CN103054038B - 一种具有降血糖活性竹叶黄酮提取物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有降血糖活性竹叶黄酮提取物的制备方法,所述方法是将新鲜竹叶预处理,用水提取获得竹叶水提物,再将竹叶水提物经过絮凝剂沉淀、浓缩、萃取、层析步骤进行分离纯化,最终获得高含量的竹叶黄酮提取物;药理实验表明该竹叶黄酮提取物有一定的降血糖功效,效果与拜糖平相当。本发明的竹叶黄酮提物制备方法中使用的萃取剂为食品添加剂,安全性能好;聚乙烯聚吡咯烷酮是啤酒澄清剂,用于食品成分分离纯化安全性好;本发明方法获得的竹叶黄酮含量81-86 %,回收率为28.3-33%;本发明方法具有工艺简单、操作方便、黄酮含量高、设备投资少、产品可用于普通食品中等优势。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种具有降血糖活性竹叶黄酮提取物的制备方法。
(二)背景技术
竹子的医疗作用早已为我国人们所认识,据《本草纲目》记,苦竹、甘竹、淡竹及竹沥、竹笋等均有不同的药用价值。竹子中的药用成分主要是黄酮类成分,竹叶黄酮具有明显的抗脂质过氧化、清除羟自由基和调节血脂功能及抗过敏、抗炎、抗菌、抗突变、抗肿瘤、抗溃疡、抗病毒、保护心血管疾病及保肝等生理活性,是一种十分理想的天然生物黄酮新资源。
(三)发明内容
本发明目的旨在充分利用我国竹叶资源,提供一种具有降血糖活性的高黄酮含量的竹叶提取物制备方法,并应用于食品与保健品中,克服现有技术的不足,具有工艺简单、操作方便、产品竹叶黄酮含量高、设备投资少、无环境污染的优点。
本发明采用的技术方案是:
一种具有降血糖活性高含量竹叶黄酮提取物的制备方法,所述方法按如下步骤进行:
(1)将新鲜竹叶清洗、烘干后粉碎并过20目筛,获得竹叶粉末,将竹叶粉末与水以质量比1:7~10混合后,在室温下搅拌浸泡1~3h,然后升温至80~100℃下加热回流浸提0.5~3h,冷却至30~50℃后过滤,获得滤液,即竹叶水提物;
(2)在步骤(1)获得的竹叶水提物中搅拌加入絮凝剂,在室温下静 置2~ 6h,然后离心(优选在每分钟10000转的条件下,于20℃离心10分钟),弃去沉淀,获得上清液a;所述絮凝剂为海藻酸钠、壳聚糖或羧甲基纤维素;
(3)将步骤(2)获得的上清液a减压浓缩后加入乙醇水溶液使乙醇体积终浓度为70~90%,静置4~12小时后,离心,获得上清液b,将上清液b减压浓缩至浓缩物无乙醇味,获得浸膏;通常工艺上常选用95%的乙醇在醇沉,浓缩物中无乙醇味通常指乙醇体积浓度低于5%。
(4)将步骤(3)获得的浸膏加水配成混合液,再将混合液用萃取剂在50~80℃条件下搅拌30~ 90分钟进行萃取,萃取完全后冷却至30~40℃,静置分层,获得上层萃取液和下层萃余液,将上层萃取液减压浓缩(优选于旋转蒸发仪中,在真空度为0.09Mpa,50~60℃条件下减压浓缩),除去溶剂和水,即得竹叶黄酮粗提液;所述萃取剂由有机溶剂A和有机溶剂B以体积比为1000:1~5混合组成,有机溶剂A为乙酸乙酯或乙酸乙酯与异丙醇以体积比5~9:1的混合溶液;有机溶剂B为乙酸;
(5)将步骤(4)获得竹叶黄酮粗提液进行柱层析,以聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)为吸附剂,以体积浓度70%~80%的乙醇水溶液为洗脱剂,收集含目标组分的洗脱液,将洗脱液减压浓缩除去水(优选在真空度为0.09Mpa,50~60℃条件下减压浓缩),获得竹叶黄酮提取物,再以2BV体积浓度 95%的乙醇水溶液洗脱层析柱来再生聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)。
