CN101797344B - 一种淡竹叶精制总黄酮的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种淡竹叶精制总黄酮的制备方法，该制备方法确定了最佳提取温度，分离材料，洗脱剂浓度，首次采用大孔树脂和聚酰胺树脂联用的方法纯化总黄酮，然后采用制备液相精制总黄酮，用方法学考察确定流动相，并采用淡竹叶中黄酮类化合物特有的双吸收波长，有针对性、高效率的分离纯化总黄酮，能得到纯度达90～99％的总黄酮，本发明提供的总黄酮的制备方法可操作性强，较传统的分离纯化方法分离效率更高，且分离得到的淡竹叶总黄酮含量高，并且制备工艺中能量消耗少，生产成本低，对环境无污染。

Description

一种淡竹叶精制总黄酮的制备方法

技术领域

本发明涉及一种总黄酮的提取分离方法，具体涉及一种从淡竹叶中提取分离得到精制总黄酮的制备方法。

背景技术

中药淡竹叶(Herba Lophatheri)为禾本科(Gramineae)植物淡竹叶(Lophatherum gracileBrongn.)的干燥茎叶。本品性寒，味甘、淡，归心、胃、小肠经，有清热除烦，利尿的功效，用于热病烦渴，小便赤涩淋痛，口舌生疮。淡竹叶中含有大量的黄酮、多糖、内酯、叶绿素、氨基酸、维生素和微量元素等成分，淡竹叶中的黄酮类化合物具有较高的生物活性，可用于治疗心血管疾等疾病。

目前，在淡竹叶的研究方面检索到3项发明创造，分别为申请号为02114071.5的淡竹叶饮料，该发明公开了一种竹子和淡竹叶的营养成分，是一种清凉饮料，适合高血压、高血脂、糖尿病、痔疮和肥胖人士饮用；申请号为200910059831.5的中国专利公开了一种绞股蓝淡竹叶SOD抗癌保健饮料及其制备方法，将生物技术与中草药相结合，发现绞股蓝皂苷、竹叶黄酮、茶叶多酚及超强抗氧化自由基清除剂超氧化物歧化酶协同抗癌作用，还具有防治心脑血管疾病、糖尿病、美容、健身等多功效；申请号为200910023279.4的中国专利公开了淡竹叶黄酮在制备治疗低血压的药物用途，发现淡竹叶黄酮有明显的收缩动脉和升高血压的作用，并通过实验证明了其具有治疗低血压的功效。现有技术中淡竹叶黄酮的提取纯化分离技术尚无专利报道，虽然现有技术中分离纯化黄酮的方法较多，主要有色谱法，但是不同植物中含有的黄酮种类和结构都存在很大的差别，从而化学性质存在差异，在提取纯化过程中套用一般的提取纯化方法，得到的黄酮的纯度不高，如要达到很高的纯度，其分离效率较低，成本较高，目前针对淡竹叶提取纯化高纯度的黄酮的方法没有报道，且淡竹叶里含有的特有结构类型的黄酮，由于其活性强很有利用价值，因此为了充分利用资源，满足市场需求，很有必要研发出一套提取纯化效率高、成本低、且黄酮含量高的制备方法。

发明内容：

发明目的：本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种淡竹叶精制总黄酮的制备方法。

技术方案：为了实现以上目的，本发明提供的淡竹叶精制总黄酮的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)取新鲜淡竹叶拣选、洗净、干燥后放入提取罐中，加5～10倍量的水，加热回流1～3次，过滤、合并提取液，浓缩，得淡竹叶的水提液备用；

(2)取步骤(1)得到的淡竹叶水提液加入乙醇使淡竹叶水提液中乙醇的浓度达到65％～75％，静置、沉淀，滤出溶液，浓缩，得淡竹叶水提液的醇沉液待用；

(3)取步骤(2)得到的淡竹叶醇沉液上大孔树脂柱，先分别用水和浓度为10％乙醇洗脱，再用浓度为50％～55％的乙醇洗脱，薄层色谱检识、收集50％～55％乙醇洗脱液、浓缩、减压干燥得到淡竹叶总黄酮的粗提物，备用；

