CN113041279B - 一种从罗汉果花中分离出有效成分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从罗汉果花中分离出有效成分的方法。该方法包括：S1、将罗汉果花用水蒸汽提取，得到湿润花和第一提取液；S2、将所述湿润花以乙醇为溶剂在25~65℃下提取得到第二提取液和第一滤渣，将所述第二提取液浓缩、固液分离得到第三提取液和湿渣；S3、将所述第三提取液浓缩、静置得到晶体和结晶母液；S4、将所述结晶母液上大孔吸附树脂层析柱，依次用酸溶液、碱溶液和醇溶液洗脱分别得到酸洗脱液、碱洗脱液和醇洗脱液。本发明的方法实现了罗汉果花的高效综合分离。

Description

一种从罗汉果花中分离出有效成分的方法

技术领域

本发明涉及物功能成分提取分离纯化领域，尤其涉及一种从罗汉果花中分离出有效成分的方法。

背景技术

罗汉果Siraitia grosvenorii（曾被称为Momordica grosvenorii），又名光果木鳖，是藤本植物葫芦科藏瓜族中罗汉果属的果实。主要产于中国广西桂林，湖南永州、邵阳、怀化，广东等地。

罗汉果花单性，雌雄异株，花序柄、花柄、萼片、花瓣均被柔毛及腺毛，雄花腋生，5～10朵排列成总状；苞片1，矩圆形；萼5浅裂，裂片具线状尖尾；花瓣5，淡黄色，微带红色，卵形，长约2厘米，先端具尖尾；雄蕊3，花药分离。1枚1室，其余2枚2室。雌花单生于叶腋或2-5朵集生总花梗顶端，萼管先端5裂，花瓣5，倒卵形，先端短尖，子房下位，与萼管合生，花柱3，柱头2歧，有退化雄蕊3。瓠果圆形、长圆形或倒卵形，幼时深棕红色，成熟时青色，被茸毛。罗汉果花期为6～8月。

罗汉果花中含有多酚、酚酸、黄酮醇、黄烷醇、多糖、挥发油、生物碱等成分，其中关于其黄酮类成分研究较多，而系统地将罗汉果花资源进行合理有效利用研究则很少。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：如何实现罗汉果花中各组分的高效分离。

为解决上述技术问题，本发明提出了一种从罗汉果花中分离出有效成分的方法。

本发明提出一种从罗汉果花中分离出有效成分的方法，包括以下步骤：

S1、将罗汉果花用水蒸汽提取，得到湿润花和第一提取液；

S2、将所述湿润花以乙醇为溶剂在25~65℃下提取得到第二提取液和第一滤渣，将所述第二提取液浓缩、固液分离得到第三提取液和湿渣；

S3、将所述第三提取液浓缩、静置得到晶体和结晶母液；

S4、将所述结晶母液上大孔吸附树脂层析柱，依次用酸溶液、碱溶液和醇溶液洗脱分别得到酸洗脱液、碱洗脱液和醇洗脱液。

进一步地，在步骤S2中，将所述湿润花与体积浓度为50~95%的乙醇为溶剂按照质量比1:3~1:5，在25~65℃下提取30~60min得到所述第二提取液和所述第一滤渣。

进一步地，还包括将步骤S2得到的所述第一滤渣以水为溶剂进行提取，其中，所述第一滤渣与水的用量比为1:1~1:5，提取温度为80~100℃，提取时间为30~120min；之后过滤得到第四提取液和第二滤渣。

进一步地，还包括将所述第四提取液浓缩至固形物含量为30-40%，加入蛋白酶进行酶解反应，之后灭活，之后加入醇溶液析出多糖沉淀。

进一步地，还包括将所述第二滤渣干燥至水分含量为30-35%，之后加入营养成分和酵母发酵得到罗汉果花渣饲料原料。

进一步地，在步骤S1中，采用所述水蒸汽提取具体包括：在压力为0.5MPa以下的水蒸汽对罗汉果花提取0.1-3h。

进一步地，在步骤S1中，还包括将所述第一提取液油水分离得出精油和水相溶液；所述油水分离包括：将得到的第一提取液冷却至5-40℃，之后用油水分离器对所述第一提取液进行分离，油相过填有脱色剂的层析柱，脱色剂重量为油重量0.5-2%。

