CN102731584B - 一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制备高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)的方法，具体包括猪脑丙酮粉的制备、总神经节苷脂浓缩液的制备和酸水解步骤；本发明所得神经节苷脂的产量和纯度均为提高，更能节省有机溶剂用量，节约提取时间，提高效率，为后续工艺带来方便。

Description

一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，特别涉及一种以新鲜猪脑为原料，制备高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)的方法。

背景技术

单唾液酸四己糖神经节苷脂(Monosialotetrahexosylganglioside，GM1)是一种含唾液酸的糖神经鞘脂类物质，是已知的唯一能穿透血脑屏障的神经节苷脂。GM1最早由德国Klenk发现，广泛存在于哺乳类动物的细胞膜上，尤以神经系统含量最为丰富，镶嵌于细胞双层脂质膜结构中，是神经细胞的重要组成成分之一，约占总脂质的10％。GM1在人体神经系统发生、生长、分化和再生过程中起着必不可少的作用。多年的实验及临床报道显示，GM1可促进受损神经恢复，具有促进“神经重塑”作用，是参与神经病变修复的主要物质之一。

GM1结构式及理化性质：1)GM1分子由1个唾液酸，1个葡萄糖，2个半乳糖，1个氨基半乳糖，1个神经酰胺残基构成。分子结构式见图1。2)性状：类白色粉末，水中易溶，在甲醇中极微溶解，在无水乙醇中几乎不溶或不溶；在0.1mol/L氢氧化钠溶液中易溶，在0.1mol/L盐酸溶液中极微溶解。3)熔点：接近200℃时变黄，218℃左右变黑，240℃时仍未熔融。4)酸度(溶液的pH值)：6.5-7.5。5)晶型：本品为糖脂类物质，无晶型结构。

制备药用GM1可从哺乳动物脑中提取，具有积极的工业价值。不同哺乳动物来源的脑组织中GM1的含量有差异，但有资料显示猪脑组织提取的GM1与人源性GM1在结构和组成，特别是唾液酸的类型等方面完全一致。因此，从动物脑组织作为原料提取GM1，不会存在免疫原性和异常毒性反应。根据文献报道，牛脑中GM1含量相对其它牲畜较高，但鉴于牛源性病毒，如疯牛病等对人体健康的严重危害，一般选用相对较安全的猪脑为原料。

总体来讲，GM1制备包括神经节苷脂混合物提取和GM1单一成份纯化两个步骤。从60年代起，提取总神经节苷脂混合物方法中，以Folch的氯仿-甲醇抽提法，Tettamanti的四氢呋喃提取法，以及Suzuki及Svennerholm等建立的改良方法为主，均能取得一定的满意效果。GM1单一组份纯化主要有DEAE-cellulose，DEAE-SephadexA52，DEAE-sepharose，DEAE-dextran，Mono-Q和Q-sepharose等阴离子交换法，反相层析法，如硅胶柱(Iatrobead和unisil),还有用Sep-Pak C18柱以及脂质亲和的LEPSEP-gel等。在整个提取过程中还常包括皂化处理，浓缩和沉淀处理，脱盐和透析等复杂的过程，有应用α-环糊精或大孔径树脂直接吸附GM1的方法等。另外，从脑组织中提取的总神经节苷脂主要是GM1(约占总质量的21％)，GD1b(约占总质量的36％)，GD1a(约占总质量的40％)和GT1b(约占总质量的19％)四种类型，还包含部分GM2,GM3,GM4,GQ1等其他神经节苷脂，不同组分之间主要差异在含NeuNAC型唾液酸的数目和连结位置上。因此，如将唾液酸进行降解(如酶解或酸水解)，可以使GT1b,GD1b,GD1a转化成GM1，从而使GM1的产量提高。有文献和专利报道用唾液酸酶可以降解GT和GD型神经节苷脂的末端唾液酸，部分转化为GM1，用酸水解方法降解其末端唾液酸达到同样的目的。

到目前为止，在GM1的提取纯化中，此类工艺往往存在诸多方面的不足，不利于工业化制备的开展，如操作步骤繁琐，耗时长，有机溶剂用量巨大，危害性高，废物处理困难，GM1的得率及纯度偏低等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法，该方法绿色环保，收率高；运用该方法制备的单唾液酸四己糖神经节苷脂纯度高。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法，具体包括以下步骤：

