CN111018933A - 一种罗汉果提取物产品及其制备方法与用途 - Google Patents

一种罗汉果提取物产品及其制备方法与用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种罗汉果提取物产品及其制备方法与用途，所述制备方法包括如下步骤：(1)取原料罗汉果粉碎，加水进行加热回流提取，过滤，减压浓缩，离心，收集上清液；(2)调pH至8.5～9.5，经大孔树脂吸附，先用水除杂，再用10％～20％乙醇除杂，40％～60％乙醇解析，收集解析液；(3)减压浓缩，补水至无醇，经MCI柱层析吸附，再经30％～35％乙醇洗脱、60％～65％乙醇洗脱、90％～95％乙醇洗脱，依次收集不同流份；(4)层析法检测，获得不同的目标流份；(5)分别进行减压浓缩，干燥，得产品。本发明制得的赛门苷I、罗汉果甜苷V和11‑O‑罗汉果皂苷V提取物的活性成分含量高，其中赛门苷I提取物和罗汉果甜苷V提取物具有治疗高尿酸血症的新用途，该工艺简单，易于操作，易于工业化生产。

Description

一种罗汉果提取物产品及其制备方法与用途
技术领域
本发明涉及植物提取技术领域，具体涉及一种罗汉果提取物产品及其制备方法与用途。
背景技术
罗汉果Siraitia grosvenorii(Swingle)C.Jeffrey，为葫芦科植物的干燥果实，以广西桂林的罗汉果品质最好。罗汉果味甜、性凉、无毒，具有清肺止咳、润肠通便、清热解毒、祛痰补血、益肝、健脾、促进肠胃功能等功效。罗汉果中含有葫芦烷素三萜苷类物质，包括赛门苷I、罗汉果甜苷IIE、罗汉果甜苷III、罗汉果甜苷IIIE、罗汉果甜苷IV、罗汉果甜苷V、罗汉果甜苷A、罗汉果新苷和11-O-罗汉果皂苷V等，除罗汉果甜苷IV和罗汉果新苷外，均有甜味物质，其中罗汉果甜苷V的甜度高，相当于蔗糖的300倍，另有文献报道赛门苷I甜度较罗汉果甜苷V高，二者热量低，都是糖尿病人的理想糖代品。
人类嘌呤化合物的代谢终产物是尿酸，嘌呤代谢紊乱导致高尿酸血症。在正常嘌呤饮食状态下，男性空腹血尿酸水平高于420μmol/L，女性高于360μmol/L，即称为高尿酸血症(hyperuricemia)。根据报道，我国目前约有1.2亿高尿酸血症者，约占总人口的10％，高发年龄为中老年男性和绝经后女性，但近年来有年轻化趋势。高尿酸血症发病时由于血液中的尿酸盐将发生结晶，结晶的尿酸盐将沉积在关节、皮下组织、肾脏等部位，进而出现痛风、关节炎、皮下痛风结石、肾脏结石或痛风性肾病等一系列临床表现。目前，对血液中尿酸的控制主要是通过以下两种途径实现的：(1)抑制尿酸的生成。尿酸是由次黄嘌呤和黄嘌呤必须经黄嘌呤氧化酶的作用而生成的，因此抑制黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)活性可有效的抑制尿酸的形成，进而起到治疗痛风等症状的作用，现常用的抑制尿酸生成的药物有别嘌呤醇、非布索坦等。(2)促进尿酸的排泄。常用的促进尿酸排泄的药物有丙磺舒、苯溴马龙等。上述两种方式均可降低血液中尿酸，进而对高尿酸血症引发的痛风、关节炎、皮下痛风结石、肾脏结石或痛风性肾病等病症产生疗效，但是上述药物毒副作用通常较大，会产生超敏综合症、骨髓抑制等严重的毒副作用；丙磺舒、苯溴马隆则具有刺激胃肠道、引发肾绞痛、激发痛风急性发作等副作用，在一定程度上限制了这些药物的临床应用。因此，寻找新型的高效低毒的高尿酸血症药物依然是目前药学研究的一个热点。
现有的专利申请号CN104262446A从罗汉果中提取罗汉果甜甙V的方法，将罗汉果加入乙醇回流提取，减压浓缩，经大孔树脂柱层析，酸液洗脱，合并酸洗液调pH至中性，经大孔树脂和硅胶作填充物的层析柱，用不同浓度乙醇洗脱，收集50％的乙醇洗脱液，干燥得到含量为95％左右的罗汉果甜甙V，该专利使用硅胶柱层析柱，不易大生产操作。
现有专利技术CN106977574A从罗汉果中提取罗汉果甙V的方法，该专利将罗汉果粉碎，高压处理，得到浆液超声波提取，得到粗提液离心分离取沉淀，沉淀用无水甲醇洗涤，洗涤后的沉淀用超滤膜处理，浓缩得到浓缩液，结晶，重结晶，干燥得到含量为98％～99％的罗汉果甙V，该专利纯化得到的仅有罗汉果甙V。
