CN108558645B - 从栀子中提取藏红花素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从栀子中提取藏红花素的方法。从栀子中提取藏红花素的方法：用含酶的酸性水溶液对栀子进行浸提，得到浸提液；所述浸提的温度为30‑60℃，酸性水溶液的pH值为3.0～6.5，所述酶为纤维素酶和果胶酶，酸性水溶液中纤维素酶和果胶酶的浓度分别为1％～3％、1％～3％，酶解时间为1h以内；将料液比调至1:20‑40，温度调至50‑70℃，提取1‑2h，将提取液浓缩至膏状，用大孔吸附树脂吸附然后用水洗脱至流出液澄清，然后用乙醇或乙醇‑水混合液进行洗脱，收集洗脱液。本发明对藏红花素的提取率提高了50％，又减少使用有机溶剂使用量；同时相比水提法，本发明提取周期短，效率高。
Description
技术领域
本发明涉及药品与保健食品领域，尤其是涉及从栀子中提取藏红花素的方法。
背景技术
栀子，见于《神农内经》，别名，黄栀子、山栀，是龙胆目茜草科栀子属植物栀子的果实。栀子的果实是传统的中药，属于卫生部颁布的第1批药食两用的资源，据《本草纲目》记载，栀子性苦寒、无毒、具有护肝、利胆、降压、止血、消肿等作用。现代药理学研究表明，在中医临床常用于治疗黄疸型肝炎、扭挫伤、高血压、糖尿病等症。
栀子果实其化学成分较为复杂，达100多种，从栀子数植物中分离鉴定的化合物有环烯醚萜苷、黄酮类、有机酸酯类、多糖类、醛类等。
栀子中富含藏花红素，藏红花素对多种癌细胞均有明显抑制作用，且在与其他的抗癌药物配合治疗过程中，可降低抗癌药顺铂等毒副作用，改善疗效。目前对于藏红花素抑癌机制的研究表明，其有多种可能的作用通路，其中细胞凋亡路径得到了较多的研究支持。
近年来从栀子提取藏红花素的生产工艺有很多，目前国内外大多数水提法或有机溶剂法提取，结合大孔树脂法精制的工艺路线。有机溶剂浸提法需要大量的浸提溶剂，生产成本高，回收率低，容易造成活性物质结构的改变和活性的下降。所以工业上多采用水提法提取藏红花素，而采用水提法提取藏红花素提取率低，提取周期长。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从栀子中提取藏红花素的方法，所述的方法避免使用有机溶剂浸提，更加环保，而且获得了较高的提取率。
为了实现以上目的，本发明提供了以下技术方案：
从栀子中提取藏红花素的方法，包括下列步骤：
用含酶的酸性水溶液对栀子进行浸提，得到浸提液；所述浸提的温度为30～60℃，所述酸性水溶液的pH值为3.0～6.5，所述酶为纤维素酶和果胶酶，所述酸性水溶液中纤维素酶和果胶酶的浓度分别为1％～3％、1％～3％，酶解时间为1h以内；
所述浸提为：将料液比调至1:20-40，温度调至50-70℃，提取1-2h；
将所述浸提液浓缩至膏状，用大孔吸附树脂吸附，然后用水洗脱至流出液澄清，然后用乙醇或乙醇-水混合液进行洗脱，收集洗脱液，浓缩洗脱液，再纯化，得到藏红花素。
本发明主要采用酶解法使栀子中的藏红花素充分释放出来，并溶解于水中，既能提高藏红花素的提取率，又降低有机溶剂的使用，使工艺环保化；同时相比水提法，本发明的方法提取周期短，效率高。
本发明对藏红花素的提取率可达到2.53％以上。
本发明中的酸性水溶液指任意的酸性水溶液，只要pH值为3～6.5内的值即可，例如pH3、pH3.5、pH4、pH4.5、pH 5、pH 5.5、pH 6或pH 6.5等。在该酸性条件下酶活性高，反应速率快，且藏红花素在水中的溶解度高。
本发明的浸提温度可以为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃等。
本发明中纤维素酶的浓度分别为1％～3％之间的任意值，例如1％、1.3％、1.5％、1.7％、2％、2.2％、2.5％、2.7％、3％等。
本发明中果胶酶的浓度分别为1％～3％之间的任意值，例如1％、1.3％、1.5％、1.7％、2％、2.2％、2.5％、2.7％、3％等。
