넘게 되면 추출성분에 변화가 없고 추출물이 변색되는 문제가 발생하기 때문에 바람직하지 못하다.

상기 온천수는 대전광역시 유성구에서 관리하는 유성온천의 온천수가 바람직하며, 유성온천의 온천수 수질은 수온 31 ~ 35℃, pH 7.95의 약알칼리성으로 수질유형은 Na-HCO₃ 형이며, 대장균 등 오염물에 노출되지 않은 것으로 조사되고 있어 온천수화장품을 제조를 위한 추출용매로 특히 적합하다.

본 발명에 따른 제2공정은 제1공정에서 얻은 능이, 국화 및 목련의 복합추출물에 0.01 ~ 1.0W/V% 농도의 싸이클로덱스트린글루카노트란스퍼라제(CGTase)를 함유하는 덱스트린을 첨가하여 싸이클로덱스트린글루카노트란스퍼라제(CGTase)의 효소작용에 의해 생성되는 싸이클로덱스트린에 능이, 국화 및 목련의 복합추출물 포접시키는 공정이다.

상기 제2공정은 온도 30 ~ 80℃, pH 3.0 ~ 8.0의 반응조건에서 5시간 ~ 24시간 반응시키는 것으로 이루어지며, 바람직하게는 온도 40 ~ 60℃, pH 4.5 ~ 6.5의 반응조건에서 8시간 ~ 12시간 반응시키며, 반응 조건이 상기 범위에 미치지 못하면 원하는 성분의 안정성과 포접이 미흡하고, 상기 범위를 초과하면 사이클로덱스트린의 제조가 높아 유효성분의 효율성이 떨어지는 문제가 발생기 때문에 바람직하지 못하다.

또 상기 제2공정에서 첨가하는 전분의 가수분해물인 덱스트린은 DE 1 ~ DE 60 덱스트린을 선택하는 것으로 이루어지며, 바람직하게는 DE 5 ~ DE 30 덱스트린, 보다 바람직하게는 DE 7 ~ DE 12 덱스트린을 첨가하는 것으로 이루어진다.

상기 제2공정으로부터 생성되는 반응생성물은 감압농축하고, 동결건조, 분무건조, 냉풍건조 또는 열풍건조 등의 방법으로 건조하여 건조물 형태의 능이, 국화 및 목련의 복합추출물로 제조하여 화장료의 유효성분으로 준비하는 것이 바람직하다.

그리고 본 발명에 따른 싸이클로덱스트린글루카노트란스퍼라제를 이용한 능이, 국화, 목련 복합 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 상기한 제1공정 내지 제2공정에 의해 제조된 능이, 국화 및 목련의 복합추출물이 포접된 싸이클로덱스트린을 유효성분으로 함유하는 것으로 이루어진다.

상기 유효성분인 능이, 국화 및 목련의 복합추출물이 포접된 싸이클로덱스트린은 화장료 조성물 총 중량을 기준으로 0.01 ~ 20중량%로 함유하는 것으로 이루어지며, 0.1 ~ 10중량% 함유하는 것이 바람직하며, 1 ~ 5중량%로 함유하는 것이 보다 바람직하다.

상기 유효성분이 화장료 조성물 총 중량의 0.01중량% 미만에서는 만족할 만한 효능을 제공하기 어렵고, 20중량% 이상에서는 조성물의 냄새와 색상에 영향을 미쳐서 상품성이 떨어지고 추가적인 효능을 기대하기도 어렵다.

본 발명에 따른 싸이클로덱스트린글루카노트란스퍼라제를 이용한 능이, 국화, 목련 복합 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 항산화용, 피부미백용 또는 보습용의 화장료 조성물에 적용될 수 있다.

또 본 발명에 따른 화장료 조성물은 화장료 제조의 통상의 방법에 따라 제조되는 것으로 이루어지며, 예를 들면 약학적, 화장학적 또는 피부학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 화장수, 유액, 크림, 에센스, 팩, 마스크, 파운데이션, 자외선차단제, BB크림, 샴푸, 트리트먼트, 바디워시, 바디로션, 핸드로션 또는 피부 세정제 제형 등에 적용될 수 있다.

이하에서는 <실시예> 및 <시험예>를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기로 한다.