进一步地，在步骤S1中，还包括将所述水相溶液浓缩至罗汉果花原料重量的2%-20%，得罗汉果花露。

进一步地，在步骤S4中，还包括将所述碱洗脱液调节pH值至酸性或者中性后，浓缩并进行结晶与重结晶得到罗汉果黄素；和/或，还包括将所述酸洗脱液调节pH至碱性，之后采用有机溶剂萃取得到生物碱。

进一步地，在步骤S4中，还包括将所述醇洗脱液用硅酸盐脱色去除杂质，收集流出液，回收醇至水相，之后调节pH值至弱酸性或中性，浓缩干燥得三萜皂苷。

本发明与现有技术对比的有益效果包括：首先将罗汉果花用水蒸汽提取，均匀地破坏了罗汉果花的细胞结构，有利于后续罗汉果花黄酮的提取，得到可用于分离出精油和纯露的第一提取液，之后将湿润花以乙醇为溶剂在25~65℃下回流提取得到第二提取液，该温度较低，花中的有效组分可进入到第二提取液且结构不被破坏，将第二提取液浓缩固液分离得到第三提取液和湿渣，大部分多酚进入到湿渣中，之后将第三提取液浓缩、静置得到晶体和结晶母液，晶体为山奈酚，继续将结晶母液上大孔吸附树脂层析柱，依次按照特定的顺序先后用酸溶液、碱溶液和醇溶液洗脱分别得到生物碱的酸洗脱液、含有山奈总苷的碱洗脱液和含有三萜皂苷的醇洗脱液，通过本发明提出的方法从罗汉果花中依次分离出含有精油和花露的第一提取液，多酚，山奈酚，含有生物碱的酸洗脱液，含有山奈总苷的碱洗脱液和含有三萜皂苷的醇洗脱液，实现了罗汉果花的高效综合提取，而且山奈酚的提取率高达93.95%。

另外经过其他步骤处理后，得到的多酚提取率高达97.75%，生物碱提取率高达91.91%，罗汉果黄素含量高达98.65%，三萜皂苷提取率高达95.42%，多糖提取率高达94.56%。

具体实施方式

本具体实施方式提出一种从罗汉果花中分离出有效成分的方法，包括以下步骤：

S1、将罗汉果花用水蒸汽提取，具体地，在压力为0.5MPa以下的水蒸汽对罗汉果花提取0.1-3h得到湿润花和第一提取液；将所述第一提取液冷却至5-40℃，之后用油水分离器对第一提取液进行分离得到精油和水相溶液，将水相用反渗透膜或者纳滤膜进行浓缩至罗汉果花原料重量的2%-20%，得罗汉果花露；具体地，将所述第一提取液过填有脱色剂的层析柱，脱色剂重量为油重量0.5-2%得到精油和纯露；所述脱色剂为无水硫酸钠、氧化铝、氯化钠、氯化钙、活性炭、氧化镁、碳酸镁、氧化硅、硅胶、凹凸棒粘土、活性白土、高岭土、膨润土、硅藻土和珍珠岩中的一种或者多种；进一步地，所述脱色剂优选质量比为1:1:1的无水硫酸钠、氧化镁和活性炭；

S2、将所述湿润花与体积浓度为50~95%的乙醇为溶剂按照质量比1:3~1:5，在25~65℃下回流提取30~60min得到第二提取液和第一滤渣，将所述第二提取液浓缩、固液分离得到第三提取液和湿渣，将湿渣送真空干燥，得含多酚的棕色固体；将所述第一滤渣以水为溶剂采用连续逆流法进行提取，其中，所述第一滤渣与水的用量比为1:1~1:5，提取温度为80~100℃，提取时间为30~120min；之后过滤得到第四提取液和第二滤渣；之后将所述第四提取液浓缩至固形物含量为30-40%后，加入蛋白酶进行酶解反应，之后灭活，之后加入醇溶液析出多糖沉淀；之后将所述第二滤渣干燥至水分含量为30-35%，之后加入营养成分和酵母发酵得到罗汉果花渣饲料原料；优选地，保持渣水分含量在20～40%，按照花渣湿重5-20%加入营养成分，按照花渣湿重0.03～0.1%加入酵母，密闭条件下自然发酵4-8天，将发酵后的花渣使用锅炉尾气作为热源，真空干燥6～24h，破碎机粉碎过40目筛网，得罗汉果花渣饲料原料；营养成分优选为为玉米淀粉；