A猪脑丙酮粉的制备

将猪脑匀浆液进行脱水处理，并过滤，得脑渣；

B总神经节苷脂浓缩液的制备

将步骤A所得的脑渣用萃取缓冲液进行萃取，萃取的时间不少于40分钟，所述萃取缓冲液为5倍体积的氯仿：甲醇：水(体积比为2-6:6-10:1:5)；萃取完成后，过滤，得滤渣和滤液；将滤液调节pH值至10-11，并进行皂化反应，得皂化液；将皂化液进行浓缩，皂化液浓缩液中含有总神经节苷脂浓缩液；

C酸水解

将步骤B所得的总神经节苷脂浓缩液调节pH值至2-3，搅拌反应不少于1小时，加入相当于总神经节苷脂浓缩液3-6倍体积的丙酮，取沉淀，所述沉淀中含有单唾液酸四己糖神经节苷脂。

进一步，所述的单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法，在步骤A中，将猪脑进行匀浆，得猪脑匀浆液，在所述猪脑匀浆液中加入相当于猪脑体积5倍的丙酮进行脱水处理，并静置不少于8小时，过滤，收集滤渣，将滤渣在蒸馏釜内蒸馏干燥，收集脑渣。

进一步，在步骤B中，所述萃取缓冲液由氯仿、甲醇和水按体积比为4:8:3组成的萃取缓冲液。

进一步，在步骤B中，在滤渣中加入5倍体积萃取缓冲液，搅拌萃取60分钟，过滤，取萃取液，合并萃取液和所述滤液，并加入相当于所述萃取液和所述滤液体积之和的20％的水，将滤液用氢氧化钠粉调节pH值至10-11，并在60℃条件下进行皂化反应45分钟，得皂化液；将皂化液进行浓缩，得皂化浓缩液，其含有总神经节苷脂。

进一步，在步骤B中，采用大孔树脂吸附工序对皂化液进行处理，具体的，预处理后的大孔树脂装柱，将皂化液上柱，流速100L/小时；上柱完毕后先用10倍柱体积的水冲洗树脂，再以2-3个柱体积的体积分数为50％甲醇去杂质，流速200L/小时；再以100％甲醇冲洗解吸至目的带消失，流速100L/小时；蒸馏釜减压浓缩，除去甲醇，得到总神经节苷脂浓缩液。

进一步，将步骤B所得的神经节苷脂浓缩液用盐酸调节pH值至2.5，并在80摄氏度条件下反应2小时，得反应液；加入相当于反应液5倍体积的丙酮，-10℃条件下沉淀12小时，收集沉淀，所述沉淀为单唾液酸四己糖神经节苷脂粗品。

进一步，将所得单唾液酸四己糖神经节苷脂粗品用硅胶柱层析法纯化处理，硅胶柱层析法中的流动相由体积比为45∶40∶5的氯仿、甲醇和水组成，其中按每10kg单唾液酸四己糖神经节苷脂粗品和80L流动相的比例充分溶解，上样，流速50L/小时，洗脱后，收集洗脱液，蒸馏釜减压浓缩，除去溶剂，得浓缩液1，加入相当于浓缩液1体积10倍的丙酮，-10℃低温沉淀12小时，过滤并收集沉淀，沉淀充分干燥，得单唾液酸四己糖神经节苷脂次粗品。

进一步，在步骤C之后，还包括步骤D,唾液酸四己糖神经节苷脂的纯化，具体为：将单唾液酸四己糖神经节苷脂次粗品用硅胶柱析柱法进行纯化，所述流动相为体积比为65:30:5的氯仿、甲醇和水组成，按每1kg单唾液酸四己糖神经节苷脂粗品和5L流动相的比例充分溶解，上样，流速为5L/小时，再用流动相以20L/小时匀速洗脱，以HPTLC(高效薄层色谱)检测流出液，流出液中仅含单唾液酸四己糖神经节苷脂纯品。

进一步，将所述流出液于旋转蒸发仪减压浓缩(水浴温度70℃，浓缩至原体积的1/40)，得浓缩液2，并加入相当于浓缩液2的10倍体积的丙酮，-10℃低温至充分产生沉淀，收集沉淀，用纯水溶解沉淀，上述步骤重复1-3次。

本发明与现有技术相比有如下的明显优点和技术进步：

1)本发明猪脑丙酮粉的制备步骤中，所述的丙酮浸渍处理工艺，可去除猪脑组织中的大量水分，减少水溶性杂质，利于大量胆固醇去除及猪脑组织细胞中内含物增溶释放，并可抑制猪脑组织中某些酶类对目的产物的降解，所得神经节苷脂的产量和纯度均为提高，更能节省有机溶剂用量，节约提取时间，提高效率，为后续工艺带来方便。