<실시예 1>

1. 능이, 국화 및 목련의 복합 추출물의 제조

시판하는 능이 500g, 국화 500g 및 목련 500g을 혼합된 상태에서 분쇄기로 미세하게 절단한 다음, 준비된 추출기에 투입하고 15,000g의 유성온천수를 가한 후, 50℃에서 12시간 동안 추출하였다. 추출이 완료된 후 고형분을 제거하고 여액을 수득하였다.

준비된 반응용기에 상기 수득한 여액 15,000g, 말토덱스트린(DE 12) 10g 및 CGTase 1g을 투입한 다음, 50℃, pH 5.5에서 8시간 반응 후 90℃에서 30분 가온하여 효소를 실활시켰다.

반응이 종료된 여액은 감압농축 및 동결건조하여 능이, 국화 및 목련의 복합추출물이 포접된 포접물(효소복합추출물) 건조분말 12.5g을 얻었다.

<비교예 1>

비교를 위하여 능이, 국화 및 목련을 각각 500g씩 혼합 분쇄하여 사용하고 상기 <실시예 1>와 동일한 추출조건에서 추출한 복합추출물을 건조시켜 건조분말 4.7g을 얻었다.

<시험예 1> 폴리페놀 함량 측정 시험

상기 <실시예 1> 및 <비교예 1> 을 통하여 제조한 각각을 시료로 하여 폴리페놀 함량을 측정하였다.

총 폴리페놀 함량 측정은 상기 각각의 방법으로 수득한 추출물 시료를 5mg/㎖로 희석한 후 48well에 시료 25ul을 넣고 Folin & ciocaltean 50ul를 첨가하고, 3분간 반응 시킨 다음 2% sodium carbonate 1㎖를 첨가하여 혼합한 후 750nm에서 흡광도를 측정하여 아래 [표 1]에 나타내었다.

시료명		총 폴리페놀 함량(mg GA eq/g)
실시예1	효소 복합 추출물	101.17±1.56
비교예1	단순 복합 추출물	69.81±2.31

상기 [표 1]에 나타낸 바와 같이 <실시예 1>의 CGTase 효소를 이용한 능이, 국화 및 목련의 복합 추출물이 <비교예 1>의 단순 복합 추출물보다 폴리페놀 함량이 더 높다는 것을 확인할 수 있다.

<시험예 2> 피부세포 독성 시험

상기 <실시예 1> 및 <비교예 1> 를 통하여 제조한 각각을 시료로 하여 피부세포에 대한 독성을 측정하였다.

본 시험을 위해 사용된 세포주는 인간 진피 섬유아세포(human dermal fibroblast; Lonza, Basel, Switzerland) 등 3종의 세포를 사용하였다. 상기의 세포들은 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM; Gibco-BRL, Invitrogen; Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA)에 10% 소태아혈청(FBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin 100 IU/㎖, streptomycin 100μg/㎖; Life Technologies)를 함유한 배지를 사용하여, 5% CO₂ 세포배양기 내에서 37℃의 온도 조건 하에서 배양하였다.

WST-1(Water-soluble tetrazolium salt) 어세이는 세포 내 미토콘드리아성 NADH-탈수소화효소(mitochondrial NADH-dehydrogenase)의 활성을 측정하여 알아보는 방법으로써 테트라졸륨염(tetrazolium salt)을 살아있는 세포에 처리하게 되면 미토콘드리아에 있는 탈수소화효소에 의하여 유색의 포마잔(formazan)이 형성되게 된다. 형성된 포마잔을 450nm 파장의 흡광도로 확인하면 살아있는 세포의 농도를 확인할 수 있다. 세포를 96-well plate에 2×10³cells/well의 세포를 분주하고 24시간 배양 후 시료를 적정농도에 맞게 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 그 후 WST-1 어세이 용액을 배지양의 10%씩 처리하여 추가적으로 0.5 ~ 1시간 37°C에서 반응 후, iMark microplate reader(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여, 450nm에서 흡광도를 측정하였으며 참조 흡광도는 650nm에서 측정하여 결과값을 보정하였다. 결과값은 세 번의 독립적 실험으로부터 평균값± 표준편차로 나타내었으며, 아래 [표 2]에 나타내었다. P<0.05는 Student's t-test를 통해 검증하였으며 결과값의 유의성을 나타낸다.

