CN104530253A - 一种黄精多糖的柱层析分离方法和提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄精多糖的柱层析分离方法和提取方法。本发明的黄精多糖的柱层析分离方法，其包括如下步骤：将黄精多糖用大孔吸附树脂进行柱层析分离，即可；其中，上样量为每100～200毫升柱体积上样10毫升，且上样的药液中黄精多糖的浓度为3.5～4.5毫克/毫升；洗脱剂为质量百分数为10～50％的乙醇水溶液；洗脱剂的用量为每100～200毫升柱体积用洗脱剂80～150毫升；洗脱流速为1～2毫升/分钟。本发明的黄精多糖的柱层析分离方法和提取方法操作简单，重复性好，产物纯度高，所分离的黄精多糖种类多样，并不局限低聚糖，更适合工业化生产。

Description

一种黄精多糖的柱层析分离方法和提取方法

技术领域

本发明具体的涉及一种黄精多糖的柱层析分离方法和提取方法。

背景技术

黄精是临床常用中药之一，其主要活性成分是黄精多糖。黄精多糖对人体发挥着多种有益的生理调节作用：其具有的抗肿瘤作用，可以有效地抑制肿瘤发生与发展；具有的抗衰老作用，可作为人体一种有效的抗衰老制剂使用；具有的免疫调节作用，可以有效地增强免疫细胞的免疫功能；此外还具有抗菌、抗动脉粥样硬化、调节血糖血脂等作用(何才通，李文.黄精多糖药理功效研究进展.新中医,2014,46(3):196-199)。因此，黄精多糖对人体具有多种免疫活性，对改善机体免疫功能，调节免疫细胞微环境，增加外周血细胞及骨髓造血干细胞数量等方面有着卓越的功效。

文献[黄精低聚糖的分离纯化及结构分析，卫冰，许闽，于雷，杨云，《中成药》，2012年4月，第34卷第4期，694-697页]中，作者采用多次柱层析分离纯化获得黄精低聚糖，用水洗脱，步骤繁琐，增加了成本消耗，且仅分离纯化出了黄精低聚糖(平均分子量为1741Da)，对于黄精中分子量更高的多糖的分离纯化并不适用。

文献[大孔吸附树脂纯化黄精小分子糖的工艺研究，李晓坤，董晶晶，贺海花，杨云，《中国药师》，2011年04期，454-457页]中公开了采用大孔吸附树脂纯化黄精小分子糖的工艺，其中洗脱剂为蒸馏水，但是其纯化的对象仍然是局限于黄精小分子糖，对于黄精中分子量更高的多糖的分离纯化并不适用。

文献[黄精中三萜皂苷和活性多糖的分离与鉴定，王彩霞，江南大学，2008年，硕士学位论文]中公开了采用大孔吸附树脂纯化黄精多糖的工艺，但是其明确记载大孔吸附树脂对多糖不吸附，可用去离子水直接洗脱下来，但是纯化效果较差，作者后续又采用了其他分离方法对多糖进行了进一步的纯化，依然是存在步骤繁琐，增加了成本消耗的缺陷。

虽然上述三篇文献中均采用了水做洗脱剂，在大孔吸附树脂柱上对黄精多糖进行分离和纯化，但是，黄精中的杂质有一大部分会溶解在水中，随着水的洗脱而和多糖一起被洗脱下来，对黄精多糖的纯化是不利的，只能用来粗略的纯化黄精多糖。

因此，本领域亟需开发一种能够利用大孔吸附树脂对黄精多糖进行分离纯化的方法，且该方法适用的多糖分子量范围较宽，不仅能够用来分离低聚糖，更能适用于分离分子量较大的黄精多糖，且纯化、除杂效果更好，使黄精多糖的利用率及纯度均得到提高，更加适合工业化生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中黄精多糖的提取工艺和纯化工艺的产物纯度不高，及仅能提取黄精多糖中的小分子糖(或低聚糖)，种类单一，而不能纯化出多糖分子量范围较宽的黄精多糖，使黄精多糖的利用率低的缺陷，或者由于仅采用水进行洗脱而使除杂、纯化效果较差，往往需联合其他分离方法进行后续的进一步的纯化，步骤繁琐，增加成本消耗等缺陷，而提供了一种黄精多糖的柱层析分离方法和提取方法。本发明的黄精多糖的柱层析分离方法和提取方法操作简单，重复性好，产物纯度高，该方法适用的多糖分子量范围较宽，不仅能够用来分离低聚糖，更能适用于分离分子量较大的黄精多糖，且纯化、除杂效果更好，使黄精多糖的利用率及纯度均得到提高，更加适合工业化生产。