所述固液分离过程为第二提取液过碟片式离心机，离心液用陶瓷膜进行过滤，陶瓷膜截留液重新过碟片式离心机，离心液再送陶瓷膜过滤，如此往复，收集碟片式离心机的第一次离心渣，2-3倍水充分搅拌混合后再次送碟片离心机，离心液送陶瓷膜过滤，收集第二次离心渣，第一离心渣和第二离心渣即为湿渣；

S3、将所述第三提取液浓缩、静置得到晶体和结晶母液；收集固液分离所得第三提取液浓缩至相对密度为1.10-1.25，冷却至0-10℃，结晶5-24h，过滤后晶体重结晶，然后真空干燥得山奈酚。优选地，山奈酚重结晶溶剂为含有0.1-0.3%碳酸氢钠的20-40%乙醇水溶液；

S4、将所述结晶母液上大孔吸附树脂层析柱、依次用酸溶液、碱溶液和醇溶液洗脱分别得到酸洗脱液、碱洗脱液和醇洗脱液；所述酸溶液洗脱为用体积浓度为0.1-1%的酸洗脱，收集酸洗脱后的酸洗脱液，所述酸为盐酸、硫酸或者草酸一种或者多种；所述碱洗脱为用体积浓度为0.1-1%的碱洗脱，所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或者碳酸钾中的一种或者多种；所述醇溶液洗脱为用体积浓度为30-65%的乙醇溶液洗脱；将所述酸洗脱液调节pH至碱性，之后采用与酸洗脱液不互溶的有机溶剂萃取得到生物碱，收集有机相浓缩干燥得罗汉果花生物碱；将所述碱洗脱液调节pH值至酸性或者中性，浓缩后结晶与重结晶，过滤晶体干燥成罗汉果黄素，优选地，罗汉果黄素重结晶溶剂为含有0.02-0.1%碳酸氢钠的5-25%乙醇水溶液，过滤所得母液干燥得山奈总苷，即以山奈酚为苷元的一类黄酮苷；将所述醇洗脱液用硅酸盐脱色去除杂质，收集流出液，回收醇至水相，之后调节pH值至弱酸性或中性，浓缩干燥得三萜皂苷，优选地，醇洗脱液使用三硅酸镁层析柱脱色。在一些优选的实施方式中，酸溶液、碱溶液洗柱后都会用1-10BV的水洗，这些水洗液会选择性地合并入酸溶液洗脱液中或者碱溶液洗脱液中或者直接排废。

所述大孔吸附树脂优选为骨架结构含有酰胺、亚砜、氰基等以上一种或多种基团的苯乙烯-二乙烯苯型树脂和骨架结构含有酰胺、亚砜、氰基等一种或者多种基团的聚丙烯酸型树脂。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

实施例1

本实施例提出一种从罗汉果花中分离出有效成分的方法，包括以下步骤：

S1、取罗汉果干燥雄花10kg，用水蒸汽发生器对罗汉果花进行提取，蒸汽压力0.25MPa，提取时间为0.5h，蒸汽用冷凝水冷却至5-10℃，用油水分离器对油水混合物（即第一提取液）进行分离，得黄色精油和水相溶液，油相过填有2g脱色剂的塑料小柱，其中脱色剂的组成为硅藻土，无水硫酸钠，氧化镁，活性炭的混合物，得236g浅黄色罗汉果花精油，油水分离器分离所得53L水相溶液用500道尔顿的纳滤膜进行浓缩至1L，得罗汉果花露；

S2、将水蒸汽提取过后所得的罗汉果花（即湿润花）90%乙醇，30℃提取1h，提取2次。过滤得第二提取液和第一滤渣，将第二提取液减压真空浓缩回收乙醇至水相后，板框夹滤纸过滤，得第三提取液和湿渣，所得湿渣送真空干燥，-0.08至-0.09MPa，40-50℃条件下真空干燥4h，得棕色固体，粉碎过80目筛得537g棕色粉末，经UV分光法检测为多酚含量为32.40%。板框过滤所得澄清液体（即第三提取液），浓缩至相对密度为1.1左右，冷却至3-5℃，放置10h，有晶体析出，过滤，晶体用少量冷水淋洗，滤液与冷水淋洗液合并成结晶母液待用，湿晶体用5倍湿晶重量的0.1%碳酸氢钠的20%乙醇水溶液加热溶解，冷却至3-5℃，放置4h，析出金黄色晶体，过滤后真空干燥得153g黄色粉末，经HPLC检测，山奈酚含量为98.35%；