进一步,步骤(2)所述絮凝剂以质量浓度0.1~5%絮凝剂水溶液的形式加入。
进一步,步骤(2)所述絮凝剂水溶液与竹叶水提物体积比为1~5:1000。
进一步,步骤(2)所述絮凝剂以质量浓度1%絮凝剂水溶液的形式加入,絮凝剂水溶液与竹叶水提物体积比为2:1000。
进一步,将步骤(2)获得的上清液a体积减压浓缩至步骤(1)获得的竹叶水提物体积的1/20~1/30倍,加入体积浓度95%乙醇水溶液使乙醇体积终浓度为70~90%(优选80%)。
进一步,所述混合溶液是将步骤(3)获得的浸膏加水配成步骤(1)获得的竹叶水提物体积的1/10~1/8倍。
进一步,步骤(4)中所述萃取剂由有机溶剂A和有机溶剂B以体积比为1000:2混合组成,有机溶剂A为乙酸乙酯或乙酸乙酯与异丙醇以体积比8:1的混合液;有机溶剂B为乙酸。
进一步,步骤(4)中所述萃取剂的体积用量与混合液的体积比为2~5:1。
进一步,步骤(5)中所述柱层析按如下步骤进行:将步骤(4)获得竹叶黄酮粗提液以0.01~ 0.05BV/min(优选0.02BV/min)速度加入装有聚乙烯聚吡咯烷酮的层析柱,先用2~5BV的蒸馏水洗脱至流出液无色,再以3~5 BV 体积浓度70%~80%(优选75%)的乙醇水溶液洗脱,收集洗脱液,将洗脱液减压浓缩除去水,获得竹叶黄酮提取物。
进一步,所述步骤(5)中聚乙烯聚吡咯烷酮用量为竹叶粉末质量的1/2。
本发明所述竹叶粉末按如下方法获得:以1~2年生刚竹属淡竹的干青叶为原料,要求在秋冬季(11月~翌年2月)采收, 采收后及时脱水干燥至水分含量在12%以下, 破碎打包后在通风干燥的环境中储存。允许在干青叶中混有少量的秆箨。
本发明获得的竹叶黄酮可直接用于食品或保健品中。
与现有技术相比,本发明的有益效果主要体现在:
(1)本发明的竹叶黄酮提物制备方法中使用的萃取剂为食品添加剂,安全性能好;聚乙烯聚吡咯烷酮是啤酒澄清剂,用于食品成分分离纯化安 全性好。
(2)本发明方法获得的竹叶黄酮含量81-86 %,回收率为28.3-33%;
(3)本发明方法具有工艺简单、操作方便、黄酮含量高、设备投资少、产品可用于普通食品中等优势。
(四)附图说明
图1 实施例2制备的竹叶水提物液相色谱图;
图2 实施例2制备的竹叶高黄酮含量提取物液相色谱图,图中峰1-峰9为黄酮类成分。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
所述竹叶粉末的制备方法为:以1~2年生刚竹属淡竹的干青叶为原料, 要求在秋冬季(11月~翌年2月)采收,及时脱水干燥至水分含量在10%以下, 破碎至20目打包后在干燥的环境中储存。
竹叶水提物与竹叶黄酮提取物液相色谱条件:
液相条件(Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6mm×250mm, 5μm);流动相混合溶剂A(乙腈)和溶剂B(0.2%乙酸水,v/v)梯度洗脱条件:10% A(34 min),10-15% A(34-82 min),15-10% A(85-90 min)。流速1.0mL·min-1;检测波长330nm;柱温30℃;进样量20μL)。
实施例1