시료명		농도(ppm)	세포생존율(%)
실시예1	효소 복합 추출물	100	101.5
		150	104.2
		200	110.0
비교예1	단순 복합 추출물	100	100.9
		150	102.8
		200	108.9

상기 [표 2]에 나타낸 바와 같이 CGTase 효소를 이용한 능이, 국화 및 목련의 복합 추출물은 피부세포에 독성을 주지 않는 안전한 성분임을 알 수 있다.

<시험예 3> 멜라닌 합성 저해 효과 시험

<실시예 1>과 <비교예 1>을 통하여 제조한 복합추출물을 시료로 하여 멜라닌 합성 저해 효과를 시험하였다.

B16F10 세포를 60mm culture dish에 3x10⁵개로 분주 후 <실시예 1>과 <비교예 1>의 시료1 ~ 5의 배지에 200㎍/㎖ 농도로 처리하였다. 양성대조를 위해 멜라닌 합성을 촉진하는 호르몬인 α-MSH(Sigma-Aldrich)를 200nM의 농도로 동일세포에 처리하였다.

시료와 α-MSH를 B16F10 멜라노마 세포에 처리한 후 실온에서 48시간 세포를 배양시킨 뒤에 세포를 수확하여 PBS로 2회 세척 후 각 시료별로 멜라닌합성 저해율을 측정하였으며 결과를 아래 [표 3]에 나타내었다.

시료명		멜라닌 합성 저해율(%)
실시예1	효소 복합 추출물	63.4
비교예1	단순 복합 추출물	41.0

상기 [표 3]에서 알 수 있는 바와 같이 멜라닌합성 저해율에 있어서, <실시예1>에 해당하는 능이, 국화 및 목련 효소 복합 추출물이 <비교예 1> 단순 복합추출물에 비해 훨씬 우수함을 알 수 있다.

<시험예 4> 항산화력 효과 시험

<실시예 1>, <비교예 1>을 통하여 제조한 복합추출물을 시료로 하여 항산화력을 DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)라디칼 소거 활성으로 측정하였다.

DPPH 라디칼 소거능은 Mensor 등의 방법을 참고하였다. 80㎕의 0.2mM DPPH 에탄올 용액을 제조예 1 내지 제조예 6의 발효액 시료에 20㎕ 가한 후 1분간 교반한 후 25℃ 인큐베이터에서 10분간 반응시켜 ELISA reader를 사용하여 517nm에서 흡광도를 측정하였다.

DPPH 라디칼 소거활성은 아래 [계산식 1]에 따라 백분율로 나타내었으며 그 결과를 아래 [표 4]로 나타내었다.

[계산식 1]

시료명		항산화효과(DPPH소거 활성율,%)
실시예1	효소 복합 추출물	87.3
비교예1	단순 복합 추출물	64.5

DPPH 라디칼 소거활성의 수치가 높다는 것은 항산화 효과가 높다는 것을 의미하며, 이는 멜라닌 생합성 과정의 산화반응의 억제를 통한 멜라닌 생성을 억제하여 미백효과를 나타내는 것이다.
DPPH 라디칼 소거활성의 수치가 높다는 것은 항산화 효과가 높다는 것을 의미하며, 이는 멜라닌 생합성 과정의 산화반응의 억제를 통한 멜라닌 생성을 억제하여 미백효과를 나타내는 것이다.
<시험예 5> Tyrosinnase 저해 효과 시험
<실시예 1>와 <비교예 1>을 통하여 제조한 각각의 추출물을 시료로 하여 Tyrosinase 저해 활성(Tyrosinase inhibitation activity)을 측정하였다.
Tyrosinase 저해 활성은 농도 별 시료 100㎕에 0.2M potassium phosphate buffer(pH6.5) 50㎕, 2mM L-tyrosine 50㎕, mushroom tyrosinase(110U/ml) 10㎕를 혼합하여 37℃에서 20분간 반응시킨 후 490nm에서 Multiplate Reader를 사용하여 흡광도를 측정하였다. Tyrosinase 저해활성(Tyrosinase inhibition activity)은 아래 [계산식 2]와 같이, 시료 무첨가구에 대한 시료 첨가구의 흡광도비로 계산하였으며 그 결과 [도 1]에 나타내었다.
[계산식 2]
Tyrosinnase 저해활성 = {1-(A-B)/(C-D)}×100
상기 식에서 A: 시료 첨가구의 흡광도, B: 공시료의 흡광도, C: 대조군 흡광도, D: 대조군 공시료 흡광도이다.
첨부한 [도 1]에 나타난 바와 같이 <실시예 1>과 <비교예 1>의 경우 타이로시나제 억제제의 함량이 많아 우수한 미백 효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 <실시예 1>의 경우 매우 많은 타이로시나제 억제제의 함량에 의해 매우 우수한 미백효과를 보인다는 것을 확인할 수 있다.
<실시예 2>
상기 <실시예 1>에서 제조된 능이, 국화 및 목련의 복합추출물이 포접된 포접물을 유효성분으로 하여 아래 [표 5]에 나타낸 조성성분 및 비율에 따라 수중유형 유화(O/W emulsion) 타입의 크림 제형의 화장품을 제조하였다.