S3、步骤S2的结晶母液上10L大孔吸附树脂层析柱，树脂型号LX-38，上柱流速2BV/h，上柱完成后，2BV水洗柱，流出液排污，然后用4BV0.2%硫酸水溶液洗层析柱，收集酸洗脱液，再用水洗2BV，水洗液排废，接着用4BV0.1%氢氧化钠水溶液洗层析柱，收集碱洗脱液，再用水洗2BV，水洗液排废，最后用2BV40%乙醇水溶液洗脱。以上洗脱流速皆为2BV/h；

S4、收集的酸洗液用氢氧化钠水溶液调节至pH为10，用三氯甲烷萃取水溶液3次，第一次40L，第二次20L，第三次10L。合并三氯甲烷，加入少量水后，减压浓缩至12波美左右，干燥得59g黄色粉末，经过UV分光光度法检测生物碱含量为82.70%；

S5、收集的碱洗脱液用盐酸水溶液调节pH值至7后，减压浓缩至15波美，冷却至1-5℃，放置20h，有晶体析出，过滤，湿晶体用3倍湿晶重量的0.05%碳酸氢钠的10%乙醇水溶液加热溶解，冷却至1-5℃，放置10h，析出金黄色晶体，过滤后真空干燥得71g金黄色粉末，经过HPLC检测罗汉果黄素含量为98.4%。罗汉果黄素结晶过程中过滤产生的母液，减压浓缩至12波美度，喷雾干燥得352g黄色山奈总苷粉末，经过UV分光光度法检测罗汉果山奈总苷含量为52.72%。

S6、收集的醇解吸液，过装有100g三硅酸镁的层析柱脱色，收集流出液，减压浓缩至15波美度，喷雾干燥得517g浅黄色粉末，经过UV分光光度法检测三萜皂苷含量为73.90%；

S7、提取黄酮后的罗汉果花（即第一滤渣），与水在料液比1:4，提取温度100℃的条件提取1h，过滤得第四提取液和第二滤渣，将第四提取液浓缩至5波美度，加入菠萝蛋白酶，柠檬酸调节pH至4，45℃条件下酶解5h后，加热至沸腾，保持0.5h对菠萝蛋白酶进行灭活，减压浓缩灭活液至18波美度，加入3倍量95%乙醇搅拌，多糖析出后过滤，用适量95%乙醇淋洗后，真空干燥，粉碎过80目筛得211g类白色多糖粉末，经过UV分光光度法检测多糖含量含量为81.73%；

S8、将罗汉果花渣（即第二滤渣）榨除部分水分，保持渣中水分在30-35%左右，加入花渣湿重5%的玉米粉，加入花渣湿重0.03%的酵母，密闭条件下自然发酵7天，将发酵后的花渣使用锅炉尾气作为热源，真空干燥12h，破碎机粉碎过40目筛网，得罗汉果花渣饲料原料6.1KG。

实施例2

本实施例提出一种从罗汉果花中分离出有效成分的方法，包括以下步骤：

S1、取罗汉果新鲜雄花50kg，用水蒸汽发生器产生的蒸汽对罗汉果花进行提取，蒸汽压力0.1MPa，提取时间为1h。蒸气用冷凝水冷却至10-15℃，用油水分离器对油水混合物进行分离，得黄色精油，油相过填有10g脱色剂的塑料小柱，其中脱色剂的组成为无水硫酸钠：氧化镁：活性炭=1:1:1的混合物，得294g浅黄色罗汉果花精油。油水分离器分离所得170L水相用500道尔顿的纳滤膜进行浓缩至1L，得罗汉果花露。

