CN110240544A

CN110240544A - 一种绿原酸提取纯化方法及应用

Info

Publication number: CN110240544A
Application number: CN201910476179.0A
Authority: CN
Inventors: 高锦明; 杨志; 郭佩佩; 汤江江
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: XI'AN RAINBOW BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2019-06-03
Filing date: 2019-06-03
Publication date: 2019-09-17
Anticipated expiration: 2039-06-03
Also published as: CN110240544B

Abstract

本发明公开了一种绿原酸提取纯化方法及应用，包括以杜仲叶提取物为原料，水和乙酸乙酯为萃取相，原料经萃取相萃取依次去除水溶性杂质和脂溶性杂质得到水萃取相，水萃取相通过大孔树脂分离纯化或高速逆流色谱纯化得到绿原酸。本发明分别通过萃取富集，大孔树脂分离，高速逆流色谱精制等过程，得到不同级别的高纯度绿原酸。本发明的优点是操作步骤简便，可以分别得到97％以上和99％以上两种不同纯度的绿原酸，应用范围广泛。

Description

一种绿原酸提取纯化方法及应用

技术领域

本发明属于医药化工技术领域，涉及一种绿原酸提取纯化方法及应用。

背景技术

绿原酸的提取方法包括：水提法、有机溶剂浸提法、酶解法、超临界流体萃取法、微波辅助法、超声波辅助法等多种方法。

魏锐等通过优化杜仲叶中绿原酸水提工艺条件，确定在料液比1：16，提取时间20min，提取次数2次，提取温度65℃时绿原酸提取率最高，提取率达92.550％，收率为1.666％。邓爱华等从杜仲叶中提取绿原酸，在料液比1：11、乙醇质量分数40％、提取温度61.4℃的条件下，绿原酸提取率为0.8728％。王柏强等以杜仲叶为原料，优选工艺条件为提取时间40min，固液比1：15(g/mL)，酶解温度45℃，酶用量20mg，绿原酸提取率为2.37％。肖苑等在超声频率25kHz，乙醇浓度为60％，料液比为1：12，pH＝5，提取时间为30min的条件下提取杜仲叶2次，绿原酸的得率为2.54％。邵平等以400W微波辅助50％的丙酮水溶液浸提杜仲叶，料液比1：30，提取时间25min，绿原酸的提取率达2.28％。齐惠丽等用60％的乙醇，超声提取杜仲叶2次，每次40min，料液比1：8，提取溶剂pH为5，绿原酸得率2.61％。赵梦瑶等对杜仲叶中的绿原酸采用超声波辅助技术进行提取研究。根据6种因素对提取结果的影响趋势,采用正交试验优化提取工艺。结果表明最佳提取条件：溶剂pH 4.5、超声浸提时间25min、超声浸提温度40℃、溶剂中乙醇浓度70％，测得提取物的得率为4.06％。叶宏等对水提杜仲叶绿原酸的工艺条件进行优化，确定最佳工艺条件为：温度55～59℃，料液比1:15，提取时间2h，提取2次。最终得出在最佳条件下绿原酸的提取率为95％。

综上所述，以杜仲叶为原料对绿原酸进行提取的方法中，绿原酸水提的提取率最高(95％)，超声提取的提取率次之(4.06％)，其余的方法提取率均在2％左右。

中国专利也公开了多种从杜仲叶中提取绿原酸的方法，其中包括水提法(申请号：CN101602668A；CN 103420838 B；CN 103992224 A；CN 104119229 A；CN 108373413 A)，溶剂提取法(申请号：CN 108840891 A；CN 108191658 A；CN101935278A；CN1616402A)，微波辅助法(申请号：CN 102040520A)，酶法(CN 108084026 A；CN 102391117 A；CN 102040519A)等常规方法；；还包括汽爆辅助法(申请号：CN 102351700A)，铝盐沉淀(申请号：CN102675106 B)，细胞破壁低温提取(申请号：CN 104490980 A)等方法。