称取100g粉碎至20目的竹叶粉末于圆底烧瓶中,加入1000g水,室温(25℃)搅拌浸泡3小时,然后在100℃下加热回流浸提3小时,将反应液冷却至30℃,过滤,取滤液即得竹叶水提物,约985 mL;在竹叶水提物中加入1mL质量浓度0.2%海藻酸钠水溶液,室温下搅拌6小时,然后在20℃下,以每分钟10000转高速离心10分钟除沉淀,获得上清液; 取上清液在旋转蒸发仪(0.09MPa,60℃)中减压浓缩至35 mL,加入体积浓度95%乙醇水溶液100mL使乙醇体积终浓度为70%,静置6小时后,取上清液,于旋转蒸发仪(0.09MPa,60℃)上浓缩至约35mL,获得浸膏,此时浸膏中乙醇残留量约为3.2%(体积浓度);将浸膏加入蒸馏水配成100mL混合液,加入三口圆底瓶中,同时在圆底瓶中加入300mL乙酸乙酯和1mL乙酸制成混合液,将混合液在50℃下搅拌萃取90分钟进行萃取,然后将混合液冷却至30℃,置于分液漏斗中,静置30分钟进行分层,获得上层萃取液和下层萃余液;上层萃取液在旋转蒸发仪(0.09MPa,60℃)上浓缩至40mL左右,得到竹叶黄酮粗提液。
将竹叶黄酮粗提液按0.014BV/min流速加入装有60ml聚乙烯聚吡咯烷酮(pvpp)色谱柱(2.4cm×60cm)上进行吸附,上样完后,用2BV 蒸馏水进行洗脱,除去糖份和蛋白类成分,再用4BV 体积浓度80%乙醇水溶液洗脱黄酮类成分,收集这部分洗脱液,将洗脱液在旋转蒸发仪(0.09MPa,55℃)上减压浓缩至含水量小于5%,得到竹叶黄酮提取物4.9g。紫外分管光度法测得黄酮含量81.5%,黄酮提取率29.8%。
实施例2
称取1kg粉碎至20目的竹叶粉末于圆底烧瓶中,加入7kg水,室温(25℃)搅拌浸泡2小时,然后在100℃下加热回流浸提3小时,将反应液冷却至40℃,过滤,取滤液即得竹叶水提物6.95L;在所述竹叶水提物中加入30ml质量浓度5%壳聚糖水溶液,室温搅拌5小时,然后在20℃下,以每分钟10000转高速离心10分钟除沉淀,获得上清液;取上清液在旋转蒸发仪(0.08MPa,60℃)中减压浓缩至305 mL,加入体积浓度95%乙醇水溶液1084 mL使乙醇体积终浓度约为80 %,静置6小时后,取上清液,将上清液在旋转蒸发仪(0.08 MPa,60℃)中减压浓缩至300 mL,获得浸膏,此时浸膏中乙醇体积含量约为4.1%;将浸膏加入蒸馏水 配成650ml左右混合液,移入三口圆底瓶中,同时在圆底瓶中加入1.5 L乙酸乙酯,0.18L异丙醇和2mL乙酸制成混合液,将混合液在70℃下搅拌萃取60分钟后冷却至40℃,置于分液漏斗中,静置30分钟进行分层,获得上层萃取液和下层萃余液;上层萃取液在旋转蒸发仪(0.09MPa,55℃)上减压浓缩至350ml,得竹叶黄酮粗提液。
将竹叶黄酮粗提液按0.02BV/min流速加入含有550ml聚乙烯聚吡咯烷酮(pvpp)色谱柱(4.8cm×80cm)上进行吸附,上样完后,用3.6BV 蒸馏水进行洗脱,除去糖份和蛋白类成分,再用4.5BV的 75%乙醇洗脱黄酮类成分,回收这部分溶液,采用旋转蒸发仪(0.09MPa,55℃)上减压浓缩至含水量小于5%,得到竹叶黄酮提取物53 g。紫外分管光度法测得黄酮含量82.5%,黄酮提取率31.1%。
实施例3 竹叶黄酮提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性
