CN115300443B - 一种羊胎素提取方法及在化妆品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种羊胎素提取方法及在化妆品中的应用，涉及化妆品加工技术领域。该羊胎素，其包含35～50％分子量在1000以内的物质，25～40％分子量在1000～10000的物质，10～20％分子量在10000～40000的物质；上述羊胎素采用组合酶制剂酶解法以及应激酵母菌发酵获得。本发明提供的提取方法得到的羊胎素具有更高的抗氧化能力，应用于化妆品中，能够明显增强化妆品的保湿性能，且进一步改善其抗皱效果。
Description
技术领域
本发明属于化妆品加工技术领域，具体涉及一种羊胎素提取方法及在化妆品中的应用。
背景技术
羊胎盘素是指从羊胎盘中提取的多种活性物质的总称，包括多种蛋白质、必需氨基酸、核酸、荷尔蒙、胶原、免疫因子及钙铁锌等营养成分，具有补气养血、补精益肾、调节机体免疫力、延缓衰老、美白嫩肤、保持体型等多种保健功能。在临床上用于预防肝硬化、改善人体免疫力，治疗病毒性肝炎、白细胞减少症、重症肌无力等免疫性疾病以及恶性肿瘤等，也是具有神奇功效的化妆品及滋补品原料。
现代生活的种种特性是造成人们疲劳倦怠、精力不济的主要外因，而内因则是气损精亏、营养不良、体内积存代谢物过多。工作的节奏不能由己，生活的内容不易改变，但是我们可以通过改变自己身体的内环境来面对外部环境的挑战。羊胎素就是这种改变的桥梁，它可以增强人体细胞活力，抵抗体内自由基的侵犯，加快体内代谢废物的排泄。与此同时补充人体必需的各种能量与营养，使机体快速恢复活力，直面纷繁复杂的人生。
现有的羊胎素提取工艺中，都是直接采用酶解的方式进行提取，无法充分获得羊胚胎中的高活性羊胎素，加工而成的护肤产品也就无法起到高效的改善皮肤状况的作用；同时，含有羊胎素的护肤产品，其功能成分常以羊胎素为主，使得产品的功效也较为单一；因此，羊胎素的提取工艺以及具体的实际应用都有待提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种羊胎素提取方法及在化妆品中的应用，该提取方法得到的羊胎素具有更高的抗氧化能力，应用于化妆品中，能够明显增强化妆品的保湿性能，且进一步改善其抗皱效果。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种羊胎素提取物，其包含35～50％分子量在1000以内的物质，25～40％分子量在1000～10000的物质，10～20％分子量在10000～40000的物质；上述羊胎素采用组合酶制剂酶解法辅助提取获得。
本发明的又一目的在于，提供了上述羊胎素提取方法，包括如下步骤：
(1)预处理：取羊胚胎、羊胎盘清洗除杂后，低温粉碎过60～100目筛得到粗粉；
(2)粗提取：取步骤(1)获得的粗粉，加入蒸馏水浸提3～6h；之后离心，上清液浓缩为粗提液；
(3)酶解提取：取步骤(2)中得到的离心沉淀物，加入组合酶制剂进行酶解，灭酶、抽滤得到酶解液；
(4)合并步骤(2)中得到的粗提液和步骤(3)中得到的酶解液，过滤、浓缩、冷冻干燥获得羊胎素。本发明通过选择合适的组合酶制剂，并使用适宜的配比和添加比例，配合常规提取方法，对羊胚胎及羊胎盘等原料进行进一步酶解处理，更多的将大分子的蛋白酶解成肽段及部分氨基酸，更利于皮肤吸收。且在酶解过程存在的情况下，制备得到的羊胎素具有更佳的生物活性，进一步扩大其应用范围。
优选地，低温粉碎处理时，温度为0～6℃。