申请号为200710049500.4的中国专利采用家畜脑组织与丙酮(1:10)混合后匀浆30min，梯度离心收集沉淀的方法，而未经过12小时的浸渍处理。

申请号为01126341.5的中国专利提出用丙酮浸渍处理次数为3-6次，丙酮用量分别为3倍、2.5倍、1.5倍不等，每次24小时，用细布或压滤机过滤。步骤繁琐，操作难度和生产成本均较高，不利于丙酮回收和大规模工业化生产。

我们改进为用5倍体积丙酮浸渍处理12小时，过滤后，用蒸馏釜蒸馏达到干燥和回收丙酮的目的。处理后猪脑渣干重约为1/3湿重。

2)本发明步骤二所述的总神经节苷脂提取工艺，采用改良的“氯仿/甲醇/水萃取法”进行总神经节苷脂粗提。

申请号为201010141503.2、200910177575.X、200710195019.6的中国专利公开了未经丙酮处理的新鲜猪脑分别经“氯仿/甲醇/水”、“氯仿/甲醇”、“甲醇/水”进行萃取的技术方案，

申请号为200710049500.4的中国专利公开了用丙酮粉与“氯仿/甲醇/水”进行萃取的工艺，采用一步法离心分离，收集上清。

本发明所采用的为改良的“氯仿/甲醇/水萃取法”，具体的，取丙酮粉加入5倍体积的氯仿/甲醇/水(体积比为4：8：3)萃取液提取总脂，所得沉淀再用5倍体积的萃取液进行第2次提取，合并上清。补入20％的水静置分层，分层上清为总脂提取液。大部份中性脂都分配进入下层有机相，上层水相中大部份为神经节苷脂及部分磷脂。根据磷脂在碱性条件下易于与碱性物质生成“皂类物质”特点，本发明通过NaOH进行皂化反应沉淀磷脂，皂化反应后通过定磷法测定上清液中含磷量已低于1％。选用本方法可达到更高的提取效率，且磷脂污染较小。

3)本发明涉及大孔树脂吸附和总神经节苷脂酸水解的工艺，其目的是利用大孔树酯吸附、分离神经节苷脂混合体，富集GM1，并通过酸水解以获得更高的GM1产量。本发明通过对不同浓度的盐酸、磷酸、乙酸在不同pH和水解温度条件下，对同一批次总神经节苷脂水溶液进行水解，GM1的增值测定(TLC方法)结果显示：0.2％盐酸，pH2.5，加热至80℃搅拌反应2小时为最佳条件。

4)本发明涉及GM1纯化工艺，是经过优化的新型的柱层析纯化分离方法。由于从猪脑组织中经过有机相抽提，分配提取，皂化，大孔树脂富集，酸水解后得到含GM1 35％左右的总神经节苷脂混合物，其中尚含有少量的磷脂、硫酸脂、单脂肪酸等杂质物质。传统的硅胶层析工艺周期长，一般30日左右一个批次，溶剂消耗巨大，收率欠佳。本发明操作方便，比一般硅胶纯化能负载更多样品，回收率高。经过2次纯化，可达到更好的精制，且周期短，成本低，有利于工业化生产的开展。

5)本发明对生产过程中有机溶剂和终产物废料的处理，既能有效减少产品中的残留杂质，又可避免有机溶剂对环境的污染，利于产业化生产。

附图说明

图1：GM1化学结构式；

图2：本发明制备产品的HPLC图；

图3：进口对照品的HPLC图；

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件进行或配置，未注明来源的产品均可通过市场途径获得。

大孔树脂吸附层析法：大孔吸附树脂是以苯乙烯和丙酸酯为单体，加入乙烯苯为交联剂，甲苯、二甲苯为致孔剂，它们相互交联聚合形成了多孔骨架结构。树脂一般为白色的球状颗粒,粒度为20～60目，是一类含离子交换集团的交联聚合物，它的理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，不受无机盐类及强离子低分子化合物的影响。树脂吸附作用是依靠它和被吸附的分子(吸附质)之间的范德华引力，通过它巨大的比表面进行物理吸附而工作，使有机化合物根据有吸附力及其分子量大小可以经一定溶剂洗脱分开而达到分离、纯化、除杂、浓缩等不同目的。