조성성분	실시예 2 조성비(중량%)
세토스테아릴알코올	3.0
글리세릴스테이레이트	2.0
세테아릴올리베이트, 솔비탄올리베이트	1.0
폴리글리세릴-3 메틸글루코스디스테아레이트	1.5
스큐알렌	5.0
에틸헥실올리베이트, 소듐아크릴레이트코폴리머, 폴리글리세릴-4올리에이트	0.5
아크릴레이트/C10-30알킬아크릴레이트크로스폴리머	0.3
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.0
세틸에칠헥사노에이트	5.0
디메치콘	0.5
부틸렌글리콜	5.0
글리세린	8.0
1,2헥산디올	2.0
암모니움아크롤로일디메틸타우레이트/브이피코폴리머	0.3
알지닌	0.3
소듐아크릴레이트,폴리솔베이트80	0.3
효소 복합 추출물(실시예 1)	5.0
정제수	To 100

<실시예 3>
상기 <실시예 1>에서 제조된 능이, 국화 및 목련의 복합추출물이 포접된 포접물을 유효성분으로 하여 아래 [표 6]에 나타낸 조성성분 및 비율에 따라 샴푸 제형의 화장품을 제조하였다.

조성성분	실시예 3 조성비(중량%)
세토스테아릴알코올	3.0
소듐글루코네이트	0.50
소듐라우로일글루타메이트	0.10
클로페네신	0.20
소듐코코일이세티오네이트	3.30
폴리쿼터늄-10	0.20
다이소듐라우레스설포석시네이트,소듐라우릴설포아세테이트, 소듐클로라이드, 정제수	23.00
바바수아미도프로필베타인, 글리세린, 정제수	5.00
라우릴글루코사이드, 정제수	5.00
코코-베타인, 정제수	7.00
하이드롤라이즈드실크	0.10
폴리쿼터늄-7	0.30
하이드롤라이즈드케라틴	0.01
시트릭애씨드	0.10
소듐클로라이드	0.70
향료	0.50
에틸헥실글리세린	0.05
효소 복합 추출물(실시예 1)	5.00
정제수	To 100

<비교예 2>
<비교예 1>을 통하여 제조한 단순 복합 추출물을 유효성분으로 하여 수중유형 유화(O/W emulsion) 타입의 크림 제형의 화장품을 제조하였으며, 조성성분 및 비율은 <실시예 2>와 동일하게 하였다.
<비교예 3>
<비교예 1>을 통하여 제조한 단순 복합 추출물을 유효성분으로 하여 샴푸 제형의 화장품을 제조하였으며, 조성성분 및 비율은 <실시예 3>과 동일하게 하였다.
<시험예 6>
상기 <실시예 2>, <실시예 3>, <비교예 2> 및 <비교예 3> 의 수중유형 유화(O/W emulsion) 타입의 크림과 샴푸 제형의 화장품에 피부자극성 정도를 비교하기 위하여 인체에 대한 폐쇄첩포 시험(closed patch test)을 실시하였다.
건강한 성인 남녀 20명을 대상으로 하박부 안쪽에 각각의 시료를 0.2g씩 첩포하고 24시간 후 핀챔버를 제거한 후 4시간 경과한 다음 육안으로 피부상태를 확인하고, 그 결과를 아래 [표 7]에 나타내었다. 피부자극도는 하기 [계산식 3]에 의해 계산하였다.
[계산식 3]
피부자극도 = {(+-)수×1}+{(+)수×2}+{(++)수×3}/피험자수