优选地，组合酶制剂包括枯草杆菌蛋白酶、弹性蛋白酶、菠萝蛋白酶或糜蛋白酶中的一种或几种。
优选地，酶解处理时，温度为45～55℃，时间为3～6h，pH为6～9；组合酶制剂的用量为离心沉淀物的2～4wt％，优选为3wt％。
优选地，灭酶处理时，温度为80～90℃，时间为30～60min。
优选地，粗粉与蒸馏水的料液比为1g：40～60mL。
更优选地，组合酶制剂包括糜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、弹性蛋白酶、菠萝蛋白酶；糜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、弹性蛋白酶、菠萝蛋白酶的质量比为1:0.3～0.5:0.4～0.6:0.2～0.4。
进一步的，在酶解处理过程中加入D-泛酸钙、盐酸吡哆醇和甲羟戊酸；D-泛酸钙的添加量为离心沉淀物的0.5～1.5wt％；D-泛酸钙、盐酸吡哆醇和甲羟戊酸的质量比为1:0.6～0.8:0.4～0.6。本发明在组合酶制剂酶解过程中加入D-泛酸钙、盐酸吡哆醇和甲羟戊酸，起到一定的协同复配效果，作用与组合酶制剂，能够明显改善酶的生物活性，蛋白酶活力得到显著增强，促进酶解过程的发生，使其更好地作用于羊胚胎及羊胎盘等原料，进一步分解得到更多小分子物质，更有利于皮肤吸收；制备得到的羊胎素的抗氧化能力明显增强，应用于化妆品中，显著提升了化妆品的保湿能力，且抗皱效果也得到明显改善。
本发明又公开了上述羊胎素的应用，用于制备羊胎素精华液。
一种羊胎素精华液，包括如下重量份数的原料：
羊胎素提取物0.5～5份、枸杞提取物0.8～4份、芦荟提取物0.1～3份、增稠剂0.1～1.5份、保湿剂4～8份、抗氧化剂0.1～1.5份、香精0.04～1.2份、防腐剂0.05～0.3份、去离子水80～95份。本发明提供的羊胎素精华液中，羊胎素由本发明制备，含有较多的小分子肽、氨基酸、蛋白质、矿物质、糖类核酸等活性成分，对老化细胞产生更好的再生和活化作用，修复损伤的细胞，改善皮肤质量、减少或者消除皱纹、增强肌肤弹性、缩小皮肤毛孔等。芦荟提取物能够具有使皮肤收敛、柔软化、保湿的性能，还可以解除硬化、角化、改善伤痕，防止小皱纹形成，改善皮肤松弛状况，还能保持皮肤湿润，且能够治疗皮肤炎症。枸杞提取物中含有丰富的生物活性物质，如黄酮、多糖、蛋白质、氨基酸、胡萝卜素、维生素等，具有明显的延缓衰老、美白祛斑、抗氧化等功效。各提取物组分之间协同作用，使得制备的精华液具有优异的护肤效果，明显改善肌肤状况。
优选地，保湿剂包括甘油、丁二醇、卵磷脂、山梨醇、透明质酸或胶原蛋白中的一种或几种。
对于增稠剂没有特别的限定，可以为本领域常用的各种增稠剂，优选情况下，增稠剂选自海藻酸钠、硬脂醇、丙烯酸酯或羟丙基纤维素中的一种或几种。
优选地，抗氧化剂包括维生素A、维生素C、维生素E或维生素D中的一种或几种。
对于防腐剂没有特别的限定，可以为本领域常用的各种防腐剂，优选情况下，防腐剂选自苯氧乙醇、辛甘醇、季铵盐-15中的一种或几种。
进一步的，上述枸杞提取物包含水提物和醇提物，两者的质量比为1:0.6～0.8。
具体的，上述枸杞提取物的制备工艺包括：采用复合酶酶解提取的方法对枸杞进行酶解提取得到枸杞提取物。
具体的，上述枸杞提取物的制备工艺，步骤包括：
取枸杞粉粹，加入6～8倍量石油醚脱脂2～3次，每次1～2h，风干得到枸杞粉末；