采用传统的“Tremblay”法(Chapdelaine P, Tremblay RR, Dubé JY. P-Nitrophenol-alpha-D-glucopyranoside as substrate for measurement of maltase activity in human semen. Clin Chem. 1978, 24(2): 208-211.),利用α-葡萄糖苷酶催化水解对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG),通过测定释放出来的对硝基苯酚的量确定α-葡萄糖苷酶活性。以一定时间内反应体系中对硝基苯酚的含量变化来计算提取物的酶抑制活性。结果如下表1所示:竹叶黄酮提取物在体外对α-葡萄糖苷酶具有一定抑制活性。
表1竹叶黄酮提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性
反应液配制方法:
0.083 mol/L pH 6.8的磷酸盐缓冲液:将7.95 g K2HPO4·3H20,4.752 g KH2PO4溶解于超纯水中,调整pH至6.8,用超纯水定容于500 mL容量瓶中,4℃低温保藏。
0.1 U/mL含0.2%BSA的α-葡萄糖苷酶(购自与上海士峰生物科技公司):称取0.001 g固体酶,用含0.2%BSA上述磷酸缓冲溶液定容于10 ml。容量瓶中,-20℃冻存,使用时低温解冻并稀释5倍使用。
8 mmol/L的PNPG:精密称取0.024 g PNPG(购自与上海士峰生物科技公司),用缓冲溶液定容于10 mL容量瓶中,4℃低温保藏。
α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定方法:
以PNPG为底物,通过HPLC检测水解产物4-硝基酚(p-Nitro-phenol,PNP)的变化,确定α-葡萄糖苷酶的活性。实验在1.5 mL离心管中进行,先加入10 μL 0.083 mol/L pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液、30μL 0.1 U/mL α-葡萄糖苷酶,振荡混匀,37℃孵育20 min,再加入40 μL 8.0 mmol/L PNPG开启反应,震荡混匀,37℃反应30 min后,加入80 μL 0.2 mol/L Na2CO3终止反应,加超纯水稀释至500 μL,振荡混匀,经0.45 μm过滤后,用HPLC检测,通过产物PNP的浓度变化,计算α-葡萄糖苷酶的活性。
以纯净水溶解为待测样品,以相同体积的待测样品代替缓冲溶液加入到反应体系中。测试α-葡萄糖苷酶的抑制活性,同时设置阳性对照(以等体积的拜糖平(代替磷酸盐缓冲溶液)、空白对照(以等体积的磷酸盐缓冲溶液代替酶液),按照下式计算抑制率:
抑制率=(A-B)/A×100% 公式(1)
公式(1)中,A为不加待测样品时PNP的浓度(扣除相应空白,mmol/L);B为加入待测样品后PNP的浓度(扣除相应空白,mmol/L)。
实施例4 竹叶黄酮提取物对ICR小鼠糖耐量的影响
正常ICR小鼠禁食不禁水15小时,各组灌胃给药(药物剂量:100mg/kg,阳性药拜糖平:40mg/kg),同时各组经口给予蔗糖2.5g/kg,模型对照组经口给予蒸馏水的同时给予蔗糖2.5g/kg,正常空白对照组给予同样容积的蒸馏水,分别测定给葡萄糖后0、30、60、120min的血糖值,观察各组给葡萄糖后各时间点血糖曲线下面积的变化情况。