硅胶柱层析柱法：硅胶层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离，一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。具体方法可参照中国药典2000年版二部：柱色谱法。

实施例1猪脑选择及预处理

选取经过动物防疫检验合格的新鲜猪脑或冻猪脑，去除脑膜及血管，用去离子水冲去血污，再漂洗3次，绞碎，匀浆。粉碎后用相当于试验用猪脑5倍体积的丙酮，搅拌15分钟，室温静置浸渍处理12小时。过滤，收集滤渣。滤渣移至蒸馏釜内蒸馏干燥，收集干渣，得猪脑丙酮粉，密闭分装，保存备用。

实施例2总神经节苷脂提取

搅拌罐内泵入500L萃取缓冲液，再投入100千克猪脑丙酮粉，搅拌萃取60分钟，过滤，收集沉淀和滤液，所述萃取缓冲液由氯仿、甲醇和水按体积比为4：8：3的比例混合。在所述沉淀中加入500L所述萃取缓冲液，搅拌萃取60分钟，过滤，收集沉淀和萃取液。合并滤液和萃取液，在萃取液中加入相当于萃取液体积20％的水，混匀，得混合液；将混合液在室温静置分层12小时，取上清液。在所述上清液中加入NaOH粉末，使上清液中NaOH的质量分数为0.3％，搅拌溶解，pH值到10.0-11.0，60℃皂化反应45分钟，皂化液冷却备用。

大孔树脂预处理后，量取120L树脂(约100千克)湿法装柱，将上述皂化液上样，流速100L/小时。上样完毕后先用10倍柱体积的水冲洗树脂，再以2-3个柱体积的体积分数为50％甲醇去杂质，流速200L/小时。再以100％甲醇冲洗解吸至目的带消失，流速100L/小时。蒸馏釜减压浓缩，除去甲醇，得到总神经节苷脂浓缩液。

实施例3GM1粗品的提取

在60L实施例2制备的总神经节苷脂浓缩液中补入0.2％盐酸(即120ml)，调节至pH2.5，得混合液。80℃搅拌反应2小时，冷却至室温，待用。加入相当于混合液5倍体积的丙酮，-10℃低温沉淀12小时。离心，用200目滤布过滤收集沉淀，获得含GM1粗品，GM1粗品中含有质量分数为35％“粗品1”。

对“粗品1”进行纯化：取粗硅胶300千克，用流动相氯仿/甲醇/水(氯仿、甲醇和水的体积比为45∶40∶5)湿法装至1根80×100cm层析柱中。将“粗品1”按每10kg用80L流动相充分溶解，上样，流速50L/小时。以上述流动相洗脱，分部收集洗脱液，流速200升/小时，以HPTLC检测流出液，合并含GM1流份。蒸馏釜减压浓缩，除去溶剂，得到总神经节苷脂浓缩液。加入相当于总神经节苷脂浓缩液10倍体积丙酮，-10℃低温沉淀12小时。用200目滤布过滤收集沉淀，沉淀用干燥箱60℃真空干燥5小时，即为“粗品2”。

“粗品2”的硅胶柱层析精纯化：取层析硅胶10kg，用流动相氯仿/甲醇/水(氯仿、甲醇和水的体积比为65∶30∶5)湿法装至1根22×100cm层析柱中，将“粗品2”按每1.0千克用5.0L流动相充分溶解。上样，流速5L/小时。再用流动相以20L/小时匀速洗脱，以HPTLC检测流出液，合并仅含GM1流份。

获得的含GM1流份，于旋转蒸发仪减压浓缩(水浴温度70℃，浓缩至原体积的1/40)，除去溶剂，获得浓缩液。加入相当于浓缩液10倍体积的丙酮，-10℃低温沉淀12小时。除去澄清的丙酮上清液，用200目滤布过滤，收集沉淀，用纯水溶解。再加入10倍体积丙酮，-10℃低温沉淀12小时。过滤，收集沉淀，用无热原纯水溶解，-40℃低温预冻8小时。置于低温真空干燥机，冷冻干燥。粉碎机粉碎，60目筛网过筛。按1.0千克分装到铝塑袋，再装到铝听，封盖。从猪脑中提取GM1产率按质量分数计为万分之五。

实施例4确证制备产品的化学结构

一供确证化学结构用样品的精制及纯度检测

1样品精制方法：

取实施例3制备的GM1样品适量溶于体积分数为5％的甲醇中，用大孔树脂吸附，水冲洗至清，80％甲醇冲2倍柱体积，用甲醇解吸附，收集含唾液酸洗脱液，浓缩，丙酮沉淀，60℃真空干燥至恒重即为精制品。