现有专利技术CN108516996A罗汉果益生元的提取方法及同时提取罗汉果甜苷V的方法，将罗汉果碾碎，冰水提取，过滤，调pH至碱性，过滤，经大孔树脂，收集流出液，纳滤膜过滤，经脱色树脂，得到罗汉果益生元含量97.3％。提取罗汉果甜苷V是将上柱后的大孔吸附树脂，水洗至中性，洗脱浓缩，上反向硅胶柱，洗脱，收集目标洗脱液，浓缩干燥，得到罗汉果甜苷V含量99.5％。该专利使用的纳滤膜，其生产成本高。
专利申请号CN109651480A一种分离罗汉果甜苷V的方法，将罗汉果加水打浆之后依次进行植物酶酶解，生物酶酶解，收集酶解液，灭酶之后进行酵母发酵，发酵液过有机膜，再经复合阴阳离子交换树脂纯化、浓缩干燥制得罗汉果甜苷V，所得罗汉果甜苷V大于60％，总苷大于90％。该专利方法酶解发酵时间长，纯化得到的罗汉果甜苷V含量低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服背景技术的技术缺陷，提供一种罗汉果提取物产品及其制备方法与用途。本发明以罗汉果(Siraitia grosvenorii)为原料，经提取纯化后分别得到赛门苷I提取物、罗汉果甜苷V提取物和11-O-罗汉果皂苷V提取物，其中赛门苷I提取物中的活性成分赛门苷I、罗汉果甜苷V提取物中的活性成分罗汉果甜苷V及11-O-罗汉果皂苷V提取物中的活性成分11-O-罗汉果皂苷V含量均大于95％。本发明制备得到的赛门苷I提取物、罗汉果甜苷V提取物和11-O-罗汉果皂苷V提取物的活性成分含量高，其中赛门苷I提取物和罗汉果甜苷V提取物具有治疗高尿酸血症的新用途，该工艺简单，易于操作，易于工业化生产。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
一种罗汉果提取物产品的制备方法，包括如下步骤：
(1)提取浓缩：取原料罗汉果药材粉碎，加水进行加热回流提取，过滤，减压浓缩，离心，收集上清液；
(2)大孔树脂纯化：取上清液加水稀释，将上清液调pH至8.5～9.5，经大孔树脂吸附，先用水除杂，再用10％～20％乙醇除杂，40％～60％乙醇解析，收集解析液；
(3)MCI柱层析纯化：将解析液减压浓缩，补水至无醇，得料液，经MCI柱层析吸附，再经1～1.5个MCI柱体积的30％～35％乙醇洗脱、1～1.5个MCI柱体积的60％～65％乙醇洗脱、1～1.5个MCI柱体积的90％～95％乙醇洗脱，每1/7～1/5个MCI柱体积为一个流份，依次收集不同流份；
(4)获得目标流份：经层析法检测，获得不同的目标流份；
(5)干燥：将不同的目标流份分别进行减压浓缩，干燥，得不同种类的罗汉果提取物。
优选地，所述步骤(4)中，所述获得不同的目标流份包括赛门苷I提取物目标流份、罗汉果甜苷V提取物目标流份、11-O-罗汉果皂苷V提取物目标流份中的任意一种或几种。
优选地，所述步骤(5)中，所述不同种类的罗汉果提取物包括赛门苷I提取物、罗汉果甜苷V提取物、11-O-罗汉果皂苷V提取物中的任意一种或几种。
一种赛门苷I提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)提取浓缩：取原料罗汉果药材粉碎，加水进行加热回流提取，过滤，减压浓缩，离心，收集上清液；
(2)大孔树脂纯化：取上清液加水稀释，将上清液调pH至8.5～9.5，经大孔树脂吸附，先用水除杂，再用10％～20％乙醇除杂，40％～60％乙醇解析，收集解析液；
(3)MCI柱层析纯化：将解析液减压浓缩，补水至无醇，得料液，经MCI柱层析吸附，再经1～1.5个MCI柱体积的30％～35％乙醇洗脱、1～1.5个MCI柱体积的60％～65％乙醇洗脱、1～1.5个MCI柱体积的90％～95％乙醇洗脱，每1/7～1/5个MCI柱体积为一个流份，依次收集不同流份；
(4)获得目标流份：经层析法检测，获得赛门苷I目标流份；
(5)干燥：将赛门苷I目标流份进行减压浓缩，干燥，得赛门苷I提取物。
一种罗汉果甜苷V提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)提取浓缩：取原料罗汉果药材粉碎，加水进行加热回流提取，过滤，减压浓缩，离心，收集上清液；
(2)大孔树脂纯化：取上清液加水稀释，将上清液调pH至8.5～9.5，经大孔树脂吸附，先用水除杂，再用10％～20％乙醇除杂，40％～60％乙醇解析，收集解析液；