本发明中酶的时间分别为1h以内的任意值，例如0.25h、0.50h、0.75h、1.0h等。
本发明中料液比分别为1：20-40之间的任意值，例如1:20、1:25、1:30、1:35、1:40。
本发明中提取温度分别为50-70℃之间的任意值，例如50℃、55℃、60℃、65℃、70℃。
本发明中提取时间分别为1-2h之间的任意值，例如1.0h、1.25h、1.50h、1.75h、2.0h。
本发明中，大孔吸附树脂利用极性原理提取醇溶性成分，具有原料成本低、操作条件温和、可扩大化生产等优点。用大孔吸附树脂吸附所述浸提液时，以吸附饱和为限，一般当所收集的流出液为上柱液和树脂柱体积的总和时，吸附饱和，停止上柱，此时静止吸附一段时间，时间为1h、2h、3h和4h均可，视综合效益而定。
以上方法还可以从以下方面进一步改进，例如：
优选地，所述纯化的方法为硅胶层析法，并采用乙酸乙酯-乙醇-水的混合液等度洗脱或梯度洗脱。
将乙酸乙酯、乙醇和水三种极性不同的溶剂混合在一起，可以使杂质与藏红花素都有合适的分配系数，从而提高分离度，即藏红花素的纯度。
优选地，所述乙酸乙酯-乙醇-水的混合液中乙酸乙酯、乙醇和水的体积比为8∶2～3∶1。
优选地，所述梯度洗脱时，所述乙酸乙酯-乙醇-水的混合液起点体积比为8∶2∶1，终点体积比为8∶3∶1。
梯度洗脱可以提高柱效，进一步提高藏红花素的纯度。
优选地，所述乙醇-水混合液中乙醇的体积比为40％～70％，优选60％～70％。
本发明洗脱藏红花素时用乙醇或乙醇-水混合液均可，由于40％～70％的乙醇-水混合液的洗脱速度快且藏红花素及其相近的醇溶性成分的流出率高，因此，建议采用该比例，具体应用时可采用40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％的乙醇-水混合液，以上比例均指溶液中乙醇的体积比。
优选地，所述大孔吸附树脂为非极性大孔树脂。
优选地，所述大孔吸附树脂的孔径为8～14nm，优选9～10nm。
优选地，所述大孔吸附树脂为HPD-100树脂、HPD-300树脂、D-101树脂、X-5树脂或H103树脂，优选D-101树脂。
优选地，所述用乙醇或乙醇-水混合液进行洗脱时的洗脱速度为2～3BV/H。
该洗脱速度可以达到藏红花素纯度高而溶剂用量少的目的，具体的洗脱速度可采用2～3BV/H区间的任意值，例如2BV/H、2.2BV/H、2.4BV/H、2.5BV/H、2.7BV/H或3BV/H等。
优选地，所述浓缩洗脱液为：在60～80℃下将其减压浓缩至膏状。
通过浓缩除去水分，降低纯化的工作量，提高生产效率。
优选地，所述酸性水溶液为盐酸水溶液、柠檬酸水溶液或乙酸水溶液。
优选地，所述浸提时的料液质量比为1:20～25。
优选地，在浸提之前对栀子做预处理，例如挑选、清理、粉碎、过筛等。
优选地，所述硅胶层析时，洗脱速度为6～7BV/H，例如，6BV/H、6.2BV/H、6.4BV/H、6.5BV/H、6.7BV/H或7BV/H等。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
(1)提取率高：本发明的提取率高达2.53％以上；
(2)藏红花素纯度高：通过优化纯化的方法和溶剂浓度、洗脱速度等工艺条件提高了藏红花素的纯度；
(3)更环保：浸提时不采用有机溶剂。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
1、酶法提取：栀子粉碎后，过100目筛子，加入20倍水溶液，分别加入1％的纤维素酶和1％果胶酶，用盐酸调节pH至3，在55℃进行酶解1h，调节料液比为1:30，在70℃下提取2h，重复提取三次，合并各次的提取液。
2、减压浓缩：将滤液在70℃下减压蒸馏浓缩至膏状。
3、大孔树脂分离：将浓缩膏状加入已经经过活化处理的D101树脂中，上柱速度为6BV/H，当所收集的流出液为上柱液和树脂柱体积的总和时，停止上柱，静止吸附3h。