绿原酸的分离纯化：杜仲叶提取物中绿原酸的分离方法，目前常用的有溶剂萃取法、沉淀法、聚酰胺柱层析法、硅胶柱层析法、大孔树脂分离法、膜技术分离法、高速逆流色谱分离法等。杨祖金等通过超滤膜技术分离杜仲绿盐酸，在料液温度为40℃、超滤压力为0.36MPa、超滤时间为60min、膜截留分子量为200000时，绿原酸转移率最高(67.57％)，通过继续加入24L的去离子水进行超滤，绿原酸的转移率可高达99.38％。于瑞涛等采用大孔树脂NKA-9分离纯化杜仲叶中的绿原酸，反相高效液相色谱法(RP-HPLC)对药材杜仲叶提取物中的绿原酸进行分析。定量分析：RP-HPLC法测定药材杜仲叶提取物不同乙醇浓度洗脱部分的绿原酸含量，流动相：V(乙腈)∶V(0.4％H₃PO₄)＝13∶87溶液；检测波长326nm；结果表明，20％乙醇洗脱部分绿原酸含量最高，达到37.93％。李文娜等经过对杜仲叶绿原酸分离纯化工艺的优化，确定最佳分离除杂方法为壳聚糖絮凝除杂法,最佳树脂为NKA-9型大孔树脂，上柱前粗提物绿原酸含量为2.54％，经大孔树脂纯化后产品中绿原酸含量达到42.43％，提高了16倍。程德军等将杜仲叶粉先用氯仿除脂，乙醇超声提取绿原酸，再经适当萃取除杂后、通过两次制备薄层色谱纯化得到绿原酸。产品的紫外光谱特征与文献相符，薄层色谱主斑与绿原酸对照品对应，HPLC的主峰t_R与绿原酸对照品的t_R吻合。HPLC外标法测得产品绿原酸的纯度为91.6％以上。袁华等将杜仲叶用去离子水在80℃浸提150min，提取液经浓缩、絮凝除杂、吸附脱色得到进样清液，进样液经NKA-9大孔树脂处理得到绿原酸粗品，后者经重结晶得到含量≥97％的绿原酸，提取率≥65％。邵平等以杜仲叶为原料，正交试验优化了微波辅助提取绿原酸的工艺条件。应用高速逆流色谱(HSCCC)分离制备高纯度杜仲叶绿原酸，通过质谱技术与核磁共振技术进行结构鉴定。结果表明，杜仲叶最佳提取工艺条件为微波辅助50％的丙酮水溶液浸提，料液比1∶30，提取时间25min，提取功率400W，绿原酸的提取率达2.28％；高速逆流色谱法分离杜仲叶绿原酸的最佳条件为以乙酸乙酯-正丁醇-水(3∶1∶4)为溶剂体系,上相为固定相，下相为流动相，转速900r/min，流速2.0mL/min，恒定温度30℃，一步分离纯化得纯度为98.7％的绿原酸。

从上述分离纯化绿原酸的方法可以看出，大部分都会选择用大孔树脂纯化，但是简单用大孔树脂分离，得到的绿原酸纯度不高(40％左右)；经过多重薄层色谱或者柱层析色谱以及重结晶得到的绿原酸纯度相对都较高(90％以上)，但是操作麻烦；通过高速逆流色谱得到的绿原酸纯度也相对较高(95％以上)，但是直接用提取物分离，上样量少，得到的绿原酸纯品量更少。

关于以杜仲叶为原料，对绿原酸进行分离纯化的中国专利也有很多，包括大孔吸附树脂分离(申请号：CN1616402A；CN101602668A；CN101935278A；CN 102040519A；CN102391117 A；CN 104490980 A；CN 103992224 A；CN 104119229 A；CN 104478720 A；CN108840891 A)，聚酰胺、硅胶分离(申请号：CN 108840891 A；CN 104119229 A；)，膜技术分离(申请号：CN101935278A；CN 102040519A；CN 102391117 A；CN 104490980 A)，萃取和重结晶(申请号：CN1616402A；CN101602668A；CN101935278A；CN 102351700A；CN 102675106B；CN 103420838 B；CN 104119229 A)，还有高速逆流色谱(申请号：CN 108084026 A；CN102040520A)。

发明内容

本发明提供一种绿原酸提取纯化方法及应用，提取和制备不同纯度绿原酸的方法，或者直接购买杜仲叶提取物为原料，制备不同纯度的绿原酸的方法。本发明的方法可以得到97％和99％两种纯度的绿原酸，根据需要可以用作不同的用途。