S2、将水蒸汽提取过后所得的罗汉果花用逆流提取法提取，提取溶剂80%乙醇，提取温度25℃，料液比为1:2，提取时间0.5h，过滤得第二提取液和第一滤渣。所得第二提取液减压真空浓缩回收乙醇至水相后，蝶式离心机4500r/min离心，离心液过50nm孔径的陶瓷膜，陶瓷膜截留液与蝶式离心机排渣液收集水稀释后再次过蝶式离心机，然后再过陶瓷膜，收集二次蝶式离心渣与二次陶瓷膜截留液合并后送真空干燥，-0.08至-0.09MPa，45-55℃条件下真空干燥10h，得棕色固体，粉碎过80目筛得521g棕色粉末，经UV分光法检测为多酚含量为43.50%。陶瓷膜过膜液浓缩至相对密度为1.15左右，冷却至0-4℃，放置5h，有晶体析出，过滤，晶体用少量冷水淋洗，滤液与冷水淋洗液合并成结晶母液待用，湿晶体用10倍湿晶重量的0.15%碳酸氢钠的40%乙醇水溶液加热溶解，冷却至3-5℃，放置8h，析出黄色晶体，过滤后真空干燥得135g黄色粉末，经HPLC检测，山奈酚含量为98.19%。

S3、将步骤S2的结晶母液上15L大孔吸附树脂层析柱，树脂型号LX-91，上柱流速2BV/h，上柱完成后，2BV水洗柱，流出液排污，然后用2BV0.5%盐酸水溶液洗层析柱，收集盐酸洗脱液，再用水洗2BV，水洗液排废，接着用2BV0.15%氢氧化钾水溶液洗层析柱，收集氢氧化钾洗脱液，再用2BV水洗，水洗液排废，最后用2BV50%乙醇水溶液解吸。以上洗脱流速皆为2BV/h。

S4、收集的盐酸洗液用氢氧化钠水溶液调节至pH为8，用二氯甲烷萃取水溶液3次，第一次40L，第二次20L，第三次10L。合并二氯甲烷，加入少量水后，减压浓缩至12波美左右，干燥得72g黄色粉末，经过UV分光光度法检测生物碱含量为80.42%。

S5、收集的氢氧化钾洗脱液用盐酸水溶液调节pH值至6后，减压浓缩至14波美，冷却至1-5℃，放置15h，有晶体析出，过滤，湿晶体用2倍湿晶重量的0.02%碳酸氢钠的15%乙醇水溶液加热溶解，冷却至1-5℃，放置10h，析出金黄色晶体，过滤后真空干燥得83g金黄色粉末，经过HPLC检测罗汉果黄素含量为98.65%。罗汉果黄素结晶过程中过滤产生的母液，减压浓缩至13波美度，喷雾干燥得425g金黄色山奈总苷粉末，经过UV分光光度法检测罗汉果山奈总苷含量为50.40%。

S6、收集的50%乙醇解吸液，过装有100g凹凸棒黏土的层析柱脱色，收集流出液，收集流出液，减压浓缩至15波美度，喷雾干燥得579g浅黄色粉末，经过UV分光光度法检测三萜皂苷含量为71.83%。

S7、提取黄酮后的罗汉果花（即第一滤渣），在料液比1:5，提取温度90℃的条件提取1h，过滤后的提取液浓缩至5波美度，加入菠萝蛋白酶与黑曲霉蛋白酶的混合物，柠檬酸调节pH至4，45℃条件下酶解2h后，加热至沸腾，保持0.5h对酶进行灭活，减压浓缩灭活液至20波美度，加入4倍量95%乙醇搅拌，多糖析出后过滤，用适量95%乙醇淋洗后，真空干燥，粉碎过80目筛得类204g白色多糖粉末，经过UV分光光度法检测多糖含量含量为90.68%。

S8、将罗汉果花渣榨除部分水分，保持渣中水分在30-35%左右，加入花渣湿重5%的甘蔗蜜，加入花渣湿重0.1%的酵母，密闭条件下自然发酵5天，将发酵后的花渣使用锅炉尾气作为热源，真空干燥24h，破碎机粉碎过40目筛网，得罗汉果花渣饲料原料5.4KG。

实施例3

本实施例提出一种从罗汉果花中分离出有效成分的方法，包括以下步骤：

S1、取罗汉果新鲜雄花50kg，用水蒸汽发生器产生的蒸汽对罗汉果花进行提取，蒸汽压力0.2MPa，提取时间为1.5h。蒸汽用冷凝水冷却至20-25℃，用油水分离器对油水混合物进行分离，得黄色精油，油相过填有15g脱色剂的塑料小柱，其中脱色剂的组成为无水硫酸钠与活性白土的混合物，得280g浅黄色罗汉果花精油。油水分离器分离所得260L水相用500道尔顿的纳滤膜进行浓缩至1L,得罗汉果花露。