本发明提供了一种黄精多糖的柱层析分离方法，其包括如下步骤：将黄精多糖粗品用大孔吸附树脂进行柱层析分离，即可；其中，上样量为每100～200毫升柱体积上样10毫升，且上样的药液中黄精多糖的浓度为3.5～4.5毫克/毫升；洗脱剂为质量百分数为10～50％的乙醇水溶液；洗脱剂的用量为每100～200毫升柱体积用洗脱剂80～150毫升；洗脱流速为1～2毫升/分钟；所述的大孔吸附树脂的参数如下：粒径为0.3～1.25mm，孔径为13～30nm，树脂骨架为聚苯乙烯-二乙烯苯。

较佳地，所述的大孔吸附树脂为极性大孔吸附树脂和/或非极性大孔吸附树脂。

所述的极性大孔吸附树脂优选NKA-9树脂和/或AB-8树脂。

所述的非极性大孔吸附树脂优选X-5树脂。

所述的上样量优选每150～200毫升柱体积上样10毫升，更优选每150～160毫升柱体积上样10毫升。

所述的上样的药液中黄精多糖的浓度优选3.5～4.0毫克/毫升，更优选3.9～4.0毫克/毫升。

所述的柱层析分离的上样流速优选1～2毫升/分钟；更优选1.5～2毫升/分钟。

所述的柱层析分离在上样后优选还进行静置。所述的静置的时间优选10～14小时，更优选12～14小时。

所述的大孔吸附树脂在进行柱层析分离时，其柱子的长度优选30～100厘米；更优选50～80厘米。

所述的大孔吸附树脂在进行柱层析分离时，柱子的直径优选1～5厘米；更优选2～3厘米。

所述的洗脱剂的种类优选乙醇的质量百分比为20％～50％的乙醇水溶液，更优选乙醇的质量百分比为30％～50％的乙醇水溶液。

所述的洗脱剂的用量优选每100～200毫升柱体积用洗脱剂100～120毫升，更优选每100～200毫升柱体积用洗脱剂110～120毫升。

所述的黄精多糖的柱层析分离方法的装柱的方法优选是用水进行湿法装柱。所述的湿法装柱的水优选超纯水。

所述的装柱在进行前，优选还进行大孔吸附树脂的预处理。所述的预处理优选包括如下步骤：先将大孔吸附树脂用无水乙醇浸泡24～48小时，然后用水进行湿法装柱，然后用无水乙醇冲洗树脂柱，至流出液加两倍体积蒸馏水不产生浑浊时，再用水冲洗树脂柱至无醇味；然后倒出柱中的树脂，10～30℃下真空干燥，即可。

所述的预处理中的水优选超纯水。

较佳地，所述的黄精多糖的柱层析分离方法，还进一步包括所述的黄精多糖粗品的提取方法，其包括如下步骤：将生黄精药材与水混合，加热至沸腾并保持微沸或小火煮沸30～90分钟后，将黄精药材和煎出液分开，然后将分出的黄精药材再与另外的水混合，重复上述加热煮沸并分离黄精药材和煎出液的过程1～3次，合并所有煎出液，浓缩，制得所述的黄精多糖粗品的提取液；然后，醇沉，制得所述的黄精多糖粗品；每次与黄精药材混合的水的质量为所述的生黄精药材的质量的6～14倍。

所述的每次与黄精药材混合的水的质量优选是所述的生黄精药材的质量的7～12倍，更优选是所述的生黄精药材的质量的8～10倍。

所述的保持微沸或小火煮沸的时间优选60～90分钟。

所述的重复上述加热煮沸并分离黄精药材和煎出液的过程的次数优选2～3次，更优选3次。

较佳地，所述的浓缩的标准是将合并后煎出液中的水除去一部分，使浓缩后煎出液中药液比为1:(0.5～1)，更优选为1：1；所述的药液比为“所述的生黄精药材的质量”：“所述的黄精多糖粗品的提取液的体积”，单位为克/毫升。

较佳地，所述的浓缩的方法为煮沸使浓缩的方法；更佳地为大火煮沸使浓缩。

较佳地，所述的“醇沉”的操作为：将所述的黄精多糖粗品的提取液与乙醇的质量百分比为90％～95％的乙醇水溶液混合均匀，形成混合液，所述的混合液中乙醇的质量百分比为75％～85％，在10～35℃的条件下静置12～24小时，然后过滤，制得所述的黄精多糖粗品。

