KR101203504B1 - 비단나무 추출물 발효액을 함유하는 미백 또는 주름개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비단나무 (Stewartia koreana) 의 추출물을 효모를 이용하여 발효시킨 후 얻은 비단나무 추출물 발효액을 유효성분으로 함유하는 미백 또는 주름개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 미백 또는 주름개선용 조성물은 콜라겐 분해 효소(콜라게네이즈)인 MMP-1의 합성을 억제함으로써 피부의 노화와 주름생성을 방지할 수 있으며, 멜라닌 색소 생성에 관여하는 타이로시네이즈(tyrosinase)의 저해 활성이 우수하여 피부 미백에 효과적이다.

Description

비단나무 추출물 발효액을 함유하는 미백 또는 주름개선용 조성물{Composition for Wrinkle-Care or Skin Whitening Containing Fermentation Liquor of Extract from Stewartia koreana}

본 발명은 비단나무의 추출물 발효액을 함유하는 미백 또는 주름개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 비단나무의 추출물을 효모를 이용하여 발효시킨 후 얻은 비단나무 추출물 발효액을 유효성분으로 함유하는 미백 또는 주름개선용 조성물에 관한 것이다.

인간은 나이가 들어감에 따라 자연스럽게 노화가 일어난다. 그러나 이러한 자연적인 노화가 아닌 현대사회의 다양한 변화에 맞춰 환경유해물질과 같은 공해에 노출이 되면서 외적 자극에 의해 노화의 정도가 더욱 가속화되고 있다. 특히 자외선에 의한 장기간 태양광에 노출되는 얼굴, 목 등의 피부는 피부 각질층이 두꺼워지고, 피부의 구성요소들인 세포 외 기질들이 변성되어 피부의 탄력성을 잃게 되고, 깊은 주름이 형성될 뿐만 아니라, 피부 색소에 이상 현상을 일으켜 멜라닌 과다 생성 등을 초래한다.

인간의 피부 색깔은 여러 가지 요인에 의해 결정되지만 피부의 과색소 침착과 관련된 주요한 원인은 표피 내의 멜라닌 색소의 이상적 증가에 기인한다. 멜라닌은 멜라닌 생성세포(melanocyte) 내의 멜라노좀(melanosome)이라는 소기관에서 만들어지며, 멜라노좀에는 멜라닌 생합성 효소로 알려져 있는 타이로시네이즈(tyrosinase) 효소에 의해 타이로신(tyrosine)이 도파와 도파퀴논으로 전환된다. 이 후 타이로시네이즈 관련 단백질인 TRP-1(tyrosinase-related protein 1)과 TRP-2(tyrosinase-related protein 2)의 작용과 자동산화과정을 통해 멜라닌이 형성된다. 생성된 멜라닌은 표피를 구성하고 있는 각질세포로 전이되어 피부색이 표현된다.

멜라닌은 동식물계에 널리 존재하는 생체 고분자 물질로서 자외선을 흡수 또는 산란시켜 자외선으로부터 피부가 손상되는 것을 방지하는데 큰 역할을 한다. 반면 과도한 자외선에의 노출은 색소 침착뿐만 아니라 멜라닌 전구물질 등에 의한 독성으로 인한 세포사멸 등 부정적인 기능도 가지고 있다. 산업의 발달에 따른 환경오염의 영향으로 오존층 파괴가 일어나고 그로 인한 자외선 증가는 피부에 화상, 기미, 주근깨와 같은 색소침착, 피부노화 및 피부암까지 유발할 수 있다.

따라서 자외선 증가에 따른 피부 내의 색소침착 및 피부노화를 방지하기 위해서는 멜라닌 색소의 생성을 억제하여야 하는데, 특히 천연물로부터 의약 및 화장품에 사용되는 원료를 찾고자 하는 움직임이 현대 사회에서 더욱 증가하는 추세이다.

한편, 비단나무는 노각나무로 불리며, 노각나무(Stewartia koreana)는 쌍떡잎식물 물레나물목 차나무과의 낙엽활엽 교목으로 한국, 일본 등지에 분포하며, 산 중턱 이상에서 자란다. 노각나무의 높이는 7 내지 15미터이고, 나무 껍질은 흑적갈색으로 큰 조각으로 벗겨져 오래 될수록 배롱나무처럼 미끈해진다. 잎은 어긋나고 타원형 또는 넓은 타원형이며 끝은 뾰족하고 밑은 둥글거나 뭉뚝하다. 잎의 크기는 길이 4 내지 10센티미터이고 너비는 2 내지 5센티미터로 가장자리에 물결 모양의 톱니가 있다. 노각나무의 꽃은 양성으로 6월에서 7월에 백색으로 피며, 새 가지의 밑동 겨드랑이에 달린다. 꽃대는 길이 1.5 내지 2센티미터이고 포(苞)는 달걀모양 또는 둥근모양이다. 꽃받침은 둥글고 융모가 있으며, 꽃잎은 달걀을 거꾸로 세운 모양이고 5 내지 6개이며, 꽃의 암술대는 5개로 갈라져 합쳐지고 수술을 5개이다. 노각나무의 열매는 삭과로 10월에 익고, 5각뿔 형이고, 목재는 장식재 및 고급가구재 등으로 사용된다.