为达到上述目的，本发明采取的技术方案包括：

一种绿原酸提取纯化方法，包括以杜仲叶提取物为原料，水和乙酸乙酯为萃取相，原料经萃取相萃取依次去除水溶性杂质和脂溶性杂质得到水萃取相，水萃取相通过大孔树脂分离纯化或高速逆流色谱纯化得到绿原酸。

可选的，所述的去除水溶性杂质和脂溶性杂质包括：调节萃取相中的乙酸乙酯相呈酸性，萃取溶解在水相中的杜仲叶提取物，去除水溶性杂质得到乙酸乙酯萃取相，再通过碱性水相反萃乙酸乙酯萃取相，去除脂溶性杂质得到水萃取相。

可选的，所述的酸性为pH＝1～2；所述的碱性为pH＝8～10。

可选的，所述的溶解在水相中的杜仲叶提取物中，杜仲叶提取物(mg)与水(mL)的比例为10:1。

可选的，所述调节萃取相中的乙酸乙酯相呈酸性通过盐酸或硫酸调节；所述的碱性水相为含有氨水的水相。

可选的，所述的杜仲叶提取物为杜仲叶的水提取物。

可选的，所述杜仲叶提取物为杜仲叶的水提取物；杜仲叶的水提取物是以水为提取溶剂，60℃加热2h，重复提取2次，干燥处理得到杜仲叶提取物。

可选的，所述水萃取相通过大孔树脂分离纯化包括：调节水萃取相pH＝2，用HP-20树脂分离，分离条件为：2倍柱体积的水洗脱，4倍柱体积的体积百分浓度为20％的乙醇溶液洗脱，再用2倍柱体积乙醇洗脱，合并20％乙醇溶液洗脱部分，干燥处理得到绿原酸。

可选的，所述水萃取相通过高速逆流色谱分离纯化包括：按体积比计，乙酸乙酯/正丁醇/水＝4：1：5为分离溶剂体系，流速4mL/min，转速1000rpm，进行高速逆流色谱纯化和干燥处理得到高速逆流色谱纯化产物。

本发明所述的绿原酸提取纯化方法得到的绿原酸用于制备化妆品添加剂或食品添加剂的应用。

本发明的优点：

本发明提供一种以杜仲叶为原料，提取和制备不同纯度绿原酸的方法，或者直接购买杜仲叶提取物为原料，制备不同纯度的绿原酸的方法。该方法通过简单萃取，再通过大孔树脂分离，可以直接得到纯度97％的绿原酸，也可以通过高速逆流色谱纯化得到纯度99％的绿原酸，本方法操作简单，步骤少，制备得到不同纯度的绿原酸可以应用到不同的方向。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是绿原酸的标准曲线；

图2是萃取产物HPLC检测图；

图3是大孔树脂分离产物HPLC检测图；

图4是高速逆流色谱纯化产物HPLC检测图。

具体实施方式

本发明利用水提法得到的杜仲叶提取物，或者直接购买杜仲叶水提取物。通过酸化调节pH，乙酸乙酯萃取富集，去除水溶性的杂质，得到乙酸乙酯萃取液，再通过碱化调节pH，水萃取，去除脂溶性的杂质，得到最终萃取产物绿原酸的水萃取相。通过简单萃取绿原酸的纯度达到60％以上，再通过大孔吸附树脂分离，绿原酸的纯度达到95％以上，或者通过高速逆流色谱纯化，得到纯度在99％以上的绿原酸。即通过简单的步骤，可以得到97％和99％两种不同纯度的绿原酸，纯度较低的绿原酸(比如纯度为97％)可用于日用化工行业，作为化妆品的添加剂；纯度较高的绿原酸(比如纯度为99％)可用于医药保健和食品行业，作为保健品添加剂，以及食品添加剂，也可作为标准品用于生化分析。

本发明的水提法是以杜仲叶为原料，以水为提取溶剂，60℃加热2h，重复提取2次，通过真空(量少)或喷雾(量大)进行干燥处理，得到杜仲叶提取物。

本发明在萃取过程中酸化调节pH，可用盐酸或者硫酸溶液调节pH，pH范围为1～2，优选pH为2，通过等体积的乙酸乙酯反复萃取，萃取次数为3～5次，合并得到乙酸乙酯萃取液。