4、水洗除杂：以纯水清洗树脂柱，洗脱速度为6BV/H，当流出液从浑浊变为澄清是，停止水洗，水洗可除去吸附在树脂表面的水溶性物质。
5、醇洗：用60％的乙醇洗脱树脂柱，洗脱速度控制在2BV/H，将树脂柱吸附得到的藏花红素洗脱出来。
6、浓缩：将滤液在70℃下减压蒸馏浓缩至膏状。
7、硅胶层析精制：将浓缩液加入硅胶层中，上柱速度为6BV/H，洗脱流动相:起点V(乙酸乙酯)∶V(乙醇)∶V(水)＝8∶2∶1，终点V(乙酸乙酯)∶V(乙醇)∶V(水)＝8∶3∶1，进行梯度洗脱制取藏红花素。经检测，藏花色素的纯度达95％，提取率为2.50％。
实施例2
与实施例1的区别在于硅胶层析时的洗脱方式不同，具体如下：
1、酶法提取：栀子粉碎后，过100目筛子，加入20倍水溶液，分别加入1％的纤维素酶和1％果胶酶，用盐酸调节pH至3，在55℃进行酶解1h，调节料液比为1:35，在60℃下提取1h，重复提取三次，合并各次的提取液。
2、减压浓缩：将滤液在70℃下减压蒸馏浓缩至膏状。
3、大孔树脂分离：将浓缩膏状加入已经经过活化处理的D101树脂中，上柱速度为6BV/H，当所收集的流出液为上柱液和树脂柱体积的总和时，停止上柱，静止吸附3h。
4、水洗除杂：以纯水清洗树脂柱，洗脱速度为6BV/H，当流出液从浑浊变为澄清是，停止水洗，水洗可除去吸附在树脂表面的水溶性物质。
5、醇洗：用60％的乙醇洗脱树脂柱，洗脱速度控制在2BV/H，将树脂柱吸附得到的藏花红素洗脱出来。
6、浓缩：将滤液在70℃下减压蒸馏浓缩至膏状。
7、硅胶层析精制：将浓缩液加入硅胶层中，上柱速度为6BV/H，洗脱流动相:V(乙酸乙酯)∶V(乙醇)∶V(水)＝8∶2∶1，进行等度洗脱制取藏红花素。经检测，藏花色素的纯度达84％，提取率为2.18％。
实施例3
与实施例1的区别在于硅胶层析时的洗脱方式不同，具体如下：
1、酶法提取：栀子粉碎后，过100目筛子，加入20倍水溶液，分别加入1％的纤维素酶和1％果胶酶，用盐酸调节pH至3，在50℃进行酶解0.5h，调节料液比为1:25，在65℃下提取1.5h，重复提取三次，合并各次的提取液。
2、减压浓缩：将滤液在70℃下减压蒸馏浓缩至膏状。
3、大孔树脂分离：将浓缩膏状加入已经经过活化处理的D101树脂中，上柱速度为6BV/H，当所收集的流出液为上柱液和树脂柱体积的总和时，停止上柱，静止吸附3h。
4、水洗除杂：以纯水清洗树脂柱，洗脱速度为6BV/H，当流出液从浑浊变为澄清是，停止水洗，水洗可除去吸附在树脂表面的水溶性物质。
5、醇洗：用60％的乙醇洗脱树脂柱，洗脱速度控制在2BV/H，将树脂柱吸附得到的藏花红素洗脱出来。
6、浓缩：将滤液在70℃下减压蒸馏浓缩至膏状。
7、硅胶层析精制：将浓缩液加入硅胶层中，上柱速度为6BV/H，洗脱流动相:V(乙酸乙酯)∶V(乙醇)∶V(水)＝8∶3∶1，进行等度洗脱制取藏红花素。经检测，藏花色素的纯度达83％，提取率为2.32％。
实施例4
与实施例1的区别在于硅胶层析时的洗脱方式不同，具体如下：
1、酶法提取：栀子粉碎后，过100目筛子，加入20倍水溶液，分别加入1％的纤维素酶和1％果胶酶，用盐酸调节pH至3，在60℃进行酶解1.0h，调节料液比为1:20，在50℃下提取1.5h，重复提取三次，合并各次的提取液。
2、减压浓缩：将滤液在70℃下减压蒸馏浓缩至膏状。
3、大孔树脂分离：将浓缩膏状加入已经经过活化处理的D101树脂中，上柱速度为6BV/H，当所收集的流出液为上柱液和树脂柱体积的总和时，停止上柱，静止吸附3h。
4、水洗除杂：以纯水清洗树脂柱，洗脱速度为6BV/H，当流出液从浑浊变为澄清是，停止水洗，水洗可除去吸附在树脂表面的水溶性物质。
5、醇洗：用60％的乙醇洗脱树脂柱，洗脱速度控制在2BV/H，将树脂柱吸附得到的藏花红素洗脱出来。
6、浓缩：将滤液在70℃下减压蒸馏浓缩至膏状。
7、硅胶层析精制：将浓缩液加入硅胶层中，上柱速度为6BV/H，洗脱流动相:起点V(乙酸乙酯)∶V(乙醇)∶V(水)＝8∶2∶1，终点V(乙酸乙酯)∶V(乙醇)∶V(水)＝8∶4∶1，进行梯度洗脱制取藏红花素。经检测，藏花色素的纯度达91％，提取率为2.19％。