(3)MCI柱层析纯化：将解析液减压浓缩，补水至无醇，得料液，经MCI柱层析吸附，再经1～1.5个MCI柱体积的30％～35％乙醇洗脱、1～1.5个MCI柱体积的60％～65％乙醇洗脱、1～1.5个MCI柱体积的90％～95％乙醇洗脱，每1/7～1/5个MCI柱体积为一个流份，依次收集不同流份；
(4)获得目标流份：经层析法检测，获得罗汉果甜苷V目标流份；
(5)干燥：将罗汉果甜苷V目标流份进行减压浓缩，干燥，得罗汉果甜苷V提取物。
一种11-O-罗汉果皂苷V提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)提取浓缩：取原料罗汉果药材粉碎，加水进行加热回流提取，过滤，减压浓缩，离心，收集上清液；
(2)大孔树脂纯化：取上清液加水稀释，将上清液调pH至8.5～9.5，经大孔树脂吸附，先用水除杂，再用10％～20％乙醇除杂，40％～60％乙醇解析，收集解析液；
(3)MCI柱层析纯化：将解析液减压浓缩，补水至无醇，得料液，经MCI柱层析吸附，再经1～1.5个MCI柱体积的30％～35％乙醇洗脱、1～1.5个MCI柱体积的60％～65％乙醇洗脱、1～1.5个MCI柱体积的90％～95％乙醇洗脱，每1/7～1/5个MCI柱体积为一个流份，依次收集不同流份；
(4)获得目标流份：经层析法检测，获得11-O-罗汉果皂苷V目标流份；
(5)干燥：将11-O-罗汉果皂苷V目标流份进行减压浓缩，干燥，得11-O-罗汉果皂苷V提取物。
优选地，所述步骤(1)中，所述水为纯化水。
优选地，所述步骤(1)中，按质量比，所述加热回流提取时，每次所述水的加入量为所述原料罗汉果药材质量的6～10倍。
优选地，所述步骤(1)中，所述加热回流提取时的温度为95～100℃。
更优选地，所述步骤(1)中，所述加热回流提取时的温度为100℃。
优选地，所述步骤(1)中，所述加热回流提取的次数为2～3次。
优选地，所述步骤(1)中，每次所述加热回流提取的时间为1.5～2.5小时。
更优选地，所述步骤(1)中，所述加热回流提取的次数为2次，每次所述加热回流提取的时间为2小时和1.5小时。
优选地，所述步骤(1)中，所述过滤采用滤布进行。
更优选地，所述步骤(1)中，所述滤布的目数为200～300目。
最优选地，所述步骤(1)中，所述滤布的目数为300目。
优选地，所述步骤(1)中，所述过滤后合并滤液。
优选地，所述步骤(1)中，所述减压浓缩的条件为65～70℃，-0.09Mpa。
优选地，所述步骤(1)中，按质量体积比，所述减压浓缩至料液体积为所述原料罗汉果药材质量的1倍；质量体积比为1是指原料1kg，减压浓缩至料液为1L。
优选地，所述步骤(1)中，所述离心时的转速为6000r/min。
优选地，所述步骤(1)中，所述离心趁热进行。
优选地，所述步骤(2)中，所述加水稀释时的水为纯化水。
优选地，所述步骤(2)中，所述调pH时加入浓度为5％的氢氧化钠进行。
优选地，所述步骤(2)中，所述大孔树脂包括D101、AB-8、LX-12、HPD100、NKA-9中的任意一种。
更优选地，所述步骤(2)中，所述大孔树脂为D101、AB-8、LX-12中的任意一种。
优选地，所述步骤(2)中，按质量体积比，所述大孔树脂柱体积为所述原料罗汉果药材质量的0.75～2倍；质量体积比为1是指原料1kg，大孔树脂柱体积为1L。
更优选地，所述步骤(2)中，按质量体积比，所述大孔树脂柱体积为所述原料罗汉果药材质量的1倍或1.4倍或1.5倍。
优选地，所述步骤(2)中，所大孔树脂吸附时的流速为每滴2秒。
优选地，所述步骤(2)中，所述用水除杂时的水为纯化水。
优选地，所述步骤(2)中，所述用水除杂时的水的加入量为2～4个大孔树脂柱体积。
更优选地，所述步骤(2)中，所述用水除杂时的水的加入量为2个大孔树脂柱体积。
优选地，所述步骤(2)中，所述10％～20％乙醇的加入量为2～4个大孔树脂柱体积。
更优选地，所述步骤(2)中，所述10％～20％乙醇的加入量为2个或3个大孔树脂柱体积。
优选地，所述步骤(2)中，所述40％～60％乙醇的加入量为3～5个大孔树脂柱体积。
优选地，所述步骤(2)中，所述40％～60％乙醇的加入量为3个大孔树脂柱体积。
优选地，所述步骤(3)中，所述减压浓缩的条件为68～70℃，-0.09Mpa。
