CN102327324B - 一种桑叶总碱提取物及其制备方法和其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种桑叶总碱提取物及其制备方法,具体步骤为:1)将桑叶经粉碎后通过溶剂提取,得桑叶提取液;2)所得桑叶提取液浓缩至相对密度为1.02-1.20后,先加石灰乳,摇均,再加入乙醇沉淀,离心分离,取上清液;3)上清液调节pH至2.0-5.0,除沉淀后通过大孔型阳离子交换树脂或凝胶型阳离子交换树脂吸附,水洗去除杂质后,用质量浓度为0.20%-5.0%氨水洗脱树脂,收集氨水洗脱液,浓缩干燥,即得。该制备方法延长了阳离子交换树脂的使用周期,节约了生产成本。本发明还公开了该方法所制得的桑叶总生物碱提取物在制备治疗或预防糖尿病及其并发症的药物或保健品或食品中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种从桑科桑属植物的叶中提取的桑叶总碱提取物及其制备方法,以及桑叶总碱提取物用于制备治疗或预防糖尿病及其并发症的药物或保键品或食品中的应用。
背景技术
桑科桑属植物桑叶(Morus alba L.)是传统入药的部位,民间入药中常用包括鸡桑Morus australis Poir.、蒙桑M.mongolica Schnoid.、山桑M.bombyciskoidz.、川桑M.notabilis Schne.、华桑M.cathayana Hensl.等。国内外的大量研究表明,桑叶具有很好的降血糖功能,其降血糖的机理研究表明主要与其中氮杂糖类生物碱物质密切相关。
桑叶中主要含有黄酮及其衍生物、香豆精衍生物、三萜类、生物碱类等成份。国内外已有研究表明,桑叶水提物具有降血糖活性,并在心血管系统、血液系统、神经系统、泌尿系统和消化系统等方面具有显著的药理作用:桑叶复方浓缩液对链脲霉素所致的血糖升高及葡萄糖性高血糖都有较好的降血糖作用,桑叶的水浸液对实验性糖尿病大鼠有明显的降血糖作用;桑叶粉饲料可使自然发病且症状类似成人型糖尿病和糖尿病并发症的大鼠空腹血糖值明显降低;桑叶提取物能阻止四氧嘧啶高血糖小鼠从饮食中摄入的淀粉和葡萄糖的高血糖反应;用50%桑属植物甲醇提取物可在大鼠小肠管实验中迅速抑制蔗糖吸收,并显示对二糖类分解酶活性有抑制作用;桑叶水提部分可作用于淀粉消化的最后阶段,对二糖酶(麦芽糖酶和乳糖酶)有明显的抑制作用,可能成为控制餐后血糖的有效手段;从桑叶中分离出6种氮杂糖化合物,观察其对STZ引起的糖尿病小鼠的疗效发现,不同成分通过增加胰岛素的释放和抑制2-糖苷酶活性的途径来起到降低血糖值;以1-脱氧野尻霉素(DNJ)为主的氮杂糖类生物碱是降血糖的活性成分。
现有技术中已有多种方法富集桑叶中的生物碱成分,例如,二次离子交换树脂制备法(CN01113191.8)、大孔树脂和离子交换树脂二次过柱制备法(CN200510122356.3)、酸洗离子交换树脂制备法(CN200710098454.7)等。尽管这些方法可提高桑叶中DNJ的相对含量,但存在工序复杂,要求反复过柱,脱盐处理,生产周期长,成本相对较高等缺陷。
桑叶多羟基生物碱类物质分子量在150-300道尔顿左右,水溶性极好,目前的脱盐方法难以适用于桑叶多羟基生物碱类物质的脱盐:①离子交换法要重新过柱,工序复杂,影响收得率,且难以去除Na+;②电渗析或反渗透法主要用于从水中除盐,不适用于从水溶性好的极性桑叶生物碱分子中除盐;③蛋白质脱盐用透析法或凝胶法,适用于较大分子量物质的脱盐,其工业化成本高,不能用于桑叶生物碱。