较佳地，所述的混合均匀的方法为搅拌的方法。

较佳地，所述的混合液中乙醇的质量百分比为75％～80％。

本发明还提供了一种黄精多糖粗品的提取方法，其包括如下步骤：将生黄精药材与水混合，加热至沸腾并保持煮沸30～90分钟后，将黄精药材和煎出液分开，然后将分出的黄精药材再与另外的水混合，重复上述加热煮沸并分离黄精药材和煎出液的过程1～3次，合并所有煎出液，浓缩，制得所述的黄精多糖粗品的提取液；然后，醇沉，制得所述的黄精多糖粗品；每次与黄精药材混合的水的质量为所述的生黄精药材的质量的6～14倍。

所述的黄精多糖粗品的提取方法的方法和条件同前所述。

在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明的黄精多糖的柱层析分离方法和提取方法操作简单，重复性好，产物纯度高，该方法适用的多糖分子量范围较宽，不仅能够用来分离低聚糖，更能适用于分离分子量较大的黄精多糖，且纯化、除杂效果更好，使黄精多糖的利用率及纯度均得到提高，更加适合工业化生产。

附图说明

图1为实施例3中黄精多糖的紫外吸收光谱，其中，625nm为黄精多糖的最大吸收波长

图2为实施例3中葡萄糖的标准曲线，曲线方程为y＝0.0057x+0.0264，线性相关系数r＝0.9991，线性范围是横坐标的数值为21.79～108.96μg。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

以下实施例中所述的常温或室温均指环境温度为10～30℃。

以下实施例，均是在常压下进行。

以下实施例中，黄精多糖的纯度是指经过柱层析分离之后所得的产品中，黄精多糖的质量占产品总质量的质量百分比。

实施例1黄精多糖的提取

将1克生黄精药材与8克水混合，加热至沸腾并保持煮沸60分钟后，将黄精药材和煎出液分开，然后将分出的黄精药材再与另外8克的水混合，然后重复上述加热煮沸并分离黄精药材和煎出液的过程2次，合并所有煎出液。

将合并后的煎出液大火煮沸进行浓缩，使药液比为1:1时，停止浓缩。

将浓缩后的药液中添加乙醇的质量百分比为95％的乙醇水溶液，使添加后混合液中乙醇的质量百分比为75％，(加乙醇水溶液时慢加快搅有助于防止共沉淀的发生)，搅拌均匀后，在常温的条件下静置12小时，然后过滤，得沉淀为黄精多糖粗品。

所得沉淀中黄精多糖的纯度为70％。这里黄精多糖的纯度测定的方法是采用实施例5中的方法。

实施例2树脂预处理

取AB-8(极性)、X-5(非极性)以及NKA-9(极性)这3种树脂各2.0克，分别用无水乙醇浸泡24小时，(乙醇的量以能完全浸没树脂为准)，然后用超纯水湿法装柱；用无水乙醇冲洗树脂柱，至流出液加2倍体积蒸馏水不产生浑浊，再用超纯水冲洗树脂柱至无醇味。然后各树脂在室温下真空干燥，备用。

实施例3标准曲线的绘制

1、黄精多糖的最大吸收波长的测定参考文献[Imbety,BourneY,Cambillau C et al,Oligosaccharide Conformation in Protein CarbohydrateComputers,Adv.Biophys,Chem，1993，3：71～117.]或[杨莉,王志华,陶健生等.黄芪中黄芪多糖含量测定方法的比较[J].中国医药工业杂志,2005,36(9):562-563]的方法进行，并得到黄精多糖的紫外吸收光谱，见图1，其中，625nm为最大吸收波长。

本发明中以下实施例中糖的含量的测定均在此波长下进行。

2、葡萄糖标准液的配制

精密称取干燥至恒定的葡萄糖标准品适量，加超纯水定溶于100mL容量瓶中，使其浓度为0.11mg/ml，即可。

3、0.2％硫酸－蒽酮溶液的配制

精密称取蒽酮0.2g，用100ml 95％浓硫酸溶解，慢加快搅，直至蒽酮完全溶解)，即得0.2％蒽酮-浓硫酸溶液，备用。

4、绘制标准曲线

分别精密移取浓度为0.227mg/mL的葡萄糖(单糖)标准液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL于试管中，分别加入纯水至2mL，然后分别精密缓慢加入0.2％蒽酮-浓硫酸溶液4mL，振摇混匀，静止1小时，另以未加葡萄糖的溶液为空白，于625nm波长处测定吸光度A。以A为纵坐标，溶液中葡萄糖质量为横坐标，进行线性回归，得到葡萄糖标准曲线，见图2，该标准曲线的方程为y＝0.0057x+0.026，线性相关系数r＝0.9991，线性范围是溶液中葡萄糖质量为21.79～108.96μg。