2进口对照品制备方法：

取阿根廷TRB药厂生产GM1注射液(商品名施捷因，生产批号：进口药品注册证号：H20070242，生产批号：20176，生产日期：2010年9月)20支(20mg/2ml/支)，用20ml大孔树脂吸附，水洗约10个柱体积，然后用10个柱体积甲醇洗脱，减压除去甲醇，用少量水溶解，加到丙酮中使之沉淀，离心收集沉淀，60℃真空干燥，得320mg白色粒状固体。

3样品纯度检测

方法：高效液相色谱法(HPLC)

仪器：安捷伦HP1100，四元梯度泵，紫外检测器(波长205nm)

色谱柱：大连依利特公司Bondatak C18柱，4.6×250mm,10μ

流动相：乙腈：体积分数为0.03％三乙胺按体积比为8:2进行混合后，用磷酸调至pH＝7.5，1.0ml/min。

本品与对照样品HPLC图谱分别见图2，图3。检测结果显示样品中GM1含量为98.15％，对照品含量为100.70％。

二确定产品化学结构的方法

1红外吸收光谱(IR)

仪器型号：Bio-Rad FTS-65A

测定条件：采用溴化钾压片法在4000～400CM^-1范围测定

检测依据：傅立叶变换红外吸收光谱分析方法通则

制样方法：称取样品约1mg，加入干燥KBr粉未约150mg，研磨3次，每次1分钟，在2×10^-6Pa下压片，测定红外光谱。

分析测试结果：见表1。

表1GM1红外光谱吸收峰数据及归属

解析：红外光谱中3399cm^-1处存在宽而强的峰，表明分子中存在多羟基，多胺基；2922，2851cm^-1处的强吸收峰为典型的长链烷烃的特征吸收；1643cm^-1为酰胺羰基的特征吸收；1070cm^-1为碳一氧单健伸缩振动，峰宽而强为多醚健多羟基。

三核磁共振氢谱(¹HNMR)、碳谱(¹³CNMR)

仪器型号：瓦里安公司UNITY INOVA 600核磁共振仪；

检测依据：核磁共振波谱分析方法通则；

检定条件：取约15mg样品置于5mm样品管中，加入溶剂DMSO-d₆，以TMS为内标，测定核磁共振氢谱。

图谱解析：

a.δ0.87,0.88和15.61为长链上的两个端甲基的氢和碳信号。

b.δ1.78,1.91和23.86,24.32为两个乙酰胺的甲基。

c.δ1.93和33.08为长链上与双键相邻的亚甲基。

d.δ2.03和37.38为长链上与羰基相邻的亚甲基。

e.δ1.25～2.03和25.27～39.16为长链上的亚甲基及E环上的一个亚甲基，总共29个。

f.δ3.10,3.75,3.90,52.60,54.45,54.72为与氮相邻的次甲基(N-CH)。

g.δ3.10～4.01和69.15～82.45为与氧相邻的次甲基，共20个。

h.δ4.17,4.22,4.29,4.85,104.26,105.28,105.44,106.22分别为与两个氧相邻的次甲基，共4个。

i.δ5.36,5.54,133.12,133.22为双键的质子和碳。

j.δ103.67为与两个氧相邻的季碳。

k.δ172.51,173.44,173.53,174.08为4个羰基碳。

l.δ8.16,7.57,7.51为3个胺基质子，δ5.92,4.33～5.17为众多的羟基质子。

四质谱(MS)分析

仪器型号：Micromass公司Q-TOF-2型质谱仪

检测依据：质谱分析方法通则

测定条件：电喷雾离子源(ESI)，源温80℃，扫描范围：50～2000μ。

本品及对照品(括号内数据)的正离子电喷雾(ESI)质谱图中，主要信号峰有m/z1163.8191(1163.8191)、m/z1191.8621(对照品未标出)、m/z1277.8757(1277.8464)、m/z1546.9957(1546.9634)、m/z1568.9618(1568.9618)及m/z1597.0140(1596.9813)等。

本样品为两个单唾液酸四己糖神经节苷脂同系物的钠盐，其单唾液酸四己糖神经节苷脂部分的元素组成分别为C₇₃H₁₃₁N₃O₃₁(M₁₈)和C₇₅H₁₃₅N₃O₃₁(M₂₀)，分子量分别为1545.8766，1573.9079。