优选地，所述步骤(3)中，按质量体积比，所述料液为所述原料罗汉果药材量的1/25～1/20倍；质量体积比为1/25是指原料1kg，料液为40ml。
更优选地，所述步骤(3)中，按质量体积比，所述料液为所述原料罗汉果药材量的1/25倍。
优选地，所述步骤(3)中，按质量体积比，所述MCI柱体积为所述原料罗汉果药材量的0.2～0.5倍质量体积比为0.2是指原料1kg，MCI柱体积为0.2L。
更优选地，所述步骤(3)中，按质量体积比，所述MCI柱体积为所述原料罗汉果药材量的0.2倍或0.25倍。
优选地，所述步骤(3)中，所述MCI柱层析吸附时的流速为3秒每滴。
优选地，所述步骤(3)中，再经1个MCI柱体积的30％～35％乙醇洗脱、1个MCI柱体积的60％～65％乙醇洗脱、1个MCI柱体积的90％～95％乙醇洗脱，每1/5个MCI柱体积为一个流份，依次收集不同流份。
优选地，所述步骤(3)中，所述30％～35％乙醇为30％乙醇。
优选地，所述步骤(3)中，所述60％～65％乙醇为60％乙醇。
优选地，所述步骤(3)中，所述90％～95％乙醇为95％乙醇。
优选地，所述步骤(4)中，所述层析法为薄层层析或高效液相色谱。
优选地，所述步骤(5)中，所述减压浓缩的条件为68℃，-0.09Mpa。
优选地，所述步骤(5)中，所述干燥为真空干燥。
一种赛门苷I提取物，采用如上所述制备方法制备得到。
优选地，所述赛门苷I提取物中的赛门苷I的含量大于95％。
一种罗汉果甜苷V提取物，采用如上所述制备方法制备得到。
优选地，所述罗汉果甜苷V提取物中的罗汉果甜苷V的含量大于95％。
一种11-O-罗汉果皂苷V提取物，采用如上所述制备方法制备得到。
优选地，所述11-O-罗汉果皂苷V提取物中的11-O-罗汉果皂苷V的含量大于95％。
如上所述的一种赛门苷I提取物在治疗高尿酸血症上的用途。
如上所述的一种罗汉果甜苷V提取物在治疗高尿酸血症上的用途。
上述技术方案中，所述％为质量百分含量。
本发明的基本原理：
本发明通过大量的试验，发现只有采用本发明如上所述的特定技术方案才可能实现本发明特定的技术效果，其他技术方案均无法实现本发明特定的技术效果。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明以罗汉果(Siraitia grosvenorii)为原料，经提取纯化得到不同种类的罗汉果提取物，其中赛门苷I提取物中的活性成分赛门苷I、罗汉果甜苷V提取物中的活性成分罗汉果甜苷V及11-O-罗汉果皂苷V提取物中的活性成分11-O-罗汉果皂苷V含量均大于95％。本发明制备得到的赛门苷I提取物和罗汉果甜苷V提取物的活性成分含量高，其具有治疗高尿酸血症的新用途，该工艺简单，易于操作，易于工业化生产。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于对本发明进一步说明，而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明所述的内容后，该领域的技术人员对本发明作出一些非本质的改动或调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
取2kg罗汉果粉碎，加入纯化水回流提取2次，每次加入的纯化水的量是罗汉果质量的8倍，100℃加热回流提取，时间为2和1.5小时，300目滤布过滤，合并滤液，温度70℃，-0.09Mpa减压浓缩，浓缩至2L，6000r/min离心过滤，取上清液加入2L纯化水稀释，5％氢氧化钠调pH至9.0，经2L大孔树脂D101(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)吸附，流速每滴2秒，4L纯化水除杂，10％乙醇4L除杂，40％乙醇6L解析，收集解析液，温度70℃，-0.09Mpa减压浓缩，补水至无醇，料液共80ml，经柱体积为0.5L MCI柱层析(日本三菱化学株式会社)，流速3秒每滴，30％乙醇0.5L洗脱，60％乙醇0.5L洗脱，95％乙醇0.5L洗脱，每100ml为一个流份，依次收集不同流份，经TLC薄层检测，第4～5流份为一份，第9～11流份为一份，第13流份为一份，温度68℃，-0.09Mpa减压浓缩，真空干燥得到8.42g赛门苷I提取物，赛门苷I含量95.12％，赛门苷I提取物得率0.42％；20.80g罗汉果甜苷V提取物，罗汉果甜苷V含量96.01％，罗汉果甜苷V提取物得率1.04％；5.21g11-O-罗汉果皂苷V提取物，11-O-罗汉果皂苷V含量95.03％，11-O-罗汉果皂苷V提取物得率0.26％。