取枸杞粉末，采用复合酶进行酶解提取，酶解结束后用沸水浴灭菌10～15min，冷却后加入依次用10～12倍量水、65～80％乙醇提取2～3次，每次1～2h，各自合并提取液浓缩、干燥，得到水提物和醇提物，以质量比为1:0.6～0.8的比例混合得到枸杞提取物。
优选地，复合酶包括纤维素酶、糖化酶、漆酶、糜蛋白酶中的一种或多种。
更优选地，复合酶包括纤维素酶、糖化酶、漆酶、糜蛋白酶；纤维素酶、糖化酶、漆酶、糜蛋白酶的质量比为1:0.4～0.6:0.5～0.8:0.1～0.3。本发明在枸杞提取物的制备过程中采用复合酶酶解法辅助提取，选择纤维素酶、糖化酶、漆酶、糜蛋白酶特殊组合的复合酶对枸杞进行酶解，然后再分别进行水提和醇提，得到枸杞的水提物和醇提物，相比于传统提取方法以及现有技术，显著增加了枸杞水提物中多糖含量，并且醇提物中总黄酮的含量也得到明显增加，进而制备得到的枸杞提取物的生物活性得到明显改善，应用于化妆品中，有效提升了化妆品的保湿能力和抗皱效果。
优选地，复合酶酶解的条件包括：酶解45～60℃，酶解时间1.5～3h，pH为4～8；复合酶使用量为枸杞粉末的0.3～1.5wt％。
优选地，水提物中多糖含量为13.4～16.2％。
优选地，醇提物中总黄酮含量为1.2～2.1％。
需要说明的是，本发明的羊胎素精华液可应用于各种化妆品，包括但不仅限于乳液、面霜、眼霜、精华液，应用领域十分广泛。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明羊胎素通过浸提和酶解提取的方式获得，生物活性高；且在酶解过程中加入D-泛酸钙、盐酸吡哆醇和甲羟戊酸，增强蛋白酶生物活性，加深酶解程度，制备得到的羊胎素的抗氧化能力、保湿性能以及抗衰老能力进一步增强。将本法明制备的羊胎素提取物，结合其它高效护肤提取物，加工而成的精华液等，具备更加高效的保湿、抗衰老、抗皱、美白等功效。同时，对枸杞提取物的制备工艺进行改进，采用复合酶酶解法辅助提取，获得的枸杞提取物具有更佳的生物活性，保湿能力明显增强，且具有优异的抗皱性能。
因此，本发明提供了一种羊胎素提取方法及在化妆品中的应用，该提取方法得到的羊胎素具有更高的抗氧化能力，应用于化妆品中，能够明显增强化妆品的保湿性能，且进一步改善其抗皱效果。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细描述：
实施例1：
一种羊胎素提取方法，包括：
(1)预处理：取羊胚胎、羊胎盘清洗除杂后，2℃下粉碎过60～100目筛得到粗粉；
(2)粗提取：取步骤(1)获得的粗粉，加入蒸馏水浸提4h，料液比为1g：40mL；之后离心，上清液浓缩为粗提液；
(3)酶解提取：取步骤(2)中得到的离心沉淀物，加入组合酶制剂(糜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、弹性蛋白酶、菠萝蛋白酶的质量比为1:0.4:0.5:0.3)进行酶解，灭酶、抽滤得到酶解液；其中，酶解时，温度为50℃，时间为4h，pH为8.5；组合酶制剂的用量为离心沉淀物的3wt％；灭酶处理时，温度为90℃，时间为40min；
(4)合并步骤(2)中得到的粗提液和步骤(3)中得到的酶解液，过滤、浓缩、冷冻干燥获得羊胎素，包含29.8％分子量在1000以内的物质，42.7％分子量在1000～10000的物质，25.8％分子量在10000～40000的物质。
实施例2：
一种羊胎素提取方法与实施例1不同：
(1)预处理：取羊胚胎、羊胎盘清洗除杂后，0℃粉碎过60～100目筛得到粗粉；