实施例5
与实施例1的区别在于大孔吸附时的条件不同，具体如下：
1、酶法提取：栀子粉碎后，过100目筛子，加入20倍水溶液，分别加入1％的纤维素酶和1％果胶酶，用盐酸调节pH至3，在50℃进行酶解1.0h，调节料液比为1:40，在50℃下提取1.0h，重复提取三次，合并各次的提取液。
2、减压浓缩：将滤液在70℃下减压蒸馏浓缩至膏状。
3、大孔树脂分离：将浓缩膏状加入已经经过活化处理的HPD-300树脂中，上柱速度为5BV/H，当所收集的流出液为上柱液和树脂柱体积的总和时，停止上柱，静止吸附3h。
4、水洗除杂：以纯水清洗树脂柱，洗脱速度为5BV/H，当流出液从浑浊变为澄清是，停止水洗，水洗可除去吸附在树脂表面的水溶性物质。
5、醇洗：用40％的乙醇洗脱树脂柱，洗脱速度控制在3BV/H，将树脂柱吸附得到的藏花红素洗脱出来。
6、浓缩：将滤液在70℃下减压蒸馏浓缩至膏状。
7、硅胶层析精制：将浓缩液加入硅胶层中，上柱速度为7BV/H，洗脱流动相:起点V(乙酸乙酯)∶V(乙醇)∶V(水)＝8∶2∶1，终点V(乙酸乙酯)∶V(乙醇)∶V(水)＝8∶3∶1，进行梯度洗脱制取藏红花素。经检测，藏花色素的纯度达96％，提取率为2.32％。
实施例6
与实施例1的区别在于大孔吸附时的条件不同，具体如下：
1、酶法前处理：栀子粉碎后，过100目筛子，加入20倍水溶液，分别加入1％的纤维素酶和1％果胶酶，用盐酸调节pH至3，在50℃进行酶解1.0h，调节料液比为1:30，在70℃下提取2.0h，重复提取三次，合并各次的提取液。
2、减压浓缩：将滤液在70℃下减压蒸馏浓缩至膏状。
3、大孔树脂分离：将浓缩膏状加入已经经过活化处理的X-5树脂中，上柱速度为5BV/H，当所收集的流出液为上柱液和树脂柱体积的总和时，停止上柱，静止吸附3h。
4、水洗除杂：以纯水清洗树脂柱，洗脱速度为5BV/H，当流出液从浑浊变为澄清是，停止水洗，水洗可除去吸附在树脂表面的水溶性物质。
5、醇洗：用70％的乙醇洗脱树脂柱，洗脱速度控制在3BV/H，将树脂柱吸附得到的藏花红素洗脱出来。
6、浓缩：将滤液在70℃下减压蒸馏浓缩至膏状。
7、硅胶层析精制：将浓缩液加入硅胶层中，上柱速度为7BV/H，洗脱流动相:起点V(乙酸乙酯)∶V(乙醇)∶V(水)＝8∶2∶1，终点V(乙酸乙酯)∶V(乙醇)∶V(水)＝8∶3∶1，进行梯度洗脱制取藏红花素。经检测，藏花色素的纯度达96％，提取率为·2.46％。
实施例7
与实施例1的区别在于酶解的反应条件不同，具体如下：
1、酶法提取：栀子粉碎后，过100目筛子，加入25倍水溶液，pH值为6.5，分别加入3％的纤维素酶和3％果胶酶，用盐酸调节pH至6.0，在55℃进行酶解1.0h，调节料液比为1:30，在70℃下提取2.0h，重复提取三次，合并各次的提取液。
2、减压浓缩：将滤液在70℃下减压蒸馏浓缩至膏状。
3、大孔树脂分离：将浓缩膏状加入已经经过活化处理的D101树脂中，上柱速度为6BV/H，当所收集的流出液为上柱液和树脂柱体积的总和时，停止上柱，静止吸附3h。
4、水洗除杂：以纯水清洗树脂柱，洗脱速度为6BV/H，当流出液从浑浊变为澄清是，停止水洗，水洗可除去吸附在树脂表面的水溶性物质。
5、醇洗：用60％的乙醇洗脱树脂柱，洗脱速度控制在2BV/H，将树脂柱吸附得到的藏花红素洗脱出来。
6、浓缩：将滤液在70℃下减压蒸馏浓缩至膏状。
7、硅胶层析精制：将浓缩液加入硅胶层中，上柱速度为6BV/H，洗脱流动相:起点V(乙酸乙酯)∶V(乙醇)∶V(水)＝8∶2∶1，终点V(乙酸乙酯)∶V(乙醇)∶V(水)＝8∶3∶1，进行梯度洗脱制取藏红花素。经检测，藏花色素的纯度达96％，提取率为2.40％。
对比例1
1、酶法提取：栀子粉碎后，过100目筛子，加入30倍水溶液，在60℃进行前处理6h，重复提取三次，合并各次的提取液。
2、减压浓缩：将滤液在70℃下减压蒸馏浓缩至膏状。
