CN102775523B - 一种制备高纯度低分子肝素钠的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备高纯度低分子肝素钠的工艺，属于生物工程领域。主要包括盐析除杂、补料升温氧化、凝胶洗脱、离子交换、乙醇沉淀、真空干燥等。解决了目前肝素钠结构类似物难以去除，纯度达不到药用要求，制备工艺复杂等问题。该工艺通过补料升温氧化法实现低分子肝素钠的制备和脱色并用弱碱性离子交换树脂有效去除肝素钠结构类似物，缩短了生产周期、节约了成本、工艺简单、易操作、适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物药用原料的制备纯化方法，属于生物工程领域，具体是一种制备高纯度低分子肝素钠的工艺。
背景技术
肝素钠是一种富含阴离子的粘多糖硫酸酯，由动物体内的肥大细胞和嗜碱性粒细胞产生，因最初从肝脏中提取，故名肝素。临床使用的肝素是从动物肠、肺粘膜、血管壁等处提取获得的钠（锂）盐，肝素钠（锂）具有抗凝血、抗炎、抗癌等多种生物学功能，但长期使用会有诸如出血、骨折等负作用。20世纪80年代初期发现低分子肝素钠（LMWH，<8000Da）具有更强的活性和较小负作用，成为主要的临床抗凝血药。
目前国外已有10多种LMWH相继问世，全球四大制药企业均有该类产品的销售，我国是主要的肝素原料国，产量约占全球的一半。应用于临床的LMWH是由普通肝素为原料制备获得,制备方法主要有生物酶法、化学裂解法两种。它们各有优势，肝素酶降解反应条件温和、专一性高、副产物少而且引入一个紫外生色团，检测方便，但酶的价格昂贵，难以跨越工业生产的界线。化学裂解法不可避免的会改变肝素钠的结构、影响活性等。中国专利（授权号CN1096034）公开了一种纯化的肝素裂分其制备方法和含有它们的药物组合物。纯化的肝素裂分通过如下步骤制备：向肝素钠中加入亚硝酸盐，pH1～5处理20～50分钟，再在碱介质中以硼氢化钠还原，用HCL破坏过量硼氢化钠并用乙醇沉淀分级，将得到的溶液暴露在紫外照射系统下，温度为5℃～50℃,pH为3～8，色谱纯化，最后用氯化钠和乙醇沉淀分离得降解肝素钠。美国专利（公开号3099600）公开了一种色谱技术分离纯化肝素钠的方法：将肝素钠粗品溶于缓冲溶液中，加入5～12倍肝素钠重量的离子交换树脂TEAM-cel lulose或DEAE-cellulose，后用缓冲液洗涤，盐洗脱，乙醇沉淀、干燥得产品。上述方法为工业上典型的制备及纯化肝素钠的过程，生产工艺复杂、成本高，而且没有提及对肝素钠的结构类似物多硫酸软骨素这一主要杂质的去除方法。
发明内容
本发明的目的为了改进现有技术的不足而提供一种制备高纯度低分子肝素钠的工艺；该发明提供一种简便的低分子肝素钠制备、纯化技术，制得的低分子肝素钠平均分子质量在4.5KDa左右，效价不低于180U/mg,高于中国药典要求的170U/mg，且依据中国药典肝素钠检测标准检测合格。
本发明的技术方案为：一种制备高纯度低分子肝素钠的工艺，其具体步骤如下：
（1）将粗品肝素钠溶于NaCl溶液中，机械搅拌至肝素钠全部溶解，向溶液中加入碱液直至产生沉淀，静置，过滤除去不溶物，得滤液；
（2）将步骤（1）中滤液以碱液调pH至9.5～10.5，加入H2O2溶液，在10～30℃下反应2.5～3.5小时，得反应液；
（3）将步骤（2）得到的反应液升温至30～50℃，此后每隔2.5～3.5小时补加H2O2溶液，并调节pH；补料后共反应15～21h；
（4）向步骤（3）得到的反应液中加入吸附剂，磁力搅拌，过滤除不溶物，得滤液；
（5）将步骤（4）中的滤液通过平衡好的凝胶色谱柱，收集低分子量的肝素钠洗脱液；
（6）将步骤（5）中的低分子量的肝素钠洗脱液用弱碱性离子交换树脂吸附，分别以三种浓度的NaCl溶液洗脱，收集第一种（最低）、第三种（最高）浓度的NaCl洗脱液并混合；
（7）将步骤（6）中的混合洗脱液，在磁力搅拌下降温至－5～8℃，再用乙醇沉淀、真空干燥得产品。
优选步骤（1）中NaCl溶液的质量百分浓度为1.2～1.8%；NaCl溶液的用量为2～3mL/g肝素钠粗品量；静置时间1～2小时；优选步骤（1）和（2）的碱液均为NaOH或KOH溶液；碱液的浓度为1～1.5mol/L。
优选步骤（2）和（3）中所加入的H2O2溶液和NaCl溶液的体积比为3～5：100；步骤（2）中H2O2溶液的浓度为1～5mol/L，步骤（3）中H2O2溶液的浓度为1～3mol/L。步骤（3）中每次补加完H2O2溶液后测定pH，使pH在6.8～7.5之间。