(2)粗提取：取步骤(1)获得的粗粉，加入蒸馏水浸提5h，料液比为1g：50mL；之后离心，上清液浓缩为粗提液；
(3)酶解提取：取步骤(2)中得到的离心沉淀物，加入组合酶制剂(糜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、弹性蛋白酶、菠萝蛋白酶的质量比为1:0.3:0.6:0.2)进行酶解，灭酶、抽滤得到酶解液；其中，酶解时，温度为45℃，时间为3h，pH为8；组合酶制剂的用量为离心沉淀物的4wt％；灭酶处理时，温度为85℃，时间为60min；
(4)合并步骤(2)中得到的粗提液和步骤(3)中得到的酶解液，过滤、浓缩、冷冻干燥获得羊胎素，其包含26.9％分子量在1000以内的物质，44.1％分子量在1000～10000的物质，26.8％分子量在10000～40000的物质。
实施例3：
一种羊胎素提取方法，包括：
(1)预处理：取羊胚胎、羊胎盘清洗除杂后，低温粉碎过60～100目筛得到粗粉；
(2)粗提取：取步骤(1)获得的粗粉，加入蒸馏水浸提4h，料液比为1g：40mL；之后离心，上清液浓缩为粗提液；
(3)酶解提取：取步骤(2)中得到的离心沉淀物，加入组合酶制剂(糜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、弹性蛋白酶、菠萝蛋白酶的质量比为1:0.4:0.5:0.3)进行酶解，同时在酶解过程中加入D-泛酸钙、盐酸吡哆醇和甲羟戊酸(质量比为1:0.7:0.5，其中D-泛酸钙的添加量为离心沉淀物的1wt％)；灭酶、抽滤得到酶解液；其中，酶解时，温度为50℃，时间为4h，pH为8.5；组合酶制剂的用量为离心沉淀物的3wt％；灭酶处理时，温度为90℃，时间为40min；
(4)合并步骤(2)中得到的粗提液和步骤(3)中得到的酶解液，过滤、浓缩、冷冻干燥获得羊胎素，包含44.6％分子量在1000以内的物质，36.8％分子量在1000～10000的物质，16.7％分子量在10000～40000的物质。
实施例4：
一种羊胎素提取方法与实施例3的区别：
组合酶制剂酶解过程中不添加甲羟戊酸；获得羊胎素中包含38.2％分子量在1000以内的物质，30.1％分子量在1000～10000的物质，18.9％分子量在10000～40000的物质。
实施例5：
一种羊胎素提取方法与实施例3的区别：
组合酶制剂酶解过程中不添加D-泛酸钙；获得羊胎素中包含40.1％分子量在1000以内的物质，29.3％分子量在1000～10000的物质，16.4％分子量在10000～40000的物质。
实施例6：
一种羊胎素提取方法与实施例3的区别：
组合酶制剂酶解过程中不添加盐酸吡哆醇；获得羊胎素中包含36.4％分子量在1000以内的物质，32.9％分子量在1000～10000的物质，17.5％分子量在10000～40000的物质。
实施例7：
一种羊胎素提取物用于制备羊胎素精华液：
该羊胎素精华液的原料组份，包括：按重量份计，实施例1所制备的羊胎素提取物3份、枸杞提取物2份、芦荟提取物2份、增稠剂1份、保湿剂6份、抗氧化剂0.8份、香精0.5份、防腐剂0.15份、去离子水86份。
其中，保湿剂包括甘油、卵磷脂、透明质酸，质量比为1:1.5:0.3；增稠剂包括海藻酸钠、硬脂醇，质量比为1:0.4；抗氧化剂包括维生素A、维生素C、维生素E和维生素D，质量比为1:1:0.5:0.5；防腐剂为苯氧乙醇。
上述羊胎素精华液的制备方法：