实施例2
取5kg罗汉果粉碎，加入纯化水回流提取2次，每次加入的纯化水的量是罗汉果质量的6倍，100℃加热回流提取，时间为2和1.5小时，300目滤布过滤，合并滤液，温度67℃，-0.09Mpa减压浓缩，浓缩至5L，6000r/min离心过滤，取上清液加入5L纯化水稀释，5％氢氧化钠调pH至9.0，经7L大孔树脂AB-8(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)吸附，流速每滴2秒，14L纯化水除杂，20％乙醇14L除杂，60％乙醇21L解析，收集解析液，温度68℃，-0.09Mpa减压浓缩，补水至无醇，料液共200ml，经柱体积为1L MCI柱层析，流速3秒每滴，30％乙醇1L洗脱，60％乙醇1L洗脱，95％乙醇1L洗脱，每200ml为一个流份，依次收集不同流份，经TLC薄层检测，第4～5流份为一份，第8～10流份为一份，第12流份为一份，温度68℃，-0.09Mpa减压浓缩，真空干燥得到19.50g赛门苷I提取物，赛门苷I含量95.86％，赛门苷I提取物得率0.39％；47.00g罗汉果甜苷V提取物，罗汉果甜苷V含量95.41％，罗汉果甜苷V提取物得率0.94％；13.03g 11-O-罗汉果皂苷V提取物，11-O-罗汉果皂苷V含量95.56％，11-O-罗汉果皂苷V提取物得率0.26％。
实施例3
取6kg罗汉果粉碎，加入纯化水回流提取2次，每次加入的纯化水的量是罗汉果质量的10倍，100℃加热回流提取，时间为2和1.5小时，300目滤布过滤，合并滤液，温度70℃，-0.09Mpa减压浓缩，浓缩至6L，6000r/min离心过滤，取上清液加入6L纯化水稀释，5％氢氧化钠调pH至9.2，经9L大孔树脂LX-12(西安蓝晓科技新材料股份有限公司)吸附，流速每滴2秒，18L纯化水除杂，20％乙醇27L除杂，60％乙醇27L解析，收集解析液，温度70℃，-0.09Mpa减压浓缩，补水至无醇，料液共240ml，经柱体积为1.5L MCI柱层析(三菱化学)，流速3秒每滴，30％乙醇1.5L洗脱，60％乙醇1.5L洗脱，95％乙醇1.5L洗脱，每300ml为一个流份，依次收集不同流份，经TLC薄层检测，第5～6流份为一份，第9～11流份为一份，第13流份为一份，温度68℃，-0.09Mpa减压浓缩，真空干燥得到22.80g赛门苷I提取物，赛门苷I含量96.08％，赛门苷I提取物得率0.38％；58.20g罗汉果甜苷V提取物，罗汉果甜苷V含量96.21％，罗汉果甜苷V提取物得率0.97％；15.61g11-O-罗汉果皂苷V提取物，11-O-罗汉果皂苷V含量95.97％，11-O-罗汉果皂苷V提取物得率0.26％。
对比例1
取2kg罗汉果粉碎，加入纯化水回流提取2次，每次加入的纯化水的量是罗汉果质量的8倍，100℃加热回流提取，时间为2和1.5小时，300目滤布过滤，合并滤液，温度70℃，-0.09Mpa减压浓缩，浓缩至2L，6000r/min离心过滤，取上清液加入2L纯化水稀释，5％氢氧化钠调pH至9.0，经3L大孔树脂D101(沧州宝恩)吸附，流速每滴2秒，6L纯化水除杂，20％乙醇6L除杂，60％乙醇9L解析，收集解析液，温度70℃，-0.09Mpa减压浓缩，补水至无醇，料液共800ml，经柱体积为0.5L脱色树脂D900柱层析(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)，流速3秒每滴，收集下柱液，温度68℃，-0.09Mpa减压浓缩，真空干燥得到26.41g罗汉果提取物，罗汉果提取物得率1.32％，其中赛门苷I含量2.12％，罗汉果甜苷V含量70.01％，11-O-罗汉果皂苷V含量1.11％。
对比例2