시료명	피시험자수	판정결과				자극도
시료명	피시험자수	-	+ -	+	+ +	자극도
실시예2	20명	20	0	-	-	0.00
실시예3		20	0	-	-	0.00
비교예2		20	0	-	-	0.00
비교예3		20	0	-	-	0.00
-:홍반이나 특이사항 없음, +-:주위보다 약간 붉어짐, +:주위보다 현저히 붉어짐 ++:주위보다 심히게 붉어지고 부풀어 오름

상기 [표 7]에 나타낸 바와 같이, <실시예 2>, <실시예 3>, <비교예 2> 및 <비교예 3>의 화장품 조성물은 피부자극도가 매우 낮은 것으로 확인할 수가 있었다.
<시험예 7>
상기 <실시예 2>와 <비교예 2>에 대하여 실제 사용 시 피부 미백효과 및 보습효과를 알아보기 위하여 건강한 30 ~ 55세 성인여성 100명에 대하여 각각 <실시예 2>, <비교예 2>의 2그룹으로 나누어 인체 사용성 시험을 실시하였다.
상기 <실시예 2>와 <비교예 2>의 조성으로 제조된 시험품 50g씩을 설문지와 함께 나눠주고 아침과 저녁에 하루 2회씩 총 8주간 사용하게 한 후 설문지를 회수하여 분석하였다.
총 100명의 시험대상자 중 <실시예 2> 그룹의 50명, <비교예 2> 그룹의 50명의 설문지를 회수하여 분석한 결과를 아래 [표 8]에 나타내었다.

구분		응답자 수
구분		매우 악화됨	약간 악화됨	변화없음	약간 좋아짐	매우 좋아짐
피부색 변화정도	실시예2	-	-	8	12	30
피부색 변화정도	비교예2	-	-	19	21	10
피부 보습감 정도	실시예2	-	-	10	23	17
피부 보습감 정도	비교예2	-	-	8	28	14

상기 [표 8]에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 <실시예 2>의 크림 제형 화장료 조성물이 <비교예 2>의 크림에 비하여 피부색 변화, 피부 보습감개선 효능에 대한 사용자의 만족도가 높은 것을 확인할 수가 있다.

Claims

a) 능이 1 ~ 10중량부, 국화 1 ~ 10중량부 및 목련 1 ~ 10중량부를 정제수 또는 유성온천수로 가온 추출하여 능이, 국화 및 목련의 복합추출물을 얻는 제1공정,
b) 상기 제1공정의 복합추출물 100중량부에 대하여 싸이클로덱스트린글루카노트란스퍼라제 0.01 ~ 1.0W/V% 농도로 함유하는 덱스트린 1.0 ~ 5.0중량부를 첨가하여 상기 제1공정의 복합추출물을 포접시켜 능이, 국화 및 목련의 복합추출물이 포접된 사이클로덱스트린(cyclodextrin)을 제조하는 제2공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 싸이클로덱스트린글루카노트란스퍼라제를 이용한 능이, 국화, 목련 복합 추출물의 제조방법.
청구항 1에 있어서, 덱스트린은 DE 1 ~ DE 60 덱스트린을 선택하는 것을 특징으로 하는 싸이클로덱스트린글루카노트란스퍼라제를 이용한 능이, 국화, 목련 복합 추출물의 제조방법.
청구항 2에 있어서, 제2공정은 온도 30 ~ 80℃, pH 3.0 ~ 8.0의 반응조건에서 5시간 ~ 24시간 반응시키는 것을 특징으로 하는 싸이클로덱스트린글루카노트란스퍼라제를 이용한 능이, 국화, 목련 복합 추출물의 제조방법.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 하나의 항에 기재된 제조방법에 따라 제조되는 능이, 국화 및 목련의 복합추출물이 포접된 사이클로덱스트린(cyclodextrin)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 4에 있어서, 유효성분이 화장료 총 중량을 기준으로 0.01 ~ 20중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 5에 있어서, 화장료 조성물이 항산화용, 피부미백용 또는 보습용에 적용되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 6에 있어서, 화장료 조성물이 화장수, 유액, 크림, 에센스, 팩, 마스크, 파운데이션, 자외선차단제, BB크림, 샴푸, 트리트먼트, 바디워시, 바디로션, 핸드로션 및 피부 세정제 제형 중에서 선택되는 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.