(4)取步骤(3)得到的淡竹叶总黄酮的粗提物干法上聚酰胺柱，先分别用水和20％乙醇洗脱，再用浓度为50％～55％乙醇洗脱，薄层色谱检识、并收集50％～55％乙醇洗脱液，浓缩，经减压干燥得到淡竹叶总黄酮；

(5)取步骤(4)得到的淡竹叶总黄酮采用制备液相进一步富集总黄酮，得到总黄酮含量为90％～99％的淡竹叶精制总黄酮。

以上所述的制备方法，作为优选方案，步骤(1)中提取条件为加10倍量水，加热到80℃持续回流2小时，此操作步骤在加热回流提取过程中以80℃持续回流2小时，可以确保总黄酮提取较完全的同时不会破坏淡竹叶中活性黄酮的结构，经成分结构研究和药理活性表明：在110℃左右高温下淡竹叶中部分活性黄酮的结构会发生变化，如由原来的黄酮变成查儿酮，从而活性降低，因此本发明在提取总黄酮就严格控制提取的温度可以保证黄酮结构的稳定性。作为优选方案，步骤(2)中淡竹叶水提液加入高浓度的乙醇后淡竹叶水提液中乙醇的浓度为75％，此步骤操作的目的是为了除去淡竹叶水提液中的大分子化合物如多糖，鞣质等成分，便于后面的纯化工艺，可以大大提高纯化效率，当然最后淡竹叶水提液中乙醇的浓度不能太高也不能太低，如果浓度过高，会使一部分极性很大的黄酮苷成分沉淀，从而降低总黄酮的含量。

以上所述的制备方法，作为优选方案，步骤(3)中所述的大孔吸附树脂为非极性大孔吸附树脂，作为更优的方案，所述的非极性大孔吸附树脂采用D101型大孔吸附树脂，本发明通过正交实验筛选不同极性不同型号的大孔树脂、不同浓度(10％、20％、40％、50％、60％)的乙醇洗脱剂，以总黄酮的含量为指标，采用紫外比色法测定总黄酮的含量，实验结果表明以非极性大孔吸附树脂D101型大孔吸附树脂除杂效果比较好，且实验结果表明浓度为10％的乙醇可以洗脱大部分极性稍大的杂质，但是对黄酮成分的洗脱能力弱，紫外检测结果表明黄酮含量很低仅1％，而浓度为50％的乙醇对总黄酮的洗脱能力最好，基本可以洗脱吸附的所有黄酮类成分，但是随着乙醇浓度的增加，虽然能够洗脱出黄酮，但是同时也会把一些其它杂质一起洗脱下来，使黄酮的纯度降低，因此本发明经正交实验筛选结果确定出最佳的吸附材料为D101型大孔吸附树脂和洗脱剂为浓度为50％的乙醇；且步骤(3)先用纯水冲洗大孔树脂可以洗脱掉大部分极性大的水溶性杂质，有利于后续的纯化。本发明在用50％乙醇洗脱黄酮类成分时以薄层色谱作为检识手段，所用的薄层板为聚酰胺薄层板，展开剂由体积比为2.2∶4.8∶2.5∶1.0∶0.8的二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水组成，该展开剂具有很好分离淡竹叶水提液成分，展开后薄层色谱斑点清晰，分离效果好，Rf值适中，显色剂为10％三氯化铝，并在365nm紫外灯下检视，合并具有黄酮类成分的流份，去除不含黄酮类成分的流份，因此分离的目的性强。

以上所述的制备方法，作为优选方案，步骤(4)中所述的聚酰胺树脂色谱纯化黄酮所用的聚酰胺树脂的粒径为60-80目，聚酰胺树脂对淡竹叶中的黄酮类化合物是一种很好的分离材料，可以选着性的分离淡竹叶中含有的黄酮，淡竹叶中含有的黄酮大多含有酚羟基可以和聚酰胺树脂形成较强的氢键吸附作用，从而可以和其它不具黄铜结构的成分分离，本发明也考察了10％、20％、40％、50％、60％不同浓度乙醇对黄酮类化合物在聚酰胺树脂柱上的解吸附能力，以总黄酮的含量为指标，采用紫外比色法测定总黄酮的含量，实验结果表明20％以下乙醇对黄酮的洗脱能力较弱，但是可以去除大部分极性大的杂质，因此本发明首先采用20％乙醇去杂，实验结果表明浓度为50～60％的乙醇对淡竹叶中黄酮化合物具有很好的洗脱能力，几乎可以洗脱所有黄酮类化合物，同样实验结果发现随着乙醇浓度的增加，虽然能够洗脱出黄酮，但是同时也会把一些其它杂质一起洗脱下来，使黄酮的纯度降低，最终选用50～60％的乙醇洗脱聚酰胺柱，并用薄层色谱作为检识手段，所用的薄层板为聚酰胺薄层板，展开剂由体积比为2.2∶4.8∶2.5∶1.0∶0.8的二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水组成，该展开剂具有很好分离淡竹叶水提液成分，展开后薄层色谱斑点清晰，分离效果好，Rf值适中，显色剂为10％三氯化铝，并在365nm紫外灯下检视，合并具有黄酮类成分的流份，去除不含黄酮类成分的流份，