本发明在萃取过程中碱化调节pH，可用氨水溶液调节pH，pH范围为8～10，优选pH为9，通过等体积的pH＝9的去离子水萃取3次，通过真空(量少)或喷雾(量大)进行干燥处理萃取产物。

本发明在对最终的水萃取相进行大孔吸附树脂分离，是采用HP-20大孔树脂，萃取产物用去离子水溶解，调节pH为2，上柱，先用2个柱体积的水洗脱，再用4个柱体积的体积百分浓度为20％的乙醇溶液洗脱，最终再用2个柱体积的乙醇洗脱，通过真空(量少)或喷雾(量大)进行干燥处理得到纯度97％的绿原酸。

本发明在对最终的水萃取相进行高速逆流色谱纯化是选用乙酸乙酯/正丁醇/水(体积比4：1：5)作为溶剂体系，流速4mL/min，转速1000rpm，进行高速逆流色谱纯化、通过真空(量少)或喷雾(量大)进行干燥处理得到纯度99％的绿原酸。

通过本发明的纯化方法，可以分别得到97％和99％两种纯度的绿原酸，根据需要可以用作不同的用途。

下面实施例中使用的杜仲提取物是购买的杜仲叶水提物。

实施例1：绿原酸的标准曲线的制作

分别配制浓度为2、1、0.5、0.25、0.125和0.0625mg/mL的绿原酸溶液，通过HPLC检测，制作绿原酸的标准曲线(图1)。仪器：安捷伦高效液相色谱仪，配有G1379A脱气装置、G1311A四元泵、G1367A自动进样装置、G1316A柱温箱、G1315B紫外检测器、安捷伦化学工作站和YMC-C₁₈色谱柱(4.6×150mm，5μm)。色谱条件：流动相A：0.03％TFA(三氟乙酸)水，流动相B：甲醇。时间程序：0-5min：5％MeOH-25％MeOH；5-25min：25％MeOH-65％MeOH；25-30min：65％MeOH-100％MeOH；30-35min：100％MeOH。流速0.8mL/min，柱温30℃，进样量10μL，检测波长338nm。

实施例2：乙酸乙酯萃取pH的选择

称取2mg杜仲提取物7份，分别用1mL乙酸乙酯饱和过的pH＝1、2、3、4、5、6和7的水溶液溶解，然后用等体积的乙酸乙酯萃取，分别用HPLC测定上下相的绿原酸含量，计算萃取率(表1)。通过结果可知，乙酸乙酯萃取最优pH为1～2，选定pH＝2。

表1不同pH条件下乙酸乙酯对绿原酸的萃取率

实施例3：杜仲叶提取物与溶剂料液比的选择

分别称取杜仲叶提取物8、16、40、80、160和240mg，用800μL乙酸乙酯饱和过的pH＝2的水溶液溶解，再用等体积的乙酸乙酯萃取，分别用HPLC测定上下相的绿原酸含量，计算萃取率(表2)。最终选定杜仲叶提取物与水的质量(W)体积(V)比(mg/mL)为10：1。

表2不同浓度的杜仲叶粗提物乙酸乙酯对绿原酸的萃取率

实施例4：水萃取pH的选择

取实施例2的乙酸乙酯萃取液，分别用pH＝7、8、9和10的去离子水萃取，用HPLC分别测定上下相的绿原酸含量，计算萃取率(表3)。通过结果可知，水萃取最优pH为8～10，最终选定pH＝9。

表3不同pH条件下水对绿原酸的萃取率

实施例5：大孔树脂的选择

杜仲绿原酸萃取液是称取2g杜仲提取物(水提物)，溶于200mL水溶液中，调节pH＝2，然后用等体积的乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯相，调节pH＝9，用等体积的水萃取，调节pH＝2，得到杜仲萃取液。