尽管现有技术中已采用离子交换树脂法进行桑叶总生物碱的提取,而片面地纯化1-脱氧野尻霉素(DNJ)则容易忽视树脂的使用成本,如CN200710067498.3将酸化液浓缩后直接采用离子交换树脂柱层析进行分离,虽然节约了絮凝剂的成本,但是严重地缩短了离子交换树脂柱的使用周期而增大生产成本。因此,需要提供一种操作简单,适于工业化操作、成本低,且具有良好治疗或预防糖尿病及其并发症的药物或保键品或食品中应用前景的桑叶总生物碱的方法。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明提供了一种操作简单,适于工业化操作、成本低,且具有良好治疗或预防糖尿病及其并发症的药物或保键品或食品中应用前景的桑叶总生物碱的方法。
本发明的技术方案是:一种桑叶总生物碱提取物的制备方法,包括以下步骤:
1)将桑科桑属植物的叶经粉碎后通过溶剂提取,得桑叶提取液;
所述溶剂选自水、质量浓度为40-80%的乙醇水溶液、含0.001N-0.1N酸的水、含0.001N-0.1N酸的乙醇的任一种;
2)所得桑叶提取液浓缩至相对密度为1.02-1.20后,先加入质量浓度为5%-50%的石灰乳,摇均,再加入乙醇沉淀,使乙醇的终浓度为40%-80%,离心分离,取上清液;
3)上清液调节pH至2.0-5.0,除沉淀后通过大孔型阳离子交换树脂或凝胶型阳离子交换树脂吸附,水洗去除杂质后,用质量浓度为0.20%-5.0%氨水洗脱树脂,收集氨水洗脱液,浓缩干燥,即得。
所述桑科桑属植物选自白桑、鸡桑、蒙桑、山桑、川桑、华桑的任一种或其组合,优选为白桑。
步骤1)所述溶剂提取方法选自回流提取法、冷浸提取法、温浸提取法、渗漉提取法、超声提取法和逆流循环提取法中的任意一种,优选为回流提取法。
步骤2)所述石灰乳的质量浓度优选为15%-30%。
步骤2)提取液浓缩后的相对密度优选为1.05-1.15。
步骤2)提取液浓缩后,加入石灰乳和乙醇沉淀,所述乙醇的终浓度优选为50%-60%。
步骤3)所述pH值优选为3.0-4.0,优选所用的酸为硫酸。
步骤3)所述的阳离子交换树脂选自盐型、氢型或钠型的任一种或其组合,优选为氢型。
步骤3)所述的阳离子交换树脂选自大孔型阳离子交换树脂或凝胶型阳离子交换树脂,类型优选D001型阳离子交换树脂,001×4型凝胶型树脂、001×7型凝胶型树脂、001×12型凝胶型树脂的任一种或其组合,最优选为001×7型凝胶型树脂。
步骤(3)步所述的洗脱用氨水的质量浓度优选为0.25%-3.0%,最优选为1.5%-2.5%。
本发明还提供了一种桑叶总生物碱提取物,由上述桑叶总生物碱提取物的制备方法所制得。
本发明还提供了所述桑叶总生物碱提取物在制备治疗或预防糖尿病及其并发症的药物或保健品或食品中的应用。
下面对本发明做进一步的解释和说明:
除非另有说明,本发明所述的百分比均为质量百分比。
本发明的优选技术方案中,所述的生物总碱含有1-脱氧野尻霉素、1,N-甲基-1-脱氧野尻霉素、2-O-β-D-吡喃半乳糖基-1-脱氧野尻霉素、Fagomine、1,4-二脱氧-1,4-亚胺基-D-阿拉伯糖醇的任一种或其组合。
本发明首次采用石硫醇法结合离子交换树脂提取桑叶中的生物碱类,不仅其提取物得率可达1.2-2.5%,生物总碱含量50-90%,其中1-脱氧野尻霉素(DNJ)含量为3-30%,且通过石硫醇法的制备步骤,延长了离子交换树脂的使用寿命,节约了工业化大生产中的成本,有效保持了桑叶在治疗或预防糖尿病及其并发症中的活性。
本发明对所述生物总碱的降糖作用进行了系统的试验比较和优选,结果说明其对糖苷酶有较好的抑制作用,可以用于制备治疗或预防糖尿病及其并发症的药物或保键品或食品中的应用。
本发明的桑叶生物碱类成分的测定方法包括:
(一)总生物碱测定