以上所述的制备方法，经过醇沉、大孔吸附树脂和聚酰胺联合树脂除杂后得到淡竹叶总黄酮，以三氯化铝作为显色剂紫外比色法检测总黄酮的含量已达到了60％以上，为了进一步纯化总黄酮，除去成分不明的杂质，保证总黄酮的质量，本发明继续通过制备液相方法富集总黄酮，其色谱条件为：色谱柱选用安捷伦反相C18柱，流动相经方法学考察以甲醇-0.5％磷酸水溶液梯度洗脱，作为优选，梯度洗脱的条件为：0至30分钟，甲醇的含量由5％上升到50％，30至60分钟甲醇的含量由50％上升到88％，在此流动相条件下，经聚酰胺柱色谱纯化后淡竹叶总黄酮在色谱柱上能够完全分离，重复性好，能够很好分段收集所需部位，大大提高纯化效率，且检测波长选用283nm和331nm，流速为5ml/min，检测器为二极管陈列检测器，本发明在选用检测波长上，根据淡竹叶含有黄酮的结构类型，经全波长扫描后，通过3D吸收线观测，发现淡竹叶含有的总黄酮在283nm和331nm的检测波长下都有很大吸收，因此本发明以在283nm和331nm的检测波长下都有很大吸收的峰作为黄酮类化合物特征吸收峰，本发明利用二极管陈列检测器，采用双波长同时检测的方法确定黄酮类化合物的峰，有目的，有针对性的收集流份，去除非黄酮类化合物的流份，最后合并得到纯度高的淡竹叶精制总黄酮，含量检测总黄酮的含量可以达到90～99％。

有益效果：本发明提供的淡竹叶精制总黄酮的制备方法和现有技术相比具有以下优点：

(1)本发明提供的制备方法可操作性强，提取分离效率高，分离得到的淡竹叶总黄酮含量高，并且制备工艺中能量消耗少，生产成本低，对环境无污染。

(2)本发明提供的淡竹叶精制总黄酮的制备方法的制备方法，较系统的考察了，提取温度对总黄酮质量的影响，确定题却温度80℃；在分离过程中本发明首次采用大孔树脂和聚酰胺树脂联用的方法纯化总黄酮，确定最佳的大孔树脂材料和聚酰胺材料，尤其在洗脱剂方面，重点考察了不同浓度的乙醇的洗脱能力，确定洗脱工艺，先用20％乙醇除杂，再用对总黄酮洗脱能力强对杂质洗脱能力弱的50％乙醇洗脱，可以最大程度得到纯度高的总黄酮，使纯化效率提高，另外本发明再用制备液相纯化总黄酮，用方法学考察确定流动相，并采用淡竹叶中黄酮类化合物特有吸收波长，有针对性、高效率的分离纯化总黄酮，能得到纯度达90～99％的总黄酮，且通过对照品确定所得到的精制淡竹叶总黄酮中日当药黄素含量较高。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

一种淡竹叶精制总黄酮的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)取新鲜淡竹叶15千克拣选、洗净、干燥后放入放入多功能提取罐中，加10倍量的水，在80℃下加热回流2次，过滤、合并提取液，浓缩，得淡竹叶的水提液备用；