(1)将羊胎素提取物、芦荟提取物、枸杞提取物和保湿剂、香精、抗氧化剂溶解于部分去离子水中(达到溶解的目的即可)；
(2)将增稠剂加入剩余去离子水中混合均匀；
(3)接着加入防腐剂进行混合获得羊胎素精华液。
其中，枸杞提取物的制备：
取枸杞粉粹，加入8倍量石油醚脱脂3次，每次1h，风干得到枸杞粉末；
取枸杞粉末，依次用10倍量水、80％乙醇提取3次，每次1h，各自合并提取液浓缩、干燥，得到水提物和醇提物，以质量比为1:0.72的比例混合得到枸杞提取物。需要说明的是，水提物中多糖含量为7.28％；醇提物中总黄酮含量为0.63％。
实施例8：
一种羊胎素提取物用于制备羊胎素精华液：
该羊胎素精华液的原料组份，包括：按重量份计，实施例2所制备的羊胎素提取物1份、枸杞提取物1.5份、芦荟提取物3份、增稠剂0.1份、保湿剂7份、抗氧化剂1.5份、香精0.2份、防腐剂0.2份、去离子水80份。
其中，保湿剂包括甘油、丁二醇、卵磷脂、山梨醇、透明质酸和胶原蛋白，质量比为1:1.2:0.4:0.3:0.2:0.1；增稠剂包括海藻酸钠、硬脂醇、丙烯酸酯和羟丙基纤维素，质量比为1:0.2:0.3:0.1；为抗氧化剂为维生素C；防腐剂为辛甘醇。
枸杞提取物的制备与实施例7相同。
上述羊胎素精华液的制备方法与实施例7相同。
实施例9：
一种羊胎素提取物用于制备羊胎素精华液与实施例7的区别：
该羊胎素精华液的原料组份中枸杞提取物为本实施例制备的。
上述羊胎素精华液的制备与实施例7相同。
其中，枸杞提取物的制备：
取枸杞粉粹，加入8倍量石油醚脱脂3次，每次1h，风干得到枸杞粉末；
取枸杞粉末加蒸馏水润湿后，采用复合酶(纤维素酶、糖化酶、漆酶、糜蛋白酶的质量比为1:0.5:0.6:0.2)进行酶解提取，复合酶使用量为枸杞粉末的1.2wt％，其中酶解50℃，先加入纤维素酶、糖化酶和漆酶，pH为5条件下酶解时间1.5h，然后调节pH为7.8，加入糜蛋白酶再酶解1.5h；酶解结束后用沸水浴灭菌15min，冷却后加入依次用10倍量水、80％乙醇提取3次，每次1h，各自合并提取液浓缩、干燥，得到水提物和醇提物，以质量比为1:0.72的比例混合得到枸杞提取物；需要说明的是，水提物中多糖含量为16.25％，醇提物中总黄酮含量为1.98％。
实施例10：
一种羊胎素提取物用于制备羊胎素精华液与实施例9的区别：
该羊胎素精华液的原料组份中枸杞提取物为本实施例制备的。
上述羊胎素精华液的制备与实施例9相同。
其中，枸杞提取物的制备与实施例9的区别：
复合酶中不添加漆酶、糜蛋白酶；需要说明的是，水提物中多糖含量为10.91％，醇提物中总黄酮含量为0.93％。
实施例11：
一种羊胎素提取物用于制备羊胎素精华液与实施例9的区别：
该羊胎素精华液的原料组份中枸杞提取物为本实施例制备的。
上述羊胎素精华液的制备与实施例9相同。
其中，枸杞提取物的制备与实施例9的区别：
复合酶中不添加漆酶；需要说明的是，水提物中多糖含量为12.4％，醇提物中总黄酮含量为1.10％。
实施例12：
一种羊胎素提取物用于制备羊胎素精华液与实施例9的区别：
该羊胎素精华液的原料组份中枸杞提取物为本实施例制备的。
上述羊胎素精华液的制备与实施例9相同。
其中，枸杞提取物的制备与实施例9的区别：
复合酶中不添加糜蛋白酶；需要说明的是，水提物中多糖含量为12.2％，醇提物中总黄酮含量为1.13％。
实施例13：
一种羊胎素提取物用于制备羊胎素精华液与实施例7的区别：
该羊胎素精华液的原料组份中羊胎素为实施例3制备的。
上述羊胎素精华液的制备与实施例7相同。