이에, 본 발명자들은 인체에 무해하고 친환경적인 미백 또는 주름개선용 천연원료를 찾던 중 비단나무(노각나무)의 추출물을 효모를 이용하여 발효시킨 후 얻은 비단나무(노각나무) 추출물 발효액을 피부에 적용한 결과 미백 또는 주름개선에 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 비단나무 추출물을 효모를 이용하여 발효시킨 후 얻은 비단나무 추출물 발효액을 유효성분으로 함유하는 미백 또는 주름개선용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한

(a) 비단나무 분말을 저탄소수 알코올 용매를 이용하여 추출하거나, 초임계 추출법을 이용하여 추출하는 단계; 및

(b) 상기 (a)단계 후 얻어진 추출물을 효모를 이용하여 발효시키는 단계를 포함하는 비단나무 추출물 발효액 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 비단나무 추출물 발효액을 유효성분으로 함유하는 미백 또는 주름개선용 조성물은 콜라겐 분해 효소(콜라게네이즈)인 MMP-1의 합성을 억제함으로써 피부의 노화와 주름생성을 방지할 수 있으며, 멜라닌 색소 생성에 관여하는 타이로시네이즈(tyrosinase)의 저해 활성이 우수하여 피부 미백 기능을 갖는다.

도 1은 역삼투압-막 분리를 통해 얻어진 비단나무 추출물의 분획물(오른쪽) 사진이다.
도 2는 비단나무 추출물 발효 전과 후의 HPLC 크로마토그램이다.
도 3은 비단나무 추출물 발효액의 세포독성 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 비단나무 추출물 발효액의 프로콜라겐 생합성 촉진 효과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 비단나무 추출물 발효액의 콜라게네이즈(MMP-1) 발현 저해 효과를 나타내는 그래프이다. (RA : retinoid acid)

본 발명은 비단나무(Stewartia koreana) 추출물을 효모를 이용하여 발효시킨 후 얻은 비단나무 추출물 발효액을 유효 성분으로 함유하는 미백 또는 주름개선용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 "비단나무 추출물 발효액"은 비단나무(노각나무, Stewartia koreana) 추출물을 효모를 이용하여 발효시킨 후 얻은 발효액을 의미한다.

본 발명에 따른 비단나무 추출물은 비단나무 분말을 저탄소수 알코올 용매를 이용하여 추출하거나, 초임계 추출법을 이용하여 추출할 수 있다.

상기 비단나무 분말은 시중에서 일반적으로 판매되는 분말을 사용할 수 있다. 또한 비단나무의 열매, 뿌리, 줄기 및 잎 중에서 선택된 하나 이상을 건조시킨 후 분쇄하여 직접 제조할 수도 있다.

상기 저탄소수 알코올 용매로는 메탄올, 에탄올, 프로판디올 및 이들의 혼합용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 프로판디올을 사용하는 것이 좋다. 프로판디올을 추출용매로 사용하여 비단나무 추출물을 얻을 경우 추출물에 물을 첨가하여도 유효성분의 용출 또는 침전현상이 일어나지 않으므로 다양한 후속 공정을 적용할 수 있는 이점이 있으며, 또한 프로판디올은 옥수수를 주원료로 하는 미생물 발효 산물이기 때문에 환경오염을 일으키지 않는 장점이 있다.

상기 초임계 추출법에서는 초임계 유체로 이산화탄소, 질소, 이산화질소, 메탄, 에틸렌, 프로판, 프로필렌 및 이산화탄소와 저탄소수 알코올을 혼합한 혼합용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 이산화탄소 단독 또는 이산화탄소와 프로판디올을 혼합한 혼합용매를 사용하는 것이 좋다.

한편, 상기 초임계 추출방법에서 40 내지 80℃의 온도, 300 내지 400바(bar) 압력조건에서 초임계 이산화탄소 또는 이산화탄소와 프로판디올을 혼합한 혼합용매를 가하여 비단나무로부터 추출물을 추출할 수 있다. 온도가 40℃ 이상일 때 추출효율이 증대되며, 80℃를 초과하면 추출효율의 증대가 없다. 또한, 기압이 300바(bar) 이상일 때 추출효율이 증대되며, 400바(bar)를 초과하면 그 이하의 기압일 때와 비교하여 추출효율의 증대가 없다.