取2kg罗汉果粉碎，加入纯化水回流提取2次，每次加入的纯化水的量是罗汉果质量的6倍，100℃加热回流提取，时间为2和1.5小时，300目滤布过滤，合并滤液，温度67℃，-0.09Mpa减压浓缩，浓缩至4L，加入100g氢氧化钙，搅拌1小时，静置1小时，6000r/min离心过滤，温度67℃，取上清液-0.09Mpa减压浓缩，温度67℃，真空-0.09Mpa，浓缩至料液200ml，经柱体积为0.5L MCI柱层析，流速3秒每滴，30％乙醇0.5L洗脱，60％乙醇0.5L洗脱，95％乙醇0.5L洗脱，每100ml为一个流份，依次收集不同流份，经TLC薄层检测，第4～5流份为一份，第8～11流份为一份，第13馏分为一份，温度68℃，-0.09Mpa减压浓缩，真空干燥得到10.61g赛门苷I提取物，赛门苷I含量55.86％，赛门苷I提取物得率0.53％；22.12g罗汉果甜苷V提取物，罗汉果甜苷V含量75.41％，罗汉果甜苷V提取物得率1.10％；13.60g 11-O-罗汉果皂苷V，含量35.97％，得率0.68％。
效果实施例
一、赛门苷I提取物、罗汉果甜苷V提取物和11-O-罗汉果皂苷V提取物的检测方法——薄层层析(TLC)：
用微量点样器分别吸取10μL流份液和对照品溶液点样于薄层层析板的点样线上(点样线距硅胶板底部2.0cm，每次点样均需吹干)，放入层析缸，展开剂(甲醇∶乙酸丁酯∶水＝15∶15∶4)中展开。当溶剂前沿展开至距离点样线约10cm时，取出薄层板。吹干溶剂，置于碘缸中显色，显示出清晰的棕色斑点。测试液展开后所得的点中，在相同高度位置的棕色斑点与标准品赛门苷I、罗汉果甜苷V和11-O-罗汉果皂苷V的斑点具有相同Rf值。
二、赛门苷I、罗汉果甜苷V和11-O-罗汉果皂苷V含量的检测方法——高效液相色谱(HPLC)：
赛门苷I、罗汉果甜苷V和11-O-罗汉果皂苷V对照品：纯度大于98％，赛门苷I对照品溶液配制，称取于105℃下干燥至恒重的赛门苷I对照品10mg(精确至0.0001g)于10mL容量瓶中，用甲醇溶液溶解并稀释至刻度，混匀。罗汉果甜苷V和11-O-罗汉果皂苷V对照品溶液同法操作。
色谱条件：色谱柱C18柱，柱长150mm，内径4.6mm，内装C18填充物，粒径5μm，或是同等分离效果的色谱柱。流动相∶乙腈(A)-水(B)＝23∶77，流速：1.0mL/min，检测波长：203nm，进样量：10μL，柱温：30℃。高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器或紫外检测器。
试样溶液的制备：称取于105℃下干燥至恒重的试样0.05g～0.1g(精确至0.0001g)，置于25mL容量瓶中，加入15mL甲醇溶液，超声使之完全溶解，继续加入甲醇溶液定容至刻度，用0.45μm微孔滤膜过滤。
测定：在规定色谱条件下，取对照品溶液和试样溶液各10μL分别注入液相色谱仪，进行色谱分析，以保留时间定性，峰面积定量。
结果计算：赛门苷I或罗汉果甜苷V或11-O-罗汉果皂苷V含量的质量分数w，按式(A.1)计算：
Figure BDA0002339349160000131
式中：A——试样溶液中赛门苷I或罗汉果甜苷V或11-O-罗汉果皂苷V的峰面积；c——赛门苷I或罗汉果甜苷V或11-O-罗汉果皂苷V对照品溶液的浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)；V——试样溶液的定容体积，单位为毫升(mL)；As——对照品溶液中赛门苷I或罗汉果甜苷V或11-O-罗汉果皂苷V的峰面积；m——试样的质量，单位为克(g)；1000——换算系数。计算结果保留小数点后两位。试验结果以两次平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值与算术平均值的比值不大于5.0％。
三、实施例1～3及对比例1～2所述得率＝样品质量/药材质量×100％。
四、将实施例1～3及对比例1～2制备得到的产品进行动物药理实验，方法如下：
取健康SPF级雄性SD大鼠150只，体重为170g～180g，由上海灵畅生物科技有限公司提供；随机平均分为15组，每组10只，分别为空白对照组，高尿酸血症模型组，阳性对照组，受试样品组，其中受试样品组共12组，分别为实施例1赛门苷I提取物(受试样品1)，实施例1罗汉果甜苷V提取物(受试样品2)，实施例1 11-O-罗汉果皂苷V提取物(受试样品3)，实施例2赛门苷I提取物(受试样品4)，实施例2罗汉果甜苷V提取物(受试样品5)，实施例2 11-O-罗汉果皂苷V提取物(受试样品6)，实施例3赛门苷I提取物(受试样品7)，实施例3罗汉果甜苷V提取物(受试样品8)，实施例3 11-O-罗汉果皂苷V提取物(受试样品9)，对比例1罗汉果提取物(受试样品10)，对比例2赛门苷I提取物(受试样品11)，对比例2罗汉果甜苷V提取物(受试样品12)。