其中，枸杞提取物的制备与实施例7相同。
实施例14：
一种羊胎素提取物用于制备羊胎素精华液与实施例7的区别：
该羊胎素精华液的原料组份中羊胎素为实施例3制备的。
上述羊胎素精华液的制备与实施例7相同。
其中，枸杞提取物的制备与实施例9相同。
试验例1：
多糖含量测定
对照样品溶液配制：取25mg葡萄糖溶液蒸馏水并定容至50mL，得到0.5mg/mL葡萄糖储备液，然后稀释得到25、50、75、100、125、150μg/mL的葡萄糖对照品溶液。
标准曲线绘制：取不同浓度的葡萄糖对照品溶液各1mL，置于具塞试管中，加入5％苯酚溶液1mL，混合均匀后加入浓硫酸5mL，振摇后置于沸水浴中加热30min，取出冷却至室温，加蒸馏水1mL，混匀后测定484nm处的吸光度A1；另外，取不同浓度的葡萄糖对照品溶液各1mL，置于具塞试管中，加蒸馏水1mL，混合均匀后加入浓硫酸5mL，振摇后置于沸水浴中加热30min，取出冷却至室温，加入5％苯酚溶液1mL，混匀后测定484nm处的吸光度A2；计算对应的吸光度差值，由质量浓度对吸光度差值进行线性回归得到标准曲线。
样品测定：取水提物样品溶于蒸馏水中得到浓度为0.25mg/mL的待测样品溶液，按照上述标准曲线绘制方法操作，测定吸光度值得到吸光度差值，根据标准曲线即可得到多糖含量。
总黄酮含量测定
对照样品溶液配制：取25mg芦丁标准品溶于85％乙醇溶液，置于温水浴中加热溶解，冷却后加入85％乙醇定容至100mL，得到0.25mg/mL的芦丁对照品溶液。
标准曲线绘制：分别取0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、1.8mL取对照品溶液，加入0.3mL5％质量分数的亚硝酸钠溶液，7min后加入0.3mL 10％质量分数的硝酸铝溶液，7min后再加入4mL 4％质量分数的氢氧化钠溶液，最后加入85％乙醇定容至10mL；设置蒸馏水同样操作作为空白对照，测定510nm处吸光度，得到标准曲线方程。
样品测定：取醇提物样品溶于85％乙醇中得到浓度为0.25mg/mL的待测样品溶液，按照上述标准曲线绘制方法操作，测定吸光度值得到吸光度，根据标准曲线计算总黄酮含量。
试验例2：
抗氧化活性测定
DPPH自由基清除率测试
取2.0mL浓度为0.5mg/mL的羊胎素样品溶液(溶剂为无水乙醇)，加入2.0mL DPPH自由基溶液(溶剂为无水乙醇)，混合均匀后置于25℃、避光的条件下，反应1h，测定517nm处吸光度值A1。设置对照组为2.0mL乙醇溶液和2.0mL样品，测定其吸光度值A2；设置空白组为2.0mL乙醇溶液和2.0mL DPPH自由基溶液，测定其吸光度值A0。最后按照下列式子计算DPPH自由基清除率：
DPPH自由基清除率％＝[1-(A1-A2)/A0]×100％
对实施例1～6制备得到的羊胎素进行上述测试，结果如表1所示：
表1抗氧化性能测试结果
从表1中数据分析可知，本发明实施例3制备的羊胎素的DPPH自由基清除率明显高于实施例1、实施例4-6的，且实施例4-6的效果好于实施例1，表明在组合酶制剂酶解过程中加入D-泛酸钙、盐酸吡哆醇和甲羟戊酸中的至少两种，能够作用于生物酶，进而改善其生物活性，促进酶解的发生，并且制备得到的羊胎素的分子量分布发生明显变化，其抗氧化性能得到显著增强。同时，在D-泛酸钙、盐酸吡哆醇和甲羟戊酸同时存在的条件下，对制备的羊胎素抗氧化能力的提升效果更佳。
试验例3：
精华液保湿抗皱评价