S2、将水蒸汽提取过后所得的罗汉果花用逆流提取法提取，提取溶剂90%乙醇，提取温度40℃，料液比为1:3，提取时间40分钟。提取液减压真空浓缩回收乙醇至水相后，板框夹滤纸过滤，滤渣送真空干燥，-0.08至-0.09MPa，55-60℃条件下真空干燥8h，得棕色固体，粉碎过80目筛得506g棕色粉末，经UV分光法检测为多酚含量为45.40%。板框滤液浓缩至相对密度为1.2左右，冷却至5-10℃，放置15h，有晶体析出，过滤，晶体用少量冷水淋洗，滤液与冷水淋洗液合并成结晶母液待用，湿晶体用10倍湿晶重量的20%乙醇加热溶解，冷却至3-5℃，放置2h，析出金黄色晶体，过滤后真空干燥得149g黄色粉末，经HPLC检测，山奈酚含量为95.21%。

S3、将步骤S2的结晶母液上10L大孔吸附树脂层析柱，树脂型号D101C，上柱流速2BV/h，上柱完成后，然后3BV1%草酸水溶液洗层析柱，收集草酸洗脱液，接着用3BV1%碳酸钾水溶液洗层析柱，收集碳酸钾洗脱液，最后用1.5BV65%乙醇水溶液解吸。以上洗脱流速皆为2BV/h。

S4、收集的草酸洗脱液用氢氧化钙水溶液调节至pH为9，用乙酸乙酯萃取水溶液3次，第一次40L，第二次20L，第三次10L。合并乙酸乙酯，加入少量水后，减压浓缩至12波美左右，干燥得62g黄色粉末，经过UV分光光度法检测生物碱含量为72.92%。

S5、收集的碳酸钾洗脱液用盐酸水溶液调节pH值至5后，减压浓缩至12波美，冷却至1-5℃，放置18h，有晶体析出，过滤，湿晶体用3倍湿晶重量的0.08%碳酸氢钠的5%乙醇水溶液加热溶解，冷却至1-5℃，放置10h，析出金黄色晶体，过滤后真空干燥得65g金黄色粉末，经过HPLC检测罗汉果黄素含量为98.22%。罗汉果黄素结晶过程中过滤产生的母液，减压浓缩至15波美度，喷雾干燥得417g金黄色山奈总苷粉末，经过UV分光光度法检测罗汉果山奈总苷含量为49.72%。

S6、收集的65%乙醇解吸液，过装有100g凹凸棒黏土的层析柱脱色，收集流出液，收集流出液，减压浓缩至18波美度，喷雾干燥得672g浅黄色粉末，经过UV分光光度法检测三萜皂苷含量为63.90%。

S7、提取黄酮后的罗汉果花，在料液比1:5，提取2次，提取温度85℃，提取2h，提取液过100nm孔径的陶瓷膜，过膜液过10万道尔顿的超滤膜，过膜液减压浓缩至18波美，加入6倍量90%乙醇搅拌，多糖析出后过滤，用适量90%乙醇淋洗后，真空干燥，粉碎过80目筛得类104g白色多糖粉末，经过UV分光光度法检测多糖含量含量为91.75%。

S8、将罗汉果花渣榨除部分水分，保持渣中水分在35-40%左右，加入花渣湿重20%的淀粉，加入花渣湿重0.08%的酵母，密闭条件下自然发酵8天，将发酵后的花渣使用锅炉尾气作为热源，真空干燥24h，破碎机粉碎过40目筛网，得罗汉果花渣饲料原料7.1KG。

对比例1

T1、取罗汉果干花10kg，用40L95%乙醇，40℃提取1h，提取2次。过滤得提取液，减压真空浓缩回收乙醇至水相后，板框夹滤纸过滤，所得湿渣送真空干燥，-0.08至-0.09MPa，40-50℃条件下真空干燥10h，得棕色黏糊状固体，无法干燥成粉末。板框过滤所得澄清液体，浓缩至相对密度为1.1左右，冷却至3-5℃，放置10h，有晶体析出，过滤，晶体用少量冷水淋洗，滤液与冷水淋洗液合并成结晶母液待用，湿晶体用15倍湿晶重量的20%乙醇水溶液加热溶解，冷却至3-5℃，放置4h，析出黄色晶体，过滤后真空干燥得148g黄色粉末，经HPLC检测，山奈酚含量为90.41%。