本发明中以下实施例中的黄精多糖的含量均在此标准曲线上进行推算。

实施例4黄精多糖的纯化

用NKA-9大孔吸附树脂为填料，先进行实施例2中的预处理，然后将预处理后的树脂2.0g用超纯水进行湿法装柱。柱长度为50cm，柱直径为2cm。

将经过实施例1的方法获得的黄精多糖粗品用超纯水配制成浓度为3.90mg/mL的粗黄精多糖的药液，取其中10mL进行上样，上样流速为2mL/min；上样后静置时间为12小时；然后用洗脱剂为质量百分数为30％的乙醇水溶液进行洗脱；洗脱剂的用量为120mL；洗脱流速为2mL/min。用称重后的干净的玻璃杯收集流出的全部洗脱液。

实施例5黄精多糖含量的测定

将实施例4中收集的洗脱液在水浴锅上进行加热煮干，煮到只剩玻璃杯上沾附的药材固体。称重后减去玻璃杯净重，得黄精多糖质量。

将所述的玻璃杯上沾附的药材固体用100毫升超纯水溶解定容。取其中0.2毫升加超纯水至2mL，精密缓慢加入0.2％蒽酮-浓硫酸溶液4mL，振摇混匀，静止1小时，于625nm波长处测定吸光度，减去不含多糖的0.2％蒽酮-浓硫酸溶液空白样的吸光度，得到黄精多糖的吸光度。在图2的标准曲线上找到对应的多糖的质量。

另取样品和柱子将实施例4的实验操作再重复5次，每次的上样样品是互不相关的，每次的柱子也是互不相关的。

这6次所得产品进行上述的水浴干燥后称量，黄精多糖质量净重分别为33.9mg、33.1mg、34.9mg、33.9mg、33.6mg和32.9mg，分别进行上述的用100毫升超纯水溶解定容后，浓度分别为：0.339mg/ml、0.331mg/ml、0.349mg/ml、0.339mg/ml、0.336mg/ml和0.329mg/ml，分别取各自的0.2ml进行纯度检测，经测定其多糖质量分别为56.38μg、55.19μg、58.21μg、56.64μg、55.98μg及54.83μg；黄精多糖的纯度(质量百分比)分别为83.2％、83.4％、83.4％、83.5％、83.3％及83.3％。这六次的黄精多糖纯度的平均值为83.35％。

可见，本发明的黄精多糖的纯化方法重复性非常好，所得黄精多糖纯度也较高。

Claims (9)

1.一种黄精多糖的柱层析分离方法，其特征在于，其包括如下步骤：将黄精多糖粗品用大孔吸附树脂进行柱层析分离，即可；其中，上样量为每100～200毫升柱体积上样10毫升，且上样的药液中黄精多糖的浓度为3.5～4.5毫克/毫升；洗脱剂为质量百分数为10～50％的乙醇水溶液；洗脱剂的用量为每100～200毫升柱体积用洗脱剂80～150毫升；洗脱流速为1～2毫升/分钟；所述的大孔吸附树脂的参数如下：粒径为0.3～1.25mm，孔径为13～30nm，树脂骨架为聚苯乙烯-二乙烯苯。

2.如权利要求1所述的黄精多糖的柱层析分离方法，其特征在于：

所述的大孔吸附树脂为极性大孔吸附树脂和/或非极性大孔吸附树脂；

和/或，所述的上样量为每150～200毫升柱体积上样10毫升；

和/或，所述的上样的药液中黄精多糖的浓度为3.5～4.0毫克/毫升；

和/或，所述的柱层析分离的上样流速为1～2毫升/分钟；

和/或，所述的柱层析分离在上样后还进行静置；

和/或，所述的大孔吸附树脂在进行柱层析分离时，其柱子的长度为30～100厘米；

和/或，所述的大孔吸附树脂在进行柱层析分离时，柱子的直径为1～5厘米；

和/或，所述的黄精多糖的柱层析分离方法的装柱的方法是用水进行湿法装柱；

和/或，所述的装柱在进行前，还进行大孔吸附树脂的预处理；所述的预处理包括如下步骤：先将大孔吸附树脂用无水乙醇浸泡24～48小时，然后用水进行湿法装柱，然后用无水乙醇冲洗树脂柱，至流出液加两倍体积蒸馏水不产生浑浊时，再用水冲洗树脂柱至无醇味；然后倒出柱中的树脂，10～30℃下真空干燥，即可。