본 발명에 따른 비단나무 추출물은 상기와 같이 비단나무 분말을 저탄소수 알코올 용매를 이용하여 추출하거나, 초임계 추출법을 이용하여 추출한 1차 추출물을 극성이 다른 유기용매를 사용하여 추가로 분획할 수 있다. 또한, 다양한 크로마토그래피 및 역삼투압-막분리 등을 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다. 따라서 본 발명에 있어서 "비단나무 추출물"은 이와 같이 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 포함하는 개념이다.

본 발명에 따른 효모는 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 효모를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 산업용 효모가 좋으며, 더욱 바람직하게는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)를 사용하는 것이 좋다. 본 발명의 하기 실시예에서는, GRAS (Generally Recognized As Safe)등급 효모인 피치아 파스토리스 배지에 비단나무 추출물을 0.5 내지 10%(v/v)가 함유되도록 첨가하여 유가식 발효법(fed-batch system)을 이용하여 일반적인 효모 발효 조건 하에 배양하였다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기와 같은 효모 발효에 의해 생산된 비단나무 추출물 발효액은 본 발명의 미백 또는 주름개선용 조성물 총 중량 대비 0.001 내지 30중량%의 범위로 함유할 수 있다. 0.001 중량% 미만일 경우 조성물의 실질적인 미백효과를 기대하기 어렵고 30중량%를 초과할 경우 초과투입에 따른 상승효과가 적어 경제적이지 못하다.

본 발명의 미백 또는 주름개선용 조성물은 주름개선 용도를 갖는다. 본 발명의 조성물에서 유효성분인 비단나무 추출물 발효액은 세포독성이 낮으면서, 콜라게나제(MMP-1)의 활성 억제를 통하여 우수한 주름 개선 효능을 발휘하며, 이와 같은 사실은 하기의 실험예4에 명확하게 기재되어 있다. 본 발명의 조성물의 용도인 주름 개선은 통상적인 피부 보호용도(주름의 예장, 주름의 제거, 피부 노화 억제 등)를 포함하는 것으로 해석된다.

또한, 본 발명의 미백 또는 주름개선용 조성물은 피부 미백 용도를 갖는다. 본 명세서에서 용어 "미백"은 멜라닌 색소의 침착으로 야기되는 피부의 흑화를 방지하여 피부 트러블을 개선하는 작용을 의미한다. 본 발명의 조성물에서 유효성분인 비단나무 추출물 발효액은 세포 내 타이로시네이즈(tyrosinase)의 활성을 억제함으로써 멜라닌 생성 억제를 통한 미백 효과를 나타내며, 안정성이 높아 피부 자극 유발 등의 부작용이 거의 없다.

본 발명의 조성물의 유효성분인 비단나무 추출물 발효액은 콜라겐 분해 효소(콜라게네이즈)인 MMP-1의 합성 억제 및 멜라닌 색소 생성에 관여하는 타이로시네이즈(tyrosinase)의 활성을 저해하는 특성을 가지며, 따라서 이를 유효성분으로 함유하는 본 발명의 미백 또는 주름개선용 조성물은 우수한 미백 및 주름개선 효과를 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 화장료 조성물이다.

본 발명의 화장료 조성물은 유효성분인 상기 비단나무 추출물 발효액 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있다. 예컨대 정제수, 보습제, 유분, 계면활성제, 고급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 지방산, 산화방지제, 방부제, 왁스, pH조절제 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 보습제로는 글리세린, 프로필렌 글라이콜, 부틸렌 글라이콜, 헥실렌 글라이콜, 디글리세린, 솔비톨, 베타인, 글리세레스-26 등이 사용될 수 있다.

상기 유분으로는 미네랄오일, 사이클로메치콘, 스쿠알란, 옥틸도데실 미리스테이트, 올리브오일, 마카다미아 너트오일, 글리세릴 옥타노에이트, 캐스터오일, 에칠헥실 이소노나노에이트, 디메치콘, 사이크로펜타실록산, 선플라워씨드오일 등이 사용될 수 있다.

상기 계면활성제로는 소르비탄세스퀴놀리에이트, 폴리솔베이트 60, 글리세릴 스테아레이트, 친유형 글리세릴스테아레이트, 소르비탄 올리에이트, 소르비탄 스테아레이트, 디에이-세틸포스페이트, 소르비탄스테아레이트/슈크로스코코에이트, 글리세릴스테아레이트/폴리에틸렌글라이콜-100 스테아레이트, 세테아레스-6 올리베이트, 라키딜알코올/베헤닐알코올/아라키딜 글루코사이드, 폴리프로필렌글라이콜-26-부테스-26/폴리에틸렌글라이콜-40 하이드로제네이티드 캐스터오일 등이 사용될 수 있다.