选取25-40岁的健康女性志愿者160名，随机分成8组，每组20人，分别对应涂抹实施例7～14制备得到的羊胎素精华液，涂覆于脸部进行皮肤护理，使用频率为每周护理2次，每次涂覆时间20min，持续使用2个月。分别观察测试者皮肤的保湿度以及抗皱效果，并进行问卷评估，获得综合评估数据。
评价标准
保湿度：分为A-E五个等级。其中，A级代表保湿度明显改善，B级代表保湿度有所改善，C级代表保湿度使用前后无区别，D级代表保湿度有所变差；E级代表保湿度明显变差。
抗皱效果：分为I-V五个等级。其中，I级代表皮肤弹性明显改善、干纹/细纹淡化明显，II代表皮肤弹性有所改善、干纹/细纹有所淡化，III级代表皮肤弹性、干纹/细纹情况使用前后无区别，IV级代表皮肤弹性、干纹/细纹情况有所变差；V级代表皮肤弹性、干纹/细纹情况明显变差。
测试结果如表2和表3所示：
表2保湿性能测试结果
从表2中数据分析可知，本发明实施例13制备的羊胎素精华液的保湿度明显高于实施例7的，表明在组合酶制剂酶解过程中加入D-泛酸钙、盐酸吡哆醇和甲羟戊酸，能够作用于生物酶，进而改善其生物活性，制备得到的羊胎素的生物活性更佳，应用于精华液的制备中，明显提升了精华液的保湿能力。实施例9制备的羊胎素精华液的保湿度明显高于实施例7、实施例10-12的，实施例14的效果好于实施例13的，且实施例10-12的效果稍好于实施例7的，表明采用复合酶酶解法辅助提取获得枸杞提取物，具有更加优异的保湿效果，应用于精华液的制备中，能够进一步改善精华液的保湿性能；并且在纤维素酶、糖化酶、漆酶、糜蛋白酶共同存在的条件下，提取得到的枸杞提取物的保湿能力更强。
表3抗皱效果测试结果
从表3中数据分析可知，本发明实施例13制备的羊胎素精华液的抗皱效果明显高于实施例7的，表明在组合酶制剂酶解过程中加入D-泛酸钙、盐酸吡哆醇和甲羟戊酸，能够作用于生物酶，进而改善其生物活性，制备得到的羊胎素的生物活性更佳，应用于精华液的制备中，明显提升了精华液的抗皱能力。实施例9制备的羊胎素精华液的抗皱效果明显高于实施例7、实施例10-12的，实施例14的效果好于实施例13的，且实施例10-12的效果稍好于实施例7的，表明采用复合酶酶解法辅助提取获得枸杞提取物，具有更加优异的抗皱效果，应用于精华液的制备中，能够进一步改善精华液的抗皱能力；并且在纤维素酶、糖化酶、漆酶、糜蛋白酶共同存在的条件下，提取得到的枸杞提取物的抗皱能力更强。
试验例4：
蛋白酶酶活性测定
取1g蛋白酶，在最适pH和温度下，1min内水解酪蛋白产生1ug酪氨酸定义为1个单位酶活力，以u/g表示。酪氨酸的量通过福林酚试剂测定，用三氯乙酸沉淀多余的酪蛋白，使蛋白酶失活。
测试方法：取1g待测蛋白酶样品溶于磷酸缓冲溶液(pH 6.8)中，上清液定容至100mL，加入添加剂(蛋白酶与添加剂的质量比为5:1)混合均匀后，取1mL，加入10mg/mL浓度的酪蛋白1mL，45℃恒温振荡反应10min，在加入TCA 3mL，反应15min，之后离心，取上清液1mL，加入福林酚试剂1mL和0.4M浓度碳酸钠5mL，水浴20min后测定680nm处的吸光度值。最后按照下列式子计算酶活力：
蛋白酶活力＝7AK/10n
式中，A代表吸光度平均值；K代表吸光常数；7代表总体积；10代表酶解时间，n代表酶液的的稀释倍数。
实验分组
实验组(待测蛋白酶+添加剂)包括：M1，待测蛋白酶+D-泛酸钙、盐酸吡哆醇(质量比1:0.7)；M2，待测蛋白酶+D-泛酸钙、甲羟戊酸(质量比1:0.5)；M3，待测蛋白酶+盐酸吡哆醇、甲羟戊酸(质量比0.7:0.5)；M4，待测蛋白酶+D-泛酸钙、盐酸吡哆醇、甲羟戊酸(质量比1:0.7:0.5)。对照组：D，待测蛋白酶。