(2)取步骤(1)得到的淡竹叶水提液加入95％乙醇使淡竹叶水提液中乙醇的浓度达到75％，静置过夜、沉淀，滤出溶液，浓缩，得淡竹叶水提液的醇沉液待用；

(3)取步骤(2)得到的淡竹叶醇沉液上D101型大孔树脂柱，先分别用水和浓度为10％乙醇洗脱树脂柱，再用浓度为50％的乙醇洗脱，用聚酰胺薄层板点样，以体积比为2.2∶4.8∶2.5∶1.0∶0.8的二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水组成的展开剂展开，再用10％三氯化铝显色剂显色，并在365nm紫外灯下检视、收集合并50％乙醇洗脱液中含有黄酮的流份、浓缩、减压干燥得到淡竹叶总黄酮的粗提物1200克，紫外比色法检测总黄酮含量为31％，备用；

(4)取步骤(3)得到的淡竹叶总黄酮的粗提物干法上60～80目的聚酰胺柱，先分别用水和20％乙醇洗脱除杂，再用浓度为50％乙醇洗脱，用步骤(3)相同的薄层色谱检识、并收集合并50％乙醇洗脱液中含有黄酮成分的流份，浓缩，经减压干燥得到淡竹叶总黄酮600克，紫外比色法检测总黄酮含量为62％；

(5)取步骤(4)得到的淡竹叶总黄酮采用制备液相进一步富集总黄酮，其色谱条件为：色谱柱选用安捷伦反相C18柱，流动相以甲醇-0.5％磷酸水溶液梯度洗脱，梯度洗脱的条件为：0至30分钟，甲醇的含量由5％上升到50％，30至60分钟甲醇的含量由50％上升到88％，检测波长选用283nm和331nm双波长检测，流速为5ml/min，检测器为二极管陈列检测器，有目的，有针对性的收集黄酮类化合物流份，最后合并得到纯度为99％的淡竹叶精制总黄酮330克。

实施例2

一种淡竹叶精制总黄酮的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)取新鲜淡竹叶50千克拣选、洗净、干燥后放入放入多功能提取罐中，第一次用10倍量的水，在80℃下加热回流，第二次用6倍量的水，在80℃下加热回流，过滤、合并二次的提取液，浓缩，得淡竹叶的水提液备用；

(2)取步骤(1)得到的淡竹叶水提液加入95％乙醇使淡竹叶水提液中乙醇的浓度达到70％，静置过夜、沉淀，滤出溶液，浓缩，得淡竹叶水提液的醇沉液待用；

(3)取步骤(2)得到的淡竹叶醇沉液上D101型大孔树脂柱，先分别用水和浓度为10％乙醇洗脱树脂柱，再用浓度为55％的乙醇洗脱，用聚酰胺薄层板点样，以体积比为2.2∶4.8∶2.5∶1.0∶0.8的二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水组成的展开剂展开，再用10％三氯化铝显色剂显色，并在365nm紫外灯下检视、收集合并55％乙醇洗脱液中含有黄酮的流份、浓缩、减压干燥得到淡竹叶总黄酮的粗提物4000克，紫外比色法检测总黄酮含量为32％，备用；

(4)取步骤(3)得到的淡竹叶总黄酮的粗提物干法上60～80目的聚酰胺柱，先分别用水和20％乙醇洗脱除杂，再用浓度为55％乙醇洗脱，用步骤(3)相同的薄层色谱检识、并收集合并55％乙醇洗脱液中含有黄酮成分的流份，浓缩，经减压干燥得到淡竹叶总黄酮2100克，紫外比色法检测总黄酮含量为60％；

(5)取步骤(4)得到的淡竹叶总黄酮采用制备液相进一步富集总黄酮，其色谱条件为：色谱柱选用安捷伦反相C18柱，流动相以甲醇-0.5％磷酸水溶液梯度洗脱，梯度洗脱的条件为：0至30分钟，甲醇的含量由5％上升到50％，30至60分钟甲醇的含量由50％上升到88％，检测波长选用283nm和331nm双波长检测，流速为5ml/min，检测器为二极管陈列检测器，有目的，有针对性的收集黄酮类化合物流份，最后合并得到纯度为99.5％的淡竹叶精制总黄酮850克。

实施例3不同浓度乙醇洗脱大孔树脂吸附的黄酮类化合物的能力比较

本实验考察了10％、20％、40％、50％、60％不同浓度的乙醇洗脱黄酮化合物的能力和洗脱下来黄酮化合物的纯度，以总黄酮的含量为指标，采用紫外比色法，以吸光度对浓度做标准曲线Y＝236.5X+112.4测定总黄酮的百分含量，具体实验结果如表1所示：