T2、步骤1的结晶母液上15L大孔吸附树脂层析柱，树脂型号LX-91，上柱流速2BV/h，上柱完成后，2BV水洗柱，流出液排污，然后2BV0.15%氢氧化钾水溶液洗层析柱，收集氢氧化钾洗脱液，再用2BV水洗，水洗液排废，接着用2BV0.5%盐酸水溶液洗层析柱，收集盐酸洗脱液，再用水洗2BV，水洗液排废，最后用2BV50%乙醇水溶液解吸。以上洗脱流速皆为2BV/h。

T3、收集的氢氧化钾洗脱液用盐酸水溶液调节pH值至6后，减压浓缩至15波美，冷却至1-5℃，放置20h，无晶体析出，喷雾干燥得624g金黄色山奈总苷粉末，经过UV分光光度法检测罗汉果山奈总苷含量为26.72%。

T4、收集的盐酸洗液用氢氧化钠水溶液调节至pH为8，用二氯甲烷萃取水溶液3次，第一次40L，第二次20L，第三次10L。合并二氯甲烷，加入少量水后，减压浓缩至浸膏，干燥得18g黄色粉末，经过UV分光光度法检测生物碱含量为89.64%。

T5、收集的50%乙醇解吸液，过装有100g凹凸棒黏土的层析柱脱色，收集流出液，减压浓缩至15波美度，喷雾干燥得452g浅黄色粉末，经过UV分光光度法检测三萜皂苷含量为77.63%。

对比例2

T1、取罗汉果新鲜雄花50kg，用90%乙醇，80℃提取3h，料液比1:5，提取2次。过滤得提取液，减压真空浓缩回收乙醇至水相后，板框夹滤纸过滤，所得湿渣送真空干燥，-0.08至-0.09MPa，40-50℃条件下真空干燥10h，得棕色黏糊状固体，无法干燥成粉末，经UV分光法检测为多酚含量为32.4%。板框过滤所得澄清液体，浓缩至相对密度为1.1左右，冷却至3-5℃，放置10h，有晶体析出，过滤，晶体用少量冷水淋洗，滤液与冷水淋洗液合并成结晶母液待用，湿晶体用15倍湿晶重量的20%乙醇水溶液加热溶解，冷却至3-5℃，放置4h，析出黄色晶体，过滤后真空干燥得154g黄色粉末，经HPLC检测，山奈酚含量为86.15%。

T2、步骤1的结晶母液上15L大孔吸附树脂层析柱，树脂型号LX-91，上柱流速2BV/h，上柱完成后，2BV水洗柱，流出液排污，然后用2BV50%乙醇水溶液解吸，接着用2BV0.5%盐酸水溶液洗层析柱，收集盐酸洗脱液，再用水洗2BV，水洗液排废，最后2BV0.15%氢氧化钾水溶液洗层析柱，收集氢氧化钾洗脱液，再用2BV水洗，水洗液排废。以上洗脱流速皆为2BV/h。

T3、收集的50%乙醇解吸液，过装有100g凹凸棒黏土的层析柱脱色，收集流出液，减压浓缩至15波美度，喷雾干燥得1054g黄色粉末，经过UV分光光度法检测三萜皂苷含量为35.54%。

T4、收集的盐酸洗液用氢氧化钠水溶液调节至pH为8，用二氯甲烷萃取水溶液3次，第一次40L，第二次20L，第三次10L。合并二氯甲烷，加入少量水后，减压浓缩至浸膏，浸膏重量太少，可以忽略。