상기 고급 알코올로는 세틸알코올, 스테아릴 알코올, 옥틸도데칸올, 이소스테아릴 알코올 등이 사용될 수 있다.

상기 증점제로는 산탄검, 카보머, 마그네슘알루미늄실리케이트, 셀룰로오스검, 덱스트린 팔미테이트 등이 사용될 수 있다.

상기 킬레이트제로는 디소듐이디티에이, 테트라소듐이디티에이 등이 사용될 수 있다.

상기 색소로는 청색1호, 적색40호, 황색4호, 황색 5호 등이 사용될 수 있다.

상기 지방산으로는 스테아릴에시드, 미리스틱에시드, 팔미틱에시드, 이소스테아릭에시드, 라우릭에시드 등이 사용될 수 있다.

상기 산화방지제로는 토코페릴아세테이드, 부틸레이티드하이드록시톨루엔 등이 사용될 수 있다.

상기 방부제로는 메칠파라벤, 부틸파라벤, 프로필파라벤, 페녹시에탄올, 이미다졸리디닐우레아, 클로르페네신등이 사용될 수 있다.

상기 왁스로는 카나우바왁스, 칸데닐라왁스, 밀납, 경납 등이 사용될 수 있다.

상기 pH조절제로는 트리에탄올아민, 씨트릭애씨드 등이 사용될 수 있다.

상기 향료로는 천연향료, 조합향료 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 미백 또는 주름개선용 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 용액, 현탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제 함유 클린징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클린징 크림, 클린징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판, 부탄 또는 디메칠 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예로는 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로는 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 미백 또는 주름개선용 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 이산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸셀룰로오스, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤화제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국부 투여 방식으로 적용된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001 내지 100mg/kg 범위 내이다. 또한 외용제인 경우에는 성인기준으로 1.0 내지 3.0㎖ 의 양으로 1일 1회 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 특히 본 발명의 약제학적 조성물이 피부 외용제인 경우 크림, 젤, 연고, 액체, 파우더 및 분무제로 구성된 군에서 선택된 1종의 제형으로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 미백 또는 주름개선용 조성물은 식품 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분인 비단나무 추출물 발효액 이외에, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미료 및 향미제를 포함할 수 있다. 상술한 탄수화물의 예로는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토오스, 수크로오스, 올리고당과 같은 디사카라이드; 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드 등의 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 이리트리톨 등의 당알코올이다. 향미제로는 천연 향미제 및 합성 향미제를 사용할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분으로 비단나무 추출물을 효모를 이용하여 발효시킨 후 얻은 비단나무 추출물 발효액 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명은 또한

(a) 비단나무 분말을 저탄소수 알코올 용매를 이용하여 추출하거나, 초임계 추출법을 이용하여 추출하는 단계;

(b) 상기 (a)단계 후 얻어진 추출물을 효모를 이용하여 발효시키는 단계를 포함하는 비단나무 추출물 발효액 제조방법을 제공한다.

상기 (a)단계에서는 비단나무 분말은 시중에서 일반적으로 판매되는 분말을 사용할 수 있다. 또한 비단나무의 열매, 뿌리, 줄기 및 잎 중에서 선택된 하나 이상을 수분함유량이 8 내지 15중량%가 될 때까지 건조시킨 후 분쇄하여 제조할 수도 있다.

상기 (a)단계에서 저탄소수 알코올 용매를 이용하여 추출할 경우 저탄소수 알코올 용매로는 메탄올, 에탄올, 프로판디올 및 이들의 혼합용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 프로판디올을 사용하는 것이 좋다. 프로판디올을 추출용매로 사용하여 비단나무 추출물을 얻을 경우 추출물에 물을 첨가하여도 유효성분의 용출 또는 침전현상이 일어나지 않으므로 다양한 후속 공정을 적용할 수 있는 이점이 있으며, 또한 프로판디올은 옥수수를 주원료로 하는 미생물 발효 산물이기 때문에 환경오염을 일으키지 않는 장점이 있다.

한편 추출용매로 프로판디올을 사용할 경우, 상기 (b)단계 전에 상기 (a)단계에서 얻어진 추출물을 역삼투압-막분리를 이용하여 분획하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이는 프로판디올을 추출용매로 사용한 결과, 역삼투압-막분리 공정만을 통하여 추가적인 탈색공정 없이 한번에 유효 성분의 분리 및 농축이 가능하기 때문이다.