血糖曲线下面积=1/4×(0min血糖值+2×30min血糖值+3×60min血糖值+120min血糖值)。
结果如表2显示:竹叶黄酮提取物可明显改善ICR小鼠的糖负荷。
注: 与模型对照组比较:* P<0.05,** P<0.01。
Claims (9)
1.一种具有降血糖活性竹叶黄酮提取物的制备方法,其特征在于所述方法按如下步骤进行:
(1)将新鲜竹叶清洗、烘干后粉碎并过20目筛,获得竹叶粉末,将竹叶粉末与水以质量比1:7~10混合后,在室温下搅拌浸泡1~3小时,然后升温至80~100℃下加热回流浸提0.5~3h,冷却至30~50℃后过滤,获得滤液,即竹叶水提物;
(2)在步骤(1)获得的竹叶水提物中搅拌加入絮凝剂,在室温下静置2~6小时,然后离心,弃去沉淀,获得上清液a;所述絮凝剂为壳聚糖;
(3)将步骤(2)获得的上清液a减压浓缩后加入乙醇水溶液使乙醇体积终浓度为70~90%,静置4~12小时后,取上清液b减压浓缩至浓缩物无乙醇味,获得浸膏;
(4)将步骤(3)获得的浸膏加水配成混合液,再将混合液用萃取剂在50~80℃条件下搅拌30~90分钟进行萃取,萃取完全后冷却至30~40℃,静置分层,获得上层萃取液和下层萃余液,将上层萃取液减压浓缩至混合液体积的0.3~0.5倍,即得竹叶黄酮粗提液;所述萃取剂由有机溶剂A和有机溶剂B以体积比为1000:1~5混合组成,有机溶剂A为乙酸乙酯或乙酸乙酯与异丙醇以体积比5~9:1的混合溶液;有机溶剂B为乙酸;
(5)将步骤(4)获得竹叶黄酮粗提液以0.01~0.05BV/min速度加入装有聚乙烯聚吡咯烷酮的层析柱,先用2~5BV的蒸馏水洗脱至流出液无色,再以3~5BV体积浓度70%~80%的乙醇水溶液洗脱,收集含目标组分的洗脱液,将洗脱液减压浓缩除去水,获得竹叶黄酮提取物。
2.如权利要求1所述的具有降血糖活性竹叶黄酮提取物的制备方法,其特征在于步骤(2)所述絮凝剂以质量浓度0.1~5%絮凝剂水溶液的形式加入。
3.如权利要求2所述的具有降血糖活性竹叶黄酮提取物的制备方法,其特征在于步骤(2)所述絮凝剂水溶液与竹叶水提物体积比为1~5:1000。
4.如权利要求2所述的具有降血糖活性竹叶黄酮提取物的制备方法,其特征在于步骤(2)所述絮凝剂以质量浓度1%絮凝剂水溶液的形式加入,絮凝剂水溶液与竹叶水提物体积比为2:1000。
5.如权利要求1所述的具有降血糖活性竹叶黄酮提取物的制备方法,其特征在于将步骤(2)获得的上清液a体积减压浓缩至步骤(1)获得的竹叶水提物体积的1/20~1/30倍,加入体积浓度95%乙醇水溶液使乙醇体积终浓度为70~90%。
6.如权利要求1所述的具有降血糖活性竹叶黄酮提取物的制备方法,其特征在于步骤(4)中所述混合液是将步骤(3)获得的浸膏加水配成步骤(1)获得的竹叶水提物体积的1/10~1/8倍。
7.如权利要求1所述的具有降血糖活性竹叶黄酮提取物的制备方法,其特征在于步骤(4)中所述萃取剂由有机溶剂A和有机溶剂B以体积比为1000:2混合组成,有机溶剂A为乙酸乙酯或乙酸乙酯与异丙醇以体积比8:1的混合液;有机溶剂B为乙酸。
8.如权利要求7所述的具有降血糖活性竹叶黄酮提取物的制备方法,其特征在于步骤(4)中所述萃取剂的体积用量与混合液的体积比为2~5:1。
9.如权利要求1所述的具有降血糖活性竹叶黄酮提取物的制备方法,其特征在于所述步骤(5)中聚乙烯聚吡咯烷酮用量为竹叶粉末质量的1/2。
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