精密称定样品约0.3g,加50%乙醇20ml溶解,再加水40ml,加0.1g醋酸铅,摇匀,静置20分钟后,滤过,滤液蒸干,残渣加0.1mol/L的硫酸溶液20ml溶解,滤过,滤液加在强酸性阳离子交换树脂柱上,以水洗200ml,弃去水液,再以2mol/L氨溶液200ml洗脱,收集洗脱液,蒸干。残渣精密加无水冰醋酸50ml使溶解,作为供试品溶液。取2份,每份精密量取20ml,加结晶紫指示液1滴,用0.05mol/L的高氯酸滴定液缓缓滴定至蓝色,并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml高氯酸滴定液(0.1mol/L)相当于16.3mg的1-脱氧野尻霉素(化学式C6H13NO4)。
(二)1-脱氧野尻霉素(DNJ)
照高效液相色谱法(中国药典2005年版附录VI D)测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈为流动相A,以0.1%醋酸溶液为流动相B,按下表进行梯度洗脱,色谱图记录时间25分钟。检测波长为265nm;理论板数按1-脱氧野尻霉素峰计算应不低于2000。
时间(分钟) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0~25 | 25 | 75 |
25~40 | 50 | 50 |
对照品溶液的制备精密称取1-脱氧野尻霉素对照品适量,加50%甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液,摇匀。精密量取上述溶液1ml,置25ml量瓶中,加入0.4mol/L的硼酸-氯化钾缓冲液(pH=8.5)1ml,再加入10mmol/L的FMOC-Cl乙腈溶液2ml,室温下超声处理(功率250W,频率20kHz)20分钟,加0.1%的醋酸溶液至刻度,摇匀,即得。
供试品溶液的制备精密称定样品约0.2g,用0.05mol/L盐酸超声处理2次(功率500W,频率20KHz),每次40ml,20分钟,过滤,合并滤液,滤液离心10分钟(转速为3500转/分),上清液转移至100ml量瓶中,加0.05mol/L盐酸稀释至刻度。精密量取上述溶液1ml,置10ml量瓶中,加入0.4mol/L的硼酸-氯化钾缓冲液(pH=8.5)1ml,再加入10mmol/L的FMOC-Cl乙腈溶液2ml,室温下超声处理(功率250W,频率20kHz)20分钟,加0.1%的醋酸溶液至刻度,摇匀,即得。
测定法
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
与现有技术相比,本发明的优势在于:
(1)本发明采用石硫醇法结合阳离子交换树脂提取桑叶生物碱,延长了阳离子交换树脂的使用周期,节约了生产成本;
(2)本发明采用石硫醇法结合阳离子交换树脂提取桑叶生物碱,有效地保留了生物碱有效成分,显著提高桑叶总碱提取物用于治疗或预防糖尿病及其并发症的疗效。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1桑叶总生物碱提取物的制备
取桑叶碎片1kg,分别加入12倍、10倍量水回流提取2次,分别提取1.5小时和1.0小时,滤过,合并滤液,减压浓缩相对密度1.10,加入20%石灰乳200ml,搅匀,加入乙醇使其含醇40%,离心除去沉淀,上清液加稀硫酸调节pH至3,离心除去沉淀,酸醇液通过1L的001×7阳离子交换树脂,收集醇液回收乙醇,继续用水洗至流出液近无色,用2.0%氨水8L洗脱树脂柱,收集氨水洗脱液,减压浓缩,干燥,得到桑叶总碱提取物18.5g,无水滴定法测定其中生物总碱含量为72.6%,DNJ含量为6.86%。
实施例2桑叶总生物碱提取物的制备
取桑叶碎片1kg,分别加入12倍、10倍量乙醇回流提取2次,每次0.5小时,滤过,合并滤液,减压浓缩相对密度1.15,加入10%石灰乳300ml,搅匀,加入乙醇使含醇60%,离心除去沉淀,上清液加稀硫酸调节pH至4,离心除去沉淀,酸醇液通过1L的001×4阳离子交换树脂,用2L水洗脱树脂柱,收集醇液回收乙醇;用1.0%氨水10L洗脱树脂柱,收集氨水洗脱液,减压浓缩,干燥,得到桑叶总碱提取物21.5g,无水滴定法测定其中生物总碱含量为68.5%,DNJ含量为8.54%。