상기 (a)단계에서 초임계 추출법을 이용하여 추출할 경우 40 내지 80℃의 온도, 300 내지 400바(bar) 압력조건에서 초임계 유체를 가하여 비단나무로부터 추출물을 추출할 수 있다. 상기 초임계 유체로는 이산화탄소, 질소, 이산화질소, 메탄, 에틸렌, 프로판, 프로필렌 및 이산화탄소와 저탄소수 알코올을 혼합한 혼합용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 이산화탄소 단독 또는 이산화탄소와 프로판디올을 혼합한 혼합용매를 사용하는 것이 좋다.

한편 초임계 유체로 이산화탄소와 프로판디올을 혼합한 혼합 용매를 사용할 경우, 상기 (b)단계 전에 상기 (a)단계에서 얻어진 추출물을 역삼투압-막분리를 이용하여 분획하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이는 초임계 유체로 이산화탄소와 프로판디올을 혼합한 혼합 용매를 사용한 결과, 역삼투압-막분리 공정만을 통하여 추가적인 탈색공정 없이 한번에 유효 성분의 분리 및 농축이 가능하기 때문이다. 이 때 이산화탄소와 프로판디올의 혼합 비는 99.85:0.15 내지 95:5인 것이 바람직하다.

상기 (b)단계에서 효모는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)를 사용할 수 있으며, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 배지에 비단나무 추출물을 0.5 내지 10%(v/v)가 함유되도록 첨가하여 유가식 발효법(fed-batch system)을 이용하여 20 내지 30℃에서 20 내지 30시간 발효되는 것이 바람직하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 비단나무 추출물의 제조

(1) 추출용매로 프로판디올을 사용하여 비단나무 추출물 제조

전라북도 임실지역에서 수확한 비단나무 잎을 건조시킨 후 분쇄하여 만든 비단나무 분말 1 g에 프로판디올(1,3-Propanediol, PD, Dupont, USA) 100 ml를 첨가하여 20 시간 상온에서 교반하였다. 상기 교반이 종료된 용액을 여과지를 이용하여 여과하였고, 고속액체크로마토그래피 (C-18/258nm/Acetonitrile, Agilent)를 이용하여 추출물 성분을 분석하였다.

(2) 초임계추출법을 이용한 비단나무 추출물 제조

초임계 유체추출조건은 아래 표 1과 같이 8종으로 진행하였으며 초임계 유체로 이산화탄소 단독 및 이산화탄소와 프로판디올(1,3-Propanediol) 공용매를 사용하여 온도, 압력 변화에 따라 추출하였다. 추출물은 에탄올과 MC(methylene chloride)를 사용하여 용해시킨 후 건조하였다.

시료	온도(℃)	압력(bar)	공용매(%v/v)	추출시간(분)	시료(g)	추출물(g)/시료(g)
1	40	250	이산화탄소 100%	180	2.5	0.0213
2	40	400	이산화탄소 100%	180	2.5	0.0298
3	40	400	이산화탄소 100%	180	2.5	0.0280
4	40	400	이산화탄소95%+프로판디올 5%	180	2.5	0.0312
5	80	250	이산화탄소 100%	180	2.5	0.0213
6	80	400	이산화탄소 100%	180	2.5	0.0278
7	80	400	이산화탄소95%+프로판디올 5%	180	2.5	0.0288
8	60	400	이산화탄소 100%	180	2.5	0.0210

상기 표 1과 같은 조건으로 진행한 결과, 추출 온도 40℃ 내지 80℃, 추출 압력 200 내지 400 bar에서 추출효율이 높음을 알 수 있었다. 또한, 프로판디올을 보조 용매로 사용시 추출 효율이 상대적으로 더 높음을 알 수 있었다.

(3) 역삼투압-막 분리 공정을 이용한 비단나무 추출물의 분획물 제조

상기 실시예 1-(1), 또는 1-(2)에서 얻은 비단나무 추출물을 역삼투압-막(PHILOSEP Membrane System, PHILOS, 한국)을 통과시켜서 탈색된 추출물을 얻었다(도 1의 우측 분획물 참조). 이와 같이 수집한 추출물을 감압 증류법을 통하여 농축하였다.

실시예 2. 비단나무 추출물 발효액 제조

GRAS 등급을 받은 산업용 효모로서 피치아 패스토리스(Pichia pastoris) (Invitrogen, Cat. No. K1740-01, USA)를 구입하여, 배지(glycerol 10 g/l, yeast nitrogen base without amino acid 13.4 g/l, biotin 4 g/l)에서 종배양 하였다. 그 다음 상기 배양 효모가 포함된 복합배지(효모 추출물 2 중량%, 글리세롤 1 중량% 포함)에 실시예 1-(2)에서 얻은 추출물을 배양액 총량에 대하여 10 %(v/v) 함유되도록 첨가하여 유가배양(fed-batch) 시스템을 이용하여 30℃에서 24 시간 배양하고, HPLC를 이용하여 성분 프로파일의 변화를 확인하였다(도 2 참조).