表1不同浓度的乙醇洗脱黄酮化合物的能力情况

实验结果表明浓度为10％的乙醇可以洗脱大部分极性稍大的杂质，但是对黄酮成分的洗脱能力弱，紫外检测结果表明黄酮含量很低仅1％，而浓度为50％的乙醇对总黄酮的洗脱能力最好，基本可以洗脱吸附的所有黄酮类成分，但是随着乙醇浓度的增加，虽然能够洗脱出黄酮，但是同时也会把一些其它杂质一起洗脱下来，使黄酮的纯度降低，因此本发明经实验筛选结果确定大孔树脂柱的最佳洗脱剂为浓度为50％的乙醇。

实施例4不同浓度乙醇洗脱聚酰胺树脂吸附的黄酮类化合物的能力比较

本实验考察了10％、20％、40％、50％、60％不同浓度的乙醇洗脱黄酮化合物的能力和洗脱下来黄酮化合物的纯度，以总黄酮的含量为指标，采用紫外比色法，以吸光度对浓度做标准曲线Y＝236.5X+112.4测定总黄酮的百分含量，具体实验结果如表2所示：

表2不同浓度的乙醇洗脱黄酮化合物的能力情况

实验结果表明浓度为20％的乙醇可以洗脱大部分极性稍大的杂质，但是对黄酮成分的洗脱能力弱，紫外检测结果表明黄酮含量很低仅5％左右，而浓度为50％的乙醇对总黄酮的洗脱能力最好，基本可以洗脱吸附的所有黄酮类成分，但是随着乙醇浓度的增加，虽然能够洗脱出黄酮，但是同时也会把一些其它杂质一起洗脱下来，使黄酮的纯度降低，因此本发明经实验筛选结果确定聚酰胺树脂柱的最佳洗脱剂为浓度为50％的乙醇。

Claims (3)

1.一种淡竹叶精制总黄酮的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)取新鲜淡竹叶拣选、洗净、干燥后放入提取罐中，加5～10倍量的水，80℃加热回流1～3次，过滤、合并提取液，浓缩，得淡竹叶的水提液备用；

(2)取步骤(1)得到的淡竹叶水提液加入乙醇使淡竹叶水提液中乙醇的浓度达到65％～75％，静置、沉淀，滤出溶液，浓缩，得淡竹叶水提液的醇沉液待用；

(3)取步骤(2)得到的淡竹叶醇沉液上非极性D101型大孔吸附树脂，先分别用水和浓度为10％乙醇洗脱，再用浓度为50％～55％的乙醇洗脱，薄层色谱检识、收集50％～55％乙醇洗脱液、浓缩、减压干燥得到淡竹叶总黄酮的粗提物，备用；

(4)取步骤(3)得到的淡竹叶总黄酮的粗提物干法上粒径为60-80目聚酰胺柱，先分别用水和20％乙醇洗脱，再用浓度为50％～55％乙醇洗脱，薄层色谱检识、并收集50％～55％乙醇洗脱液，浓缩，经减压干燥得到淡竹叶总黄酮；

(5)取步骤(4)得到的淡竹叶总黄酮采用制备液相进一步富集总黄酮，得到总黄酮含量为90％～99％的淡竹叶精制总黄酮，所述制备液相富集总黄酮的色谱条件为：色谱柱为安捷伦反相C18柱，流动相为甲醇-0.5％磷酸水溶液梯度洗脱，检测波长为283nm和331nm，流速为5ml/min，检测器为二极管陈列检测器。

2.根据权利要求1所述的淡竹叶精制总黄酮的制备方法，其特征在于，步骤(2)中淡竹叶水提液加入乙醇后淡竹叶水提液中乙醇的浓度为75％。

3.根据权利要求1所述的淡竹叶精制总黄酮的制备方法，其特征在于，步骤(3)和步骤(4)中所述的薄层色谱检识所用的薄层板为聚酰胺薄层板，展开剂由体积比为2.2∶4.8∶2.5∶1.0∶0.8的二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水组成，显色剂为10％三氯化铝。