测试结果如表4所示：
表4蛋白酶活力测试结果
从表4中数据分析可知，M1-M3组实验测试的蛋白酶活力明显高于D组的，M4组的效果明显好于M1-M3组的，说明本发明在组合酶制剂酶解过程中加入D-泛酸钙、盐酸吡哆醇和甲羟戊酸中的至少两种，能够作用于生物酶，进而改善其生物活性，提高酶活性。同时，在D-泛酸钙、盐酸吡哆醇和甲羟戊酸同时存在的条件下，对蛋白酶生物活性的增强效果更佳。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (7)
1.一种羊胎素提取物，其包含35~50%分子量在1000以内的物质，25~40%分子量在1000~10000的物质，10~20%分子量在10000~40000的物质；所述羊胎素采用组合酶制剂酶解法辅助提取获得；所述组合酶制剂为糜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、弹性蛋白酶和菠萝蛋白酶的组合；所述糜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、弹性蛋白酶、菠萝蛋白酶的质量比为1:0.3~0.5:0.4~0.6:0.2~0.4；所述酶解处理过程中加入D-泛酸钙、盐酸吡哆醇和甲羟戊酸；
D 泛酸钙、盐酸吡哆醇和甲羟戊酸的质量比为1:0.6~0.8:0.4~0.6；
所述羊胎素提取物的制备方法，包括：
（1）预处理：取羊胚胎、羊胎盘清洗除杂后，低温粉碎过60~100目筛得到粗粉；
（2）粗提取：取步骤（1）获得的粗粉，加入蒸馏水浸提3~6h；之后离心，上清液浓缩为粗提液；
（3）酶解提取：取步骤（2）中得到的离心沉淀物，加入组合酶制剂进行酶解，同时在酶解过程中加入D 泛酸钙、盐酸吡哆醇和甲羟戊酸，其中D 泛酸钙的添加量为离心沉淀物的0.5~1.5wt%，灭酶、抽滤得到酶解液；
（4）合并步骤（2）中得到的粗提液和步骤（3）中得到的酶解液，过滤、浓缩、冷冻干燥获得羊胎素。
2.权利要求1所述的羊胎素提取物的制备方法，包括：
（1）预处理：取羊胚胎、羊胎盘清洗除杂后，低温粉碎过60~100目筛得到粗粉；
（2）粗提取：取步骤（1）获得的粗粉，加入蒸馏水浸提3~6h；之后离心，上清液浓缩为粗提液；
（3）酶解提取：取步骤（2）中得到的离心沉淀物，加入组合酶制剂进行酶解，同时在酶解过程中加入D 泛酸钙、盐酸吡哆醇和甲羟戊酸，其中D 泛酸钙的添加量为离心沉淀物的0.5~1.5wt%，灭酶、抽滤得到酶解液；
（4）合并步骤（2）中得到的粗提液和步骤（3）中得到的酶解液，过滤、浓缩、冷冻干燥获得羊胎素。
3.根据权利要求2所述的羊胎素提取物的制备方法，其特征在于：所述组合酶制剂的用量为离心沉淀物的2~4wt%。
4.根据权利要求2所述的羊胎素提取物的制备方法，其特征在于：所述粗粉与蒸馏水的料液比为1g：40~60mL。
5.根据权利要求2所述的羊胎素提取物的制备方法，其特征在于：所述酶解处理时，温度为45~55℃，时间为3~6h。
6.权利要求1所述的羊胎素提取物在制备化妆品中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述化妆品包括乳液、面霜、眼霜、精华液。
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