实施例3桑叶总生物碱提取物的制备
取桑叶碎片1kg,分别加入12、10倍量0.01N酸的水回流提取2次,每次0.5小时,滤过,合并滤液,减压浓缩相对密度1.05,加入40%石灰乳120ml搅匀,加入乙醇使含醇50%,离心除去沉淀,上清液加稀硫酸调节pH至3,离心除去沉淀,酸醇液通过1L的001×12阳离子交换树脂,用2L水洗脱树脂柱,收集醇液回收乙醇;用1.5%氨水6L洗脱树脂柱,收集氨水洗脱液,减压浓缩,干燥,得到桑叶总碱提取物14.1g,无水滴定法测定其中生物总碱含量为75.8%,DNJ含量为10.4%。
实施例4桑叶总生物碱提取物的制备
取桑叶碎片1kg,分别加入10倍量0.01N酸的乙醇回流提取2次,分别提取1.5小时和1.0小时,滤过,合并滤液,减压浓缩相对密度1.2,加入50%石灰乳120ml,搅匀,加入乙醇使含醇50%,离心除去沉淀,上清液加稀硫酸调节pH至3,离心除去沉淀,酸醇液通过1L的001×12阳离子交换树脂,用2L水洗脱树脂柱,收集醇液回收乙醇;用0.5%氨水6L洗脱树脂柱,收集氨水洗脱液,减压浓缩,干燥,得到桑叶总碱提取物15.8g,无水滴定法测定其中生物总碱含量为80.2%,DNJ含量为7.22%。
实施例5桑叶总生物碱提取物的制备
取桑叶碎片1kg,分别加入12、10倍量60%乙醇回流提取2次,每次0.5小时,滤过,合并滤液,减压浓缩相对密度1.05,加入20%石灰乳200ml,搅匀,加入乙醇使含醇60%,离心除去沉淀,上清液加稀硫酸调节pH至3,离心除去沉淀,酸醇液通过1L的001×7阳离子交换树脂,用2L水洗脱树脂柱,收集醇液回收乙醇;用2.5%氨水6L洗脱树脂柱,收集氨水洗脱液,减压浓缩,干燥,得到桑叶总碱提取物13.5g,无水滴定法测定其中生物总碱含量为88.3%,DNJ含量为13.6%。
实施例6桑叶总生物碱提取物不同制备方法的比较研究
采用同一批次的桑叶比较研究不同提取方法及其效果,结果见表1和表2。
表1桑叶总生物碱提取物不同制备方法的比较研究
按照下述方法测试树脂的使用寿命:按表1所述制备方法制备上树脂柱之前的五种药液,均为5L(相当于5KG药材),首先分段取药液上样至200ml的001×7阳离子交换树脂,检测流出液中DNJ,待有DNJ泄漏时即为该样品初次上样的最大上样量,继续用水和相应的洗脱液洗脱,然后再生树脂柱;按照最大上样量的60%继续上样洗脱和再生,同时检测上样流出液中DNJ,直至有DNJ泄漏,即为判断该树脂吸附能力下降明显,用该树脂上样次数作为使用寿命参考值。
表2不同柱前处理方法对含量及柱效的影响
说明:样品上样后在树脂柱上产生明显沉淀的,在吸附洗脱后需将树脂倒出漂洗再进行树脂的酸碱再生。
由表1-表2可见,本发明所采用的石硫醇法,与其他方法相比,不仅能够加大离子交换树脂吸附桑叶提取浓缩液的量,且能够有效延长了交换树脂的寿命,并有效地保留桑叶中的生物碱有效成分。
实施例7桑叶总碱提取物在治疗或预防糖尿病及其并发症中的药效比较研究
1、动物与药品
动物:选用Wistar大鼠小肠糖苷酶。
对照药品:拜糖苹,德国拜尔药业;桑叶总碱提取物,自制。
2、酶液的提取和活力测定
取大鼠上端小肠20g,加4℃预冷的pH6.8磷酸缓冲液60ml,匀浆,4℃、4000rpm离心15min,取上清液分装入试管中,-20℃冷冻备用。取酶液0.1ml加pH6.8磷酸缓冲液0.7ml,37℃水浴10min,加入0.25mol/L蔗糖0.1ml反应20min后,加入1ml 0.1mol/L Na2CO3终止反应。酶法测定葡萄糖浓度,将在37℃、pH6.8的条件下,1L溶液中每分钟生成1μmol葡萄糖定义为一个酶活力单位。