실험예 1. 비단나무 추출물 발효액의 세포독성 실험

인간 유래 HDF (human dermal fibroblast) cell(Modern Cell & Tissue Technologies)을 페니실린 (100units/㎖), 스트렙토마이신 (100㎍/㎖), 10 % FBS(fetal bovine serum)가 함유된 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)를 첨가하여 5% 이산화탄소를 포함하는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 배양한 섬유아세포를 96웰 플레이트(well plate)에 1 X 104 cells/ml의 농도로 200 ㎕씩 접종하여 24시간 배양하였다.

배지를 제거한 후 PBS로 1회 세척한 섬유아세포에 무혈청 DMEM　배지(serum free -Dulbecco's Modified Eagle Medium, WelGENE, Inc., 한국)에 0.05㎍/㎖, 0.5㎍/㎖, 5㎍/㎖의 농도로 희석한 비단나무 추출물 발효액을 200㎕씩 처리하여 20시간 배양하였다. 각 처리군의 세포 배양액을 제거하고, PBS로 1회 세척한 뒤, 세포의 증식이나 생존을 측정하는 방법(Western blot analysis)에서 사용되는 WST-1용액을 1/10로 무혈청　DMEM 배지에 희석하여 200㎕씩 첨가하여 4시간 동안 배양하였다. 그 후 마이크로플레이트-리더(microplate-reader; TECAN Group Ltd, 스위스)를 이용하여 450 내지 590 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에서 보이는 바와 같이 농도별 샘플(비단나무 추출물 발효액)의 세포독성도 수치는 대조군과 비교하여 거의 유사하게 나타났다. 이를 통해 본 발명에 따른 추출물 발효액은 세포독성이 거의 없는 것을 알 수 있었다.

대조군으로는 비단나무 추출물을 첨가하지 않은 배지(media)에 섬유아세포 배양한 것과 성장촉진인자(TGF-beta)가 포함된 배지에 섬유아세포를 배양한 것을 사용하였다.

실험예 2. 타이로시네이즈의 활성 저해 측정 실험(미백 활성 관련 테스트)

실시예 1-(2)에서 얻은 추출물을 피치아 패스토리스(Pichia pastoris) 효모로 발효시킨 후, 발효 전 후의 타이로시네이즈 활성 저해 효과를 비교하였다. 발효 후 타이로시네이즈 저해 활성은 37℃에서 96웰 플레이트를 이용하여 측정하였다. 샘플 100㎕, 125U 머슈룸 타이로시네이즈 (Sigma, USA), 40ul 5mM L-DOPA(Invitrogen)를 0.1M PBS (pH6.8)에 혼합하고 20 분 후에 475nm에서의 흡광도를 측정하여 DOPA의 함량을 측정하여 효소활성의 억제 정도를 비교한 결과를 아래 표 2에서 나타내었다.

시료	저해율	동일한 저해율을 나타내는 비타민C의 몰농도 (mM)
비단나무 추출물	33.6	2.29
비단나무 추출물 발효액1(12시간발효)	48.8	3.29
비단나무 추출물 발효액2(24시간발효)	55.9	3.67

그 결과 상기 표 2에서 보이는 바와 같이 비단나무 추출물 그 자체보다 비단나무 추출물을 발효시킨 비단나무 추출물 발효액에서 효소억제활성이 더욱더 증가하는 것을 확인하였다.

실험예 3. 타입 1 프로콜라겐 생합성 촉진 실험

인간 유래 HDF (human dermal fibroblast) cell(Modern Cell & Tissue Technologies)을 페니실린 (100units/㎖), 스트렙토마이신 (100㎍/㎖), 10% FBS가 함유된 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(WelGENE, Inc. 한국)를 첨가하여 5% 이산화탄소를 포함하는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 배양한 섬유아세포를 48웰 플레이트(well plate)에 5 X 104 cells/ml의 농도로 200㎕씩 접종하여 24시간 배양하였다.

24시간 배양시킨 섬유아세포를 PBS(Dulbecco's phosphate buffered saline)로 1회 세척 후 무혈청 DMEM 배지(serum free -Dulbecco's Modified Eagle Medium)(WelGENE, Inc. 한국)로 교환하여 6 시간 동안 배양하였다. 섬유아세포의 배지를 제거하여 PBS로 1회 세척 한 후 무혈청 DMEM　배지(WelGENE, Inc. 한국)에, DMSO에 녹인 실시예 1-(2)에서 얻은 추출물을 10㎍/㎖, 100㎍/㎖의 농도로 희석하고 200㎕씩 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 배양액을 수거하여 프로콜라겐(procollagen)을 측정하였다.