优选步骤（4）中所述的吸附剂为活性碳、皂土或硅酸盐；吸附剂的加入量为3～5g/100mlNaCl溶液量。
优选步骤（5）中所述的凝胶色谱柱为Sephadex G-25，样品层为15～25%柱床体积，柱的径/高为1：5～7；以质量百分浓度4～6%NaCl溶液平衡并洗脱，流速为一个柱床体积/1.5～2小时，收集60～90mim时的洗脱液。
优选步骤（6）中三种浓度的NaCl溶液分别为0.1～0.3g/L、0.4～0.6g/L、0.7～0.9g/L；其洗脱时间均为1.8～2.5小时，样品层为15～25%柱床体积。
优选步骤（6）中所用的弱碱性离子交换树脂是D301、D315、D318或330，柱的高/径比为6～8：1。
有益效果：
（1）本发明采用补料升温氧化结合离子交换树脂法制备并纯化得到平均分子量4.5KDa低分子肝素钠，其效价不低于180U/mg，回收率不低于75%。（2）通过升温补加H2O2可以有效的控制肝素钠氧化失活，并且实现了氧化与脱色同步进行。（3）依据肝素钠及其结构类似物多硫酸软骨素所含阴离子强度的差异，采用弱碱性阴离子交换树脂吸附所有的多硫酸软骨素和少量的肝素钠，最后用低浓度盐分步洗脱，得到肝素钠产品。实验采用的弱碱性阴离子交换树脂，使得多硫酸软骨素杂质被吸附，而肝素钠产品直接流出，并用分步盐法洗脱吸附的少量肝素钠，极大的提高了其回收率。最终得到的低分子肝素钠产品达到中国药典标准，并且经检测不含多硫酸软骨素成分。
具体实施方式
以下结合实例来进一步解释本发明，但实施案例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1
将50g粗品肝素钠溶于100mL质量百分浓度1.2%NaCl溶液中，机械搅拌至肝素钠全部溶解，向溶液中加入1mol/LNaOH直至产生沉淀，静置1小时，过滤除去不溶物，得滤液；以1mol/L NaOH调pH至9.5，加入3mL1mol/L的H2O2，10℃，反应2.5小时。将反应液升温至30℃，此后每隔3.5小时补加3mL1mol/L H2O2，维持pH6.8，补料后共反应21h。向反应液中加入5g活性碳，磁力搅拌，过滤除不溶物，得滤液；以质量百分浓度为4%NaCl溶液平衡Sephadex G-25柱，样品层为15%柱床体积，柱径/高为1：5，将滤液通过该柱，以质量百分浓度4%NaCl洗脱，流速为一个柱床体积/2小时，收集70～90min洗脱液；把洗脱液流经D301色谱柱，样品层为15%柱床体积，柱高/径为6：1，分别以0.1、0.4、0.7（g/L）NaCl洗脱1.8h，收集0.1、0.7g/LNaCl洗脱液并合并；将该洗脱液，在磁力搅拌下降温至－5℃，此后用乙醇沉淀、真空干燥得产品。经检测，其效价为182U/mg，回收率79.1%，硫酸软骨素0.01mg/mL，硫酸皮肤素0.01mg/mL，各项指标均符合中国药典要求。
实施例2
将50g粗品肝素钠溶于120mL质量百分浓度1.8%NaCl溶液中，机械搅拌至肝素钠全部溶解，向溶液中加入1.5mol/LNaOH直至产生沉淀，静置2小时，过滤除去不溶物，得滤液；以1.5mol/L NaOH调pH至10.0，加入5mL 3mol/L的H2O2，20℃，反应3.0小时。将反应液升温至40℃，此后每隔2.5小时补加5mL2mol/L H2O2，维持pH7.0，补料后共反应18h。向反应液中加入5g皂土，磁力搅拌，过滤除不溶物，得滤液；以质量百分浓度5%NaCl溶液平衡SephadexG-25柱，样品层为20%柱床体积，柱径/高为1：6，将滤液通过该柱，以质量百分浓度5%NaCl洗脱，流速为一个柱床体积/1.5小时，收集60～80min洗脱液；把洗脱液流经D315色谱柱，样品层为20%柱床体积，柱高/径为7：1，分别以0.2、0.5、0.8g/L NaCl洗脱2.0h，收集合并0.2、0.8g/LNaCl洗脱液；将该洗脱液，在磁力搅拌下降温至3℃，此后用乙醇沉淀、真空干燥得产品。经检测，其效价为198U/mg，回收率82.0%，硫酸软骨素0.005mg/mL，硫酸皮肤素0.001mg/mL，各项指标均符合中国药典要求。
实施例3