3.如权利要求2所述的黄精多糖的柱层析分离方法，其特征在于：

所述的极性大孔吸附树脂为NKA-9树脂和/或AB-8树脂；

和/或，所述的非极性大孔吸附树脂为X-5树脂；

和/或，所述的上样量为每150～160毫升柱体积上样10毫升；

和/或，所述的上样的药液中黄精多糖的浓度为3.9～4.0毫克/毫升；

和/或，所述的柱层析分离的上样流速为1.5～2毫升/分钟；

和/或，所述的静置的时间为10～14小时；

和/或，所述的大孔吸附树脂在进行柱层析分离时，其柱子的长度为50～80厘米；

和/或，所述的大孔吸附树脂在进行柱层析分离时，柱子的直径为2～3厘米。

4.如权利要求1所述的黄精多糖的柱层析分离方法，其特征在于：

所述的洗脱剂的种类为乙醇的质量百分比为20％～50％的乙醇水溶液；

和/或，所述的洗脱剂的用量为每100～200毫升柱体积用洗脱剂100～120毫升。

5.如权利要求4所述的黄精多糖的柱层析分离方法，其特征在于：

所述的洗脱剂的种类为乙醇的质量百分比为30％～50％的乙醇水溶液；

和/或，所述的洗脱剂的用量为每100～200毫升柱体积用洗脱剂110～120毫升。

6.如权利要求1所述的黄精多糖的柱层析分离方法，其特征在于：所述的黄精多糖的柱层析分离方法，还进一步包括所述的黄精多糖粗品的提取方法，其包括如下步骤：将生黄精药材与水混合，加热至沸腾并保持微沸或小火煮沸30～90分钟后，将黄精药材和煎出液分开，然后将分出的黄精药材再与另外的水混合，重复上述加热煮沸并分离黄精药材和煎出液的过程1～3次，合并所有煎出液，浓缩，制得所述的黄精多糖粗品的提取液；然后，醇沉，制得所述的黄精多糖粗品；每次与黄精药材混合的水的质量为所述的生黄精药材的质量的6～14倍。

7.如权利要求6所述的黄精多糖的柱层析分离方法，其特征在于：

所述的每次与黄精药材混合的水的质量是所述的生黄精药材的质量的7～12倍；

和/或，所述的保持微沸或小火煮沸的时间是60～90分钟；

和/或，所述的重复上述加热煮沸并分离黄精药材和煎出液的过程的次数为2～3次；

和/或，所述的浓缩的标准是将合并后煎出液中的水除去一部分，使浓缩后煎出液中药液比为1:(0.5～1)，所述的药液比为“所述的生黄精药材的质量”：“所述的黄精多糖粗品的提取液的体积”，单位为克/毫升；

和/或，所述的浓缩的方法为煮沸使浓缩的方法。

8.如权利要求7所述的黄精多糖的柱层析分离方法，其特征在于：

所述的“醇沉”的操作为：将浓缩后的药液与乙醇的质量百分比为90％～95％的乙醇水溶液混合均匀，形成混合液，所述的混合液中乙醇的质量百分比为75％～85％，在10～35℃的条件下静置12～24小时，然后过滤，制得所述的黄精多糖粗品。

9.一种黄精多糖粗品的提取方法，其特征在于，其包括如下步骤：将生黄精药材与水混合，加热至沸腾并保持煮沸30～90分钟后，将黄精药材和煎出液分开，然后将分出的黄精药材再与另外的水混合，重复上述加热煮沸并分离黄精药材和煎出液的过程1～3次，合并所有煎出液，浓缩，制得所述的黄精多糖粗品的提取液；然后，醇沉，制得所述的黄精多糖粗品；每次与黄精药材混合的水的质量为所述的生黄精药材的质量的6～14倍；所述的黄精多糖粗品的提取方法的方法和条件同权利要求6～8中任一项所述。