T5、收集的氢氧化钾洗脱液用盐酸水溶液调节pH值至6后，减压浓缩成浸膏，浸膏重量太少，可以忽略。

表1 实施例1-3及对比例1-2的各提取物的含量及提取率

实施例1与对比例1用的干花原料，其余用的鲜花原料。

对比例1和2均没有进行实施例中的S1步骤的水蒸汽提取，且将实施例中S3步骤中酸溶液洗，碱溶液洗，醇溶液洗的先后顺序进行了调整，也没进行S5与S6步骤。

从表1可看出，由于对比例没有进行S1步骤的水蒸汽处理，导致罗汉果花多酚无法干燥成粉末，难以形成产品，因此少了罗汉果花精油、罗汉果花露、罗汉果花多酚3个产品。没进行实施例的S5步骤因此又少了罗汉果黄素、山奈总苷2个产品。

实施例中都进行S1步骤的高温高压的水蒸汽处理，均匀地破坏了罗汉果花的细胞结构，有利于提高后续的罗汉果花黄酮提取速度快，因此用时少，溶剂用量少，提取温度低，效率高。对比例1无水蒸汽处理，同样的提取条件下，所得山奈酚、三萜皂苷的提取率比实施例少了10-15%左右，对比例2通过提高提取温度，拉长提取时间，增加提取溶剂用量后才能达到实施例的提取率，

对比例1将实施例中的S3步骤中酸溶液洗，碱溶液洗的工序调换了下位置，导致部分生物碱类成分进入了碱洗液中，虽然后续酸洗液中的生物碱含量有所提升，但提取率从70-90%降低到了29%，碱洗液中由于杂质高，罗汉果黄素不能析晶出来，因此又少了1个产品，杂质成分都进入到了山奈总苷中，导致山奈总苷的含量低。

对比例2将实施例中S3步骤中醇溶液洗放到了酸溶液洗，碱溶液洗工序的前面，导致酸溶液洗，碱溶液洗的组分绝大部分被醇溶液洗脱下来，生物碱、罗汉果黄素、山奈总苷都进入到了三萜皂苷组分中，导致少了3个产品，三萜皂苷的含量也降低到了35%。

可见，没有经过水蒸汽提取和/或没有按照本发明提出的洗脱顺序进行洗脱不利于罗汉果花的综合提取利用。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

Claims (10)

1.一种从罗汉果花中分离出有效成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将罗汉果花用水蒸汽提取，得到湿润花和第一提取液；

S2、将所述湿润花以乙醇为溶剂在25~65℃下提取得到第二提取液和第一滤渣，将所述第二提取液浓缩、固液分离得到第三提取液和湿渣；

S3、将所述第三提取液浓缩、静置得到晶体和结晶母液；

S4、将所述结晶母液上大孔吸附树脂层析柱，依次用酸溶液、碱溶液和醇溶液洗脱分别得到酸洗脱液、碱洗脱液和醇洗脱液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，将所述湿润花与体积浓度为50~95%的乙醇为溶剂按照质量比1:3~1:5，在25~65℃下提取30~60min得到所述第二提取液和所述第一滤渣。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括将步骤S2得到的所述第一滤渣以水为溶剂进行提取，其中，所述第一滤渣与水的用量比为1:1~1:5，提取温度为80~100℃，提取时间为30~120min；之后过滤得到第四提取液和第二滤渣。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括将所述第四提取液浓缩至固形物含量为30-40%后，加入蛋白酶进行酶解反应，之后灭活，之后加入醇溶液析出多糖沉淀。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括将所述第二滤渣干燥至水分含量为30-35%，之后加入营养成分和酵母发酵得到罗汉果花渣饲料原料。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S1中，采用所述水蒸汽提取具体包括：在压力为0.5MPa以下的水蒸汽对罗汉果花提取0.1-3h。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S1中，还包括将所述第一提取液油水分离得出精油和水相溶液；所述油水分离包括：将得到的第一提取液冷却至5-40℃，之后用油水分离器对所述第一提取液进行分离，油相过填有脱色剂的层析柱，脱色剂重量为油重量0.5-2%。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤S1中，还包括将所述水相溶液浓缩至罗汉果花原料重量的2%-20%，得罗汉果花露。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S4中，还包括将所述碱洗脱液调节pH值至酸性或者中性后，浓缩并进行结晶与重结晶得到罗汉果黄素；和/或，还包括将所述酸洗脱液调节pH至碱性，之后采用有机溶剂萃取得到生物碱。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S4中，还包括将所述醇洗脱液用硅酸盐脱色去除杂质，收集流出液，回收醇至水相，之后调节pH值至弱酸性或中性，浓缩干燥得三萜皂苷。