准分子离子峰：本品谱中m/z 1546.9618为第一个成分的准分子离子M₁₈+H⁺峰，与样品中第一个成分的分子量计算值1545.8766相符。m/z 1568.9618为M₁₈+Na⁺峰。m/z 1597.0140为M₂₀+Na⁺峰。对照品谱中也有相同的信号峰。

糖苷键断裂后形成的碎片峰：ESI谱通常不出现碎片峰，但本品和进口对照品MS谱中均可明显看到在寡糖链分枝处断裂产生的碎片峰，可能是由于糖环上同侧相临的两个羟基上连接体积较大的取代基，因位阻而引起的张力使此处的糖苷键容易断裂。

裂解部位：m/z1163.8191(1163.8191)为M₁₈-Gal-GalNAc+H⁺峰；1191.8621为M₂₀-Gal-GalNAc+H⁺峰。m/z1277.8757(1277.8464)为M₁₈-Neu5Ac+Na⁺峰；m/z1305.8579(对照品)为M₂₀-Neu5Ac+Na⁺峰。

总之，样品的质谱数据及图谱与进口对照品基本相同。

本品的红外、核磁、质谱数据均符合GM1化学结构，且与进口对照品数据一致，确证本品为GM1。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (2)

1.单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤： 

A猪脑丙酮粉的制备 

在步骤A中，将猪脑进行匀浆，得猪脑匀浆液，在所述猪脑匀浆液中加入相当于猪脑体积5倍的丙酮进行脱水处理，并静置不少于8小时，过滤，收集滤渣，将滤渣在蒸馏釜内蒸馏干燥，收集脑渣,所得脑渣即为猪脑丙酮粉； 

B总神经节苷脂浓缩液的制备 

将步骤A所得的脑渣用5倍量萃取缓冲液进行萃取，萃取的时间不少于40分钟，所述萃取缓冲液由氯仿、甲醇和水按体积比为4:8:3组成；萃取完成后，过滤，得滤渣和滤液；将滤液调节pH值至10-11，并进行皂化反应，得皂化液；采用大孔树脂吸附工序对皂化液处理获得总神经节苷脂浓缩液，具体为：皂化液上样后，先用10倍柱体积的水冲洗树脂；再以2-3个柱体积的体积分数为50％甲醇去杂质，流速200L/小时；再以100％甲醇冲洗解吸，流速100L/小时；蒸馏釜减压浓缩，除去甲醇； 

C酸水解 

将步骤B所得的神经节苷脂浓缩液用盐酸调节pH值至2.5，并在80摄氏度条件下反应2小时，得反应液,加入相当于反应液5倍体积的丙酮，-10℃条件下沉淀12小时，收集沉淀，所述沉淀为单唾液酸四己糖神经节苷脂粗品，将所得单唾液酸四己糖神经节苷脂粗品用硅胶柱层析法纯化处理，将300kg粗硅胶湿法装至Φ80×100cm层析柱中，流动相由体积比为45∶40∶5的氯仿、甲醇和水组成，其中按每10kg单唾液酸四己糖神经节苷脂粗品和80L流动相的比例充分溶解，上样，流速50L/小时，洗脱后，收集洗脱液，蒸馏釜减压浓缩，除去溶剂，得浓缩液1，加入相当于浓缩液1体积10倍的丙酮，-10℃低温沉淀12小时，过滤并收集沉淀，沉淀充分干燥，得单唾液酸四己糖神经节苷脂次粗品，在步骤C之后，还包括步骤D,单唾液酸四己糖神经节苷脂的硅胶柱层析 法纯化，具体为:10kg层析硅胶湿法装至Φ22×100cm层析柱中，所述流动相为体积比为65:30:5的氯仿、甲醇和水组成，按每1kg单唾液酸四己糖神经节苷脂次粗品和5L流动相的比例充分溶解，上样，流速为5L/小时，再用流动相以20L/小时匀速洗脱，以高效薄层色谱检测流出液，流出液中仅含单唾液酸四己糖神经节苷脂纯品。 

2.根据权利要求1所述的单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法，其特征在于，将所述流出液于旋转蒸发仪在70℃减压浓缩至原体积的1/40，得浓缩液2，并加入相当于浓缩液2的10倍体积的丙酮，-10℃低温至充分产生沉淀，收集沉淀，用纯水溶解沉淀，上述步骤重复1-3次。