将50g粗品肝素钠溶于150mL质量百分浓度1.6%NaCl溶液中，机械搅拌至肝素钠全部溶解，向溶液中加入1.2mol/LKOH直至产生沉淀，静置1.5小时，过滤除去不溶物，得滤液；以1.2mol/L KOH调pH至10.5，加入7.5mL 5mol/L的H2O2，30℃，反应3.5小时。将反应液升温至50℃，此后每隔3小时补加7.5mL 3mol/L H2O2，维持pH7.5，补料后共反应15h。向反应液中加入4.5g皂土，磁力搅拌，过滤除不溶物，得滤液；以质量百分浓度6%NaCl溶液平衡Sephadex G-25柱，样品层为25%柱床体积，柱径/高为1：7，将滤液通过该柱，以质量百分浓度6%NaCl洗脱，流速为一个柱床体积/1.8小时，收集70～90min洗脱液；把洗脱液流经330色谱柱，样品层为25%柱床体积，柱高/径为8：1，分别以0.3、0.6、0.9g/L NaCl洗脱2.5h，收集0.3、0.9g/LNaCl洗脱液；将该洗脱液，在磁力搅拌下降温至8℃，此后用乙醇沉淀、真空干燥得产品。经检测，其效价为187U/mg，回收率76.8%，硫酸软骨素0.004mg/mL，硫酸皮肤素0.003mg/mL，各项指标均符合中国药典要求。
Claims (8)
1.一种制备高纯度低分子肝素钠的工艺，其具体步骤如下：
（1）将粗品肝素钠溶于NaCl溶液中，机械搅拌至肝素钠全部溶解，向溶液中加入碱液直至产生沉淀，静置，过滤除去不溶物，得滤液；
（2）将步骤（1）中滤液以碱液调pH至9.5～10.5，加入H2O2溶液，在10～30℃下反应2.5～3.5小时，得反应液；
（3）将步骤（2）得到的反应液升温至30～50℃，此后每隔2.5～3.5小时补加H2O2溶液，并调节pH在6.8～7.5之间；补料后共反应15～21h；
（4）向步骤（3）得到的反应液中加入吸附剂，磁力搅拌，过滤除不溶物，得滤液；
（5）将步骤（4）中的滤液通过平衡好的凝胶色谱柱，收集低分子量的肝素钠洗脱液；
（6）将步骤（5）中的低分子量的肝素钠洗脱液用弱碱性离子交换树脂吸附，分别以三种浓度的NaCl溶液洗脱，三种浓度的NaCl溶液分别为0.1～0.3g/L、0.4～0.6g/L、0.7～0.9g/L，收集第一种最低浓度、第三种最高浓度的NaCl洗脱液并混合；
（7）将步骤（6）中的混合洗脱液，在磁力搅拌下降温至－5～8℃，再用乙醇沉淀、真空干燥得产品。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于：步骤（1）中NaCl溶液的质量百分浓度为1.2～1.8%；NaCl溶液的用量为2～3mL/g肝素钠粗品量；静置时间1～2小时。
3.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于：步骤（1）和（2）的碱液均为NaOH或KOH溶液；碱液的浓度为1～1.5mol/L。
4.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于：步骤（2）和（3）中所加入的H2O2溶液和NaCl溶液的体积比为3～5：100；步骤（2）中H2O2溶液的浓度为1～5mol/L，步骤（3）中H2O2溶液的浓度为1～3mol/L。
5.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于：步骤（4）中所述的吸附剂为活性碳、皂土或硅酸盐；吸附剂的加入量为3～5g/100mlNaCl溶液量。
6.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于：步骤（5）中所述的凝胶色谱柱为Sephadex G-25，样品层为15～25%柱床体积，柱的径/高为1：5～7；以质量百分浓度4～6%NaCl溶液平衡并洗脱，流速为一个柱床体积/1.5～2小时，收集60～90min时的洗脱液。
7.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于：步骤（6）中洗脱时间均为1.8～2.5小时，样品层为15～25%柱床体积。
8.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于：步骤（6）中所用的弱碱性离子交换树脂是D301、D315或330，柱的高/径比为6～8：1。
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