프로콜라겐(procollagen)은 프로콜라겐 생합성 정도를 측정할 수 있는 프로콜라겐 타입 I-펩타이드 EIA 키트(procollagen Type I C-Peptide EIA, Takara Biomedical Co., Japan)을 사용하여 사용법에 따라 측정하였다.

대조군으로는 비단나무 추출물을 첨가하지 않은 배지(media)에 섬유아세포 배양한 것과 성장촉진인자(TGF-beta)가 포함된 배지에 섬유아세포를 배양한 것을 사용하였다.

그 결과 도 4에서 보이는 바와 같이 음성대조군인 비단나무 추출물을 첨가하지 않은 배지(media)에 섬유아세포 배양한 것과 비교하여 비단나무 추출물 발효액이 포함되어 배양된 배양액에서 프로콜라겐의 수치가 월등히 높이 나타났다. 또한 비단나무 추출물 발효액이 비단나무 추출물 자체보다 프로콜라겐(procollagen)의 수치가 높은 것을 통해 비단나무 추출물 발효액이 비단나무 추출물 자체보다 프로콜라겐 합성을 촉진하는데 더욱 효과적인 것을 알 수 있었다.

실험예 4. 콜라게네이즈(MMP-1) 활성저해 실험

인간 유래 섬유 아세포 (Fibroblast)를 페니실린(100 IU/ml), 스트렙토마이신 (100g/ml), 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지에 넣고 5% 이산화탄소를 포함하는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 배양한 섬유 아세포를 96웰 플레이트(well plate)에 1 X 10⁴ cells/ml로 접종하여 1일 배양하였다. 배양 후 배지를 제거한 다음, 시료를 2.5 ㎍/ml의 농도로 첨가한 DMEM 배지를 첨가하여 20시간 배양하였다. 그 후, 콜라게네이즈(MMP-1)의 발현을 유도하기 위하여, 배지를 제거한 후 DPBS를 넣고, UV-B를 75mJ로 조사하였다. 24시간 배양 후, 배지를 수거하였다. 브래드포드 어세이(Bradford assay)를 통하여 총 단백질량을 정량한 후, 각 처리군의 총 단백질량을 보정하여 웨스턴 블랏용 시료를 제조하였다. 준비한 시료는 10% SDS-PAGE에서 단백질의 크기에 따라 분리되었고, 이는 멤브레인으로 옮겨, 항체를 사용하여 엑스레이 필름에서 가시화시켰다.

그 결과는 도 5에 나타냈으며 발효물에서의 콜라게네이즈 저해 활성이 추출물 자체의 저해활성보다 월등히 증가함을 확인하였다.

하기에 비단나무 추출물 발효액을 함유하는 미백 또는 주름개선용 조성물을 위한 제조예를 예시한다.

제조예1. 비단나무 추출물 발효액을 함유하는 화장료

(1) 유연 화장수

비단나무 추출물 발효액을 함유한 유연 화장수의 제조예는 표 3에 나타낸 바와 같다. 수성 성분에 정제수를 가하고 실온에서 용해시켜 수상을 제조하였다. 비단나무 추출물 발효액, 유상성분, 유화제, 방부제, 향을 실온에서 용해시킨 후 수상에서 첨가하여 혼합하고 여과하였다.

성분	함량 (중량%)
비단나무 추출물 발효액	0.10
EDTA	0.05
피이지 1500	4.00
카보머	0.16
1,3 부틸렌 글라이콜	3.00
폴리옥시에틸렌 하이드로제네이티드 캐스터오일	0.45
트리에탄올아민	0.12
방부제, 향, 색소	미량
정제수	잔량
합계	100

(2) 수렴 화장수

비단나무 추출물 발효액을 함유한 유연 화장수의 제조예는 하기 표 4에 나타낸 바와 같다. 수성 성분에 정제수를 가하고 실온에서 용해시켜 수상을 제조하였다. 효모발효액 성분에 정제수를 가하고 실온에서 에탄올을 가하여 실온에서 용해시켜 알코올 상을 제조한 다음 수상에 첨가하여 혼합하고 여과하였다.