3、阳性对照药品及样品的配制
将拜糖平研碎,加入蒸馏水,过滤,配置成1.25g/L浓度作为阳性对照药溶液。将各种不同方法制备的桑叶总碱提取物加水溶解配制成均含0.5g生药/ml的样品溶液。
4、糖苷酶抑制率的测定
分别取阳性对照药溶液、样品溶液各0.1、0.2、0.4、0.8ml(空白对照组加入相同体积的蒸馏水),加pH6.8磷酸缓冲液0.6ml,加酶液0.1ml,37℃水浴10min,其他方法同酶活力测定。
观察样品和对照药对糖苷酶的抑制作用,抑制率=(酶活空白-酶活药物)/酶活空白。结果见表3。
表3不同桑叶总碱提取物和对照药的糖苷酶抑制率(%)
由表3可知,本发明石硫醇法结合阳离子交换树脂所提取得到的桑叶总碱提取物能够有效地延长阳离子交换树指的使用寿命,且其对糖苷酶的抑制率明显优于现有技术。
Claims (8)
1.一种桑叶总生物碱提取物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)将桑科桑属植物的叶经粉碎后通过溶剂提取,得桑叶提取液;
所述溶剂选自水、质量浓度为40%-80%的乙醇水溶液、含0.001N-0.1N酸的水或含0.001N-0.1N酸的乙醇中的任意一种;
2)所得桑叶提取液浓缩至相对密度为1.02-1.20后,先加入质量浓度为5%-50%的石灰乳,摇均,再加入乙醇沉淀,使乙醇的终浓度为50%-60%,离心分离,取上清液;
3)上清液用硫酸调节pH至3.0-4.0,除沉淀后通过大孔型阳离子交换树脂或凝胶型阳离子交换树脂吸附,水洗去除杂质后,用质量浓度为0.20%-5.0%氨水洗脱树脂,收集氨水洗脱液,浓缩干燥,即得。
2.根据权利要求1所述桑叶总生物碱提取物的制备方法,步骤1)所述溶剂提取方法选自回流提取法、冷浸提取法、温浸提取法、渗漉提取法、超声提取法、逆流循环提取法中的任意一种。
3.根据权利要求1所述桑叶总生物碱提取物的制备方法,步骤2)所述石灰乳的质量浓度为15%-30%。
4.根据权利要求1所述桑叶总生物碱提取物的制备方法,步骤2)中所述提取液浓缩至相对密度为1.05-1.15。
5.根据权利要求1所述桑叶总生物碱提取物的制备方法,步骤3)所述的大孔型阳离子交换树脂或凝胶型阳离子交换树脂的类型为D001型阳离子交换树脂、001×4型凝胶型树脂、001×7型凝胶型树脂、001×12型凝胶型树脂中的任一种或几种。
6.根据权利要求1所述桑叶总生物碱提取物的制备方法,步骤(3)步所述的洗脱用氨水的质量浓度为1.5%-2.5%。
7.一种桑叶总生物碱提取物,其特征在于,由权利要求1-6之一所述桑叶总生物碱提取物的制备方法所制得。
8.权利要求7所述桑叶总生物碱提取物在制备治疗或预防糖尿病及其并发症的药物或保健品或食品中的应用。
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杨梅等.高效液相色谱法测定桑叶中1-脱氧野尻霉素的含量.《武警医学》.2007,第18卷(第02期), |
高效液相色谱法测定桑叶中1-脱氧野尻霉素的含量;杨梅等;《武警医学》;20070228;第18卷(第02期);121-122 * |
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---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
TR01 | Transfer of patent right | ||
TR01 | Transfer of patent right |
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