高尿酸血症的造模：氧嗪酸钾作为化学诱导剂可抑制尿酸分解，增加体内血清尿酸水平，导致体内血尿酸水平升高。本实验选择氧嗪酸钾作造模剂，观察受试物对大鼠高尿酸血症的影响。正常组腹腔注射生理盐水，其余各组腹腔注射氧嗪酸钾溶液；给各组大鼠在造模的同时给予药物。
给药途径：灌胃给药(与人临床拟用药途径一致)。给药量：5mg/kg进行灌胃。给药时间：造模的同时给予治疗药物灌胃，阳性对照组非布索坦灌胃，每日上午按体重灌胃1次。给药期限：连续给药28天。空白对照组，高尿酸血症模型组不做处理。
实验周期为28d，期间每7天尾静脉取血一次，离心、分离血清，检测血清尿酸。结果以均值±标准差表示；体重及血清生化指标分别用SPSS 17.0统计软件计算出每组的平均值和标准差并进行ANOVA方差分析，P＜0.05为显著性差异。
表1给药28天期间各组大鼠尿酸(μmol/l)水平变化n＝10
组别 第0天尿酸 第7天尿酸 第14天尿酸 第21天尿酸 第28天尿酸
空白组 61.01±10.57 65.22±10.25 61.65±10.73 75.04±10.74 80.94±10.78
模型组 61.04±10.90 85.31±10.02 100.33±10.10 117.31±10.42 189.63±10.23
阳性对照组 61.04±10.20 65.34±10.35 68.55±10.63 77.04±10.11 89.08±10.91
受试样品1 62.14±10.20 65.62±10.78 69.22±10.47 78.63±10.21 90.74±10.31
受试样品2 60.94±10.20 63.87±10.45 66.98±10.73 73.04±10.01 80.17±10.54
受试样品3 62.23±10.11 84.78±10.32 100.13±10.42 116.99±10.41 189.26±10.37
受试样品4 62.58±10.20 65.42±10.48 69.80±10.57 78.38±10.83 91.22±10.27
受试样品5 61.06±10.20 63.34±10.73 66.79±10.53 72.99±10.52 80.08±10.31
受试样品6 62.15±10.03 84.96±10.50 99.94±10.27 116.92±10.11 189.38±10.51
受试样品7 62.74±10.20 65.82±10.46 69.82±10.44 78.89±10.81 91.03±10.53
受试样品8 61.01±10.20 62.83±10.67 65.75±10.63 71.84±10.59 79.98±10.87
受试样品9 62.34±10.01 84.89±10.36 99.98±10.49 117.34±10.52 189.35±10.10
受试样品10 62.04±10.15 81.04±10.52 99.04±10.22 117.04±10.21 189.47±10.70
受试样品11 62.11±10.41 75.62±10.36 90.82±10.62 95.90±10.14 155.98±10.02
受试样品12 62.51±10.16 71.52±10.66 95.82±10.62 99.89±10.33 159.29±10.05
从表1结果中可看出，对于模型组的大鼠，在经过28天之后的尿酸水平上升至189.63μmol/l，空白组的大鼠尿酸水平缓慢升高，受试样品组1～2、4～5、7～8和阳性对照组中的大鼠在28天过程中，尿酸水平得到了很好的控制和降低，而且受试样品第2、5和8组的降尿酸效果比阳性对照效果好。以上结果说明实施例1～3制备得到的赛门苷I提取物和罗汉果甜苷V提取物具有良好的降尿酸效果，其效果与治疗药非布索坦一致，其中罗汉果甜苷V提取物甚至比非布索坦效果更佳。