성분	함량 (중량%)
비단나무 추출물 발효액	0.10
EDTA	0.05
글리세린	2.00
에탄올	7.00
1,3 부틸렌 글라이콜	3.00
폴리옥시에틸렌 하이드로제네이티드 캐스터오일	0.40
방부제, 향, 색소	미량
정제수	잔량
합계	100

(3) 로션

비단나무 추출물 발효액을 함유한 로션의 제조예는 하기 표 5에 나타낸 바와 같다. 수상인 정제수, 트리에탄올 아민, 부틸렌 글라이콜을 70℃로 가열하여 용해시키고, 여기에 유상인 지방산, 유성성분, 유화제 및 방부제를 70℃로 가열하여 용해한 액을 첨가하여 유화시켰다.　유화가 완료된 후 친수성 증점제인 산탄검 2% 용액을 첨가하여 전체에 대해 0.05 중량%가 되도록 조절하였다. 상기 용액을 45℃로 냉각시킨 후, 효모발효액, 향 및 색소를 첨가하고 혼합한 다음 30℃로 냉각하였다.

성분	함량 (중량%)
비단나무 추출물 발효액	0.10
글리세린	3.00
카보머	0.10
산탄검	0.05
1,3 부틸렌 글라이콜	3.00
폴리글리세린-3 메칠글루코스 디스테아레이트일	1.50
글리세린 스테아레이트	0.50
세테아릴 알코올	0.30
호호바 오일	3.00
유동 파라핀	2.00
스쿠알란	3.00
디메치콘	0.50
토코페릴아세테이트	0.20
트리에탄올아민	0.10
방부제, 향, 색소	미량
정제수	잔량
합계	100

(4) 크림

비단나무 추출물 발효액을 함유한 영양 크림의 제조예는 하기 표6에 나타낸 바와 같다. 수상인 정제수, 트리에탄올아민, 프로필렌글리콜을 70℃로 가열하고 용해시키고, 여기에 유상인 지방산, 유성성분, 유화제 및 방부제를 70℃로 가열하여 용해한 액을 첨가하여 유화시켰다.　 유화가 완료된 후 상기 용액을 45℃로 냉각시키고 효모발효액과 향을 첨가하고 분산시킨 다음 30℃로 냉각하였다.

성분	함량 (중량%)
비단나무 추출물 발효액	0.10～1%
호호바 오일	5.00
유동파라핀	7.00
세틸아릴 알코올	2.00
폴리글리세릴-3 메칠 글루코스 디스테아레이	2.00
글리세릴스테아레이트	0.50
스쿠알란	3.00
프로필렌글리콜	4.00
글리세린	5.00
트리에탄올 아민	0.30
카르복시 비닐폴리머	0.30
토코페릴 아세테이트	0.2
방부제, 향,	미량
정제수	잔량
합계	100

RA : retinoid acid

Claims (13)

1. 비단나무(Stewartia koreana) 추출물을 피치아 패스토리스(Pichia pastoris)를 이용하여 발효시킨 후 얻은 비단나무 추출물 발효액을 유효 성분으로 함유하는 미백 또는 주름개선용 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 조성물은 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 제 1항에 있어서,
   상기 조성물은 약제학적 피부 외용제인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 삭제
5. 제 1항에 있어서,
   상기 비단나무 추출물 발효액은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 30중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 미백 또는 주름개선용 조성물.
   
6. (a) 비단나무 분말을 저탄소수 알코올 용매를 이용하여 추출하거나, 초임계 추출법을 이용하여 추출하는 단계;
   (b) 상기 (a)단계 후 얻어진 추출물을 피치아 패스토리스(Pichia pastoris)를 이용하여 발효시키는 단계를 포함하는 비단나무 추출물 발효액 제조방법.
   
7. 제 6항에 있어서,
   상기 (a)단계에서 저탄소수 알코올 용매는 프로판디올인 것을 특징으로 하는 비단나무 추출물 발효액 제조방법.
   
8. 제 7항에 있어서,
   상기 (b)단계 전에 상기 (a)단계에서 얻어진 추출물을 역삼투압-막분리를 이용하여 분획하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 비단나무 추출물 발효액 제조방법.
   
9. 제 6항에 있어서,
   상기 (a)단계에서 초임계 추출법은 추출하고자 하는 물질을 초임계 유체를 사용하여 40 내지 80℃의 온도, 300 내지 400바(bar)의 압력조건에서 초임계 추출하는 것을 특징으로 하는 비단나무 추출물 발효액 제조방법.
   
10. 제 9항에 있어서,
    상기 초임계 유체는 이산화탄소와 프로판디올을 혼합한 혼합 용매인 것을 특징으로 하는 비단나무 추출물 발효액 제조방법.
    
11. 제 10항에 있어서,
    상기 이산화탄소와 프로판디올을 혼합한 혼합 용매는 혼합 비가 99.85:0.15 내지 95:5인 것을 특징으로 하는 비단나무 추출물 발효액 제조방법.
    
12. 제 10항에 있어서,
    상기 (b)단계 전에 상기 (a)단계에서 얻어진 추출물을 역삼투압-막분리를 이용하여 분획하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 비단나무 추출물 발효액 제조방법.
    
13. 삭제

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