3、大孔树脂分离：将浓缩膏状加入已经经过活化处理的D101树脂中，上柱速度为6BV/H，当所收集的流出液为上柱液和树脂柱体积的总和时，停止上柱，静止吸附3h。
4、水洗除杂：以纯水清洗树脂柱，洗脱速度为6BV/H，当流出液从浑浊变为澄清是，停止水洗，水洗可除去吸附在树脂表面的水溶性物质。
5、醇洗：用60％的乙醇洗脱树脂柱，洗脱速度控制在2BV/H，将树脂柱吸附得到的藏花红素洗脱出来。
6、浓缩：将滤液在70℃下减压蒸馏浓缩至膏状。
7、硅胶层析精制：将浓缩液加入硅胶层中，上柱速度为6BV/H，洗脱流动相:V(乙酸乙酯)∶V(乙醇)∶V(水)＝8∶2∶1，进行等度洗脱制取藏红花素。经检测，藏花色素的纯度达90％，提取率为1.50％。
对比实施例和对比例的结果可知，本发明的提取率至少提高了50％，浸提时间缩短了一半以上。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (13)
1.从栀子中提取藏红花素的方法，其特征在于，包括下列步骤：
用含酶的酸性水溶液对栀子进行酶解和浸提，料液比调至1:20-40，得到浸提液；
所述酶解的温度为30～60℃，所述酸性水溶液的pH值为3.0～6.5，所述酶为纤维素酶和果胶酶，所述酸性水溶液中纤维素酶和果胶酶的浓度分别为1％～3％、1％～3％，酶解时间为1h以内；
所述浸提为：将料液比调至1:20-40，温度调至50-70℃，提取1-2h；
将所述浸提液浓缩至膏状，用大孔吸附树脂吸附，然后用水洗脱至流出液澄清，然后用乙醇或乙醇-水混合液进行洗脱，收集洗脱液，浓缩洗脱液，再纯化，得到藏红花素；
所述纯化的方法为硅胶层析法，并采用乙酸乙酯-乙醇-水的混合液梯度洗脱；
所述梯度洗脱时，所述乙酸乙酯-乙醇-水的混合液起点体积比为8∶2∶1，终点体积比为8∶3∶1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酸性水溶液的pH值为4～6。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乙醇-水混合液中乙醇的体积比为40％～70％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乙醇-水混合液中乙醇的体积比为60％～70％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂为非极性大孔树脂。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂的孔径为8～14nm。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂的孔径为9～10nm。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂为HPD-100树脂、HPD-300树脂、D-101树脂、X-5树脂或H-103树脂。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂为D-101树脂。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述用乙醇或乙醇-水混合液进行洗脱时的洗脱速度为2～3BV/H。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述浓缩洗脱液为：在60～80℃下将其浓缩至膏状。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酸性水溶液为盐酸水溶液、柠檬酸水溶液或乙酸水溶液。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述浸提时的料液质量比为1:20～25。
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