受试样品3、6、9大鼠尿酸水平与模型组基本一致，说明高含量的11-O-罗汉果皂苷V提取物并没有降尿酸效果。
受试样品10大鼠尿酸水平与模型组基本一致，说明单一的罗汉果提取物同样没有降尿酸效果。
受试样品11～12大鼠在28天后尿酸水平得到一定程度的控制和降低，但效果一般。说明先经氢氧化钙除杂再经过MCI柱层析相较实施例1～3先经大孔树脂吸附再经过MCI柱层析，赛门苷I提取物和罗汉果甜苷V提取物的降尿酸效果差很多。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种罗汉果提取物产品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取浓缩：取原料罗汉果药材粉碎，加水进行加热回流提取，过滤，减压浓缩，离心，收集上清液；
(2)大孔树脂纯化：取上清液加水稀释，将上清液调pH至8.5～9.5，经大孔树脂吸附，先用水除杂，再用10％～20％乙醇除杂，40％～60％乙醇解析，收集解析液；
(3)MCI柱层析纯化：将解析液减压浓缩，补水至无醇，得料液，经MCI柱层析吸附，再经1～1.5个MCI柱体积的30％～35％乙醇洗脱、1～1.5个MCI柱体积的60％～65％乙醇洗脱、1～1.5个MCI柱体积的90％～95％乙醇洗脱，每1/7～1/5个MCI柱体积为一个流份，依次收集不同流份；
(4)获得目标流份：经层析法检测，获得不同的目标流份；
(5)干燥：将不同的目标流份分别进行减压浓缩，干燥，得不同种类的罗汉果提取物。
2.如权利要求书1所述的一种罗汉果提取物产品的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述加热回流提取时的温度为95～100℃；按质量比，所述加热回流提取时，每次所述水的加入量为所述原料罗汉果药材质量的6～10倍；按质量体积比，所述减压浓缩至料液体积为所述原料罗汉果药材质量的1倍。
3.如权利要求书1所述的一种罗汉果提取物产品的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述大孔树脂包括D101、AB-8、LX-12、HPD100、NKA-9中的任意一种。
4.如权利要求书1所述的一种罗汉果提取物产品的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，按质量体积比，所述大孔树脂柱体积为所述原料罗汉果药材质量的0.75～2倍；所述用水除杂时的水的加入量为2～4个大孔树脂柱体积；所述10％～20％乙醇的加入量为2～4个大孔树脂柱体积；所述40％～60％乙醇的加入量为3～5个大孔树脂柱体积。
5.如权利要求书1所述的一种罗汉果提取物产品的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，按质量体积比，所述料液为所述原料罗汉果药材量的1/25～1/20倍；按质量体积比，所述MCI柱体积为所述原料罗汉果药材量的0.2～0.5倍。
6.一种赛门苷I提取物，其特征在于，采用如权利要求1～5任意一项所述的一种罗汉果提取物产品的制备方法制备得到；所述步骤(4)中，经层析法检测，获得赛门苷I提取物目标流份；所述步骤(5)中，将赛门苷I提取物目标流份进行减压浓缩，干燥，得赛门苷I提取物。
7.一种罗汉果甜苷V提取物，其特征在于，采用如权利要求1～5任意一项所述的一种罗汉果皂苷提取物的制备方法制备得到；所述步骤(4)中，经层析法检测，获得罗汉果甜苷V提取物目标流份；所述步骤(5)中，将罗汉果甜苷V提取物目标流份进行减压浓缩，干燥，得罗汉果甜苷V提取物。
8.一种11-O-罗汉果皂苷V提取物，其特征在于，采用如权利要求1～5任意一项所述的一种罗汉果提取物产品的制备方法制备得到；所述步骤(4)中，经层析法检测，获得11-O-罗汉果皂苷V提取物目标流份；所述步骤(5)中，将11-O-罗汉果皂苷V提取物目标流份进行减压浓缩，干燥，得11-O-罗汉果皂苷V提取物。
9.如权利要求6所述的一种赛门苷I提取物在治疗高尿酸血症上的用途。
10.如权利要求7所述的一种罗汉果甜苷V提取物在治疗高尿酸血症上的用途。
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