选取HPD400、HPD500、D101、NKA-9、LS-21和HP-20六种大孔吸附树脂，测定其吸附率解吸率(表4)，具体方法如下：称取HPD400、HPD500、D101、NKA-9、LS-21和HP-20各1g(树脂重量W)，加入40mL(体积V₁)杜仲绿原酸萃取液(绿原酸浓度为C_o)，放置恒温培养箱摇床振荡24h，过滤，用HPLC测定滤液浓度(绿原酸浓度为C_e)。吸附好的树脂中加入40mL(体积V₂)50％乙醇溶液，放置恒温培养箱振荡24h，过滤，用HPLC测定滤液浓度(绿原酸浓度C_d)。吸附率计算公式：E％＝(C_o-C_e)/C_o×100％，解吸率计算公式：D％＝(C_d×V₂)/(C_o-C_e)×V₁×100％。通过测定计算得到各树脂的吸附率解吸率(表4)，选定最优大孔树脂为HP-20。

表4不同型号的大孔吸附树脂对绿原酸的吸附率和解吸率

实施例6：萃取纯化工艺的实施

以杜仲叶提取物为原料，加入10：1倍(M:V)的去离子水，振荡超声使其充分溶解，加入盐酸调节pH为2，用等体积的乙酸乙酯萃取5次，合并乙酸乙酯萃取液，再用pH为9的水溶液萃取3次，水相真空干燥得到萃取产物。经HPLC含量检测(图2)其纯度为65％。

实施例7：大孔树脂分离工艺的实施

取上述实施例6得到的萃取产物，用去离子水溶解完全，调节pH为2，然后用HP-20大孔树脂分离，先用2个柱体积的去离子水洗脱，然后用4个柱体积的20％乙醇溶液洗脱，最后用2个柱体积的乙醇洗脱。合并20％乙醇洗脱液，真空干燥得到大孔树脂分离产物，经HPLC含量检测(图3)其纯度为97％。

实施例8：高速逆流色谱纯化工艺的实施

配制乙酸乙酯/正丁醇/水(体积比4：1：5)溶剂系统，取实施例6得到的萃取产物浸膏，取等体积的上下相溶解。流速4mL/min，转速1000rpm，用高速逆流色谱纯化，真空干燥得到高速逆流色谱纯化产物，经HPLC含量检测(图4)其纯度为99％。

Claims

1.一种绿原酸提取纯化方法，其特征在于，包括以杜仲叶提取物为原料，水和乙酸乙酯为萃取相，原料经萃取相萃取依次去除水溶性杂质和脂溶性杂质得到水萃取相，水萃取相通过大孔树脂分离纯化或高速逆流色谱纯化得到绿原酸。

2.根据权利要求1所述的绿原酸提取纯化方法，其特征在于，所述的去除水溶性杂质和脂溶性杂质包括：调节萃取相中的乙酸乙酯相呈酸性，萃取溶解在水相中的杜仲叶提取物，去除水溶性杂质得到乙酸乙酯萃取相，再通过碱性水相反萃乙酸乙酯萃取相，去除脂溶性杂质得到水萃取相。

3.根据权利要求2所述的绿原酸提取纯化方法，其特征在于，所述的酸性为pH＝1～2；所述的碱性为pH＝8～10。

4.根据权利要求2所述的绿原酸提取纯化方法，其特征在于，所述的溶解在水相中的杜仲叶提取物中，杜仲叶提取物(mg)与水(mL)的比例为10:1。

5.根据权利要求2、3或4所述的绿原酸提取纯化方法，其特征在于，所述调节萃取相中的乙酸乙酯相呈酸性通过盐酸或硫酸调节；所述的碱性水相为含有氨水的水相。

6.根据权利要求1、2、3或4所述的绿原酸提取纯化方法，其特征在于，所述的杜仲叶提取物为杜仲叶的水提取物。

7.根据权利要求1、2、3或4所述的绿原酸提取纯化方法，其特征在于，所述杜仲叶提取物为杜仲叶的水提取物；杜仲叶的水提取物是以水为提取溶剂，60℃加热2h，重复提取2次，干燥处理得到杜仲叶提取物。

8.根据权利要求1、2、3或4所述的绿原酸提取纯化方法，其特征在于，所述水萃取相通过大孔树脂分离纯化包括：调节水萃取相pH＝2，用HP-20树脂分离，分离条件为：2倍柱体积的水洗脱，4倍柱体积的体积百分浓度为20％的乙醇溶液洗脱，再用2倍柱体积乙醇洗脱，合并20％乙醇溶液洗脱部分，干燥处理得到绿原酸。

9.根据权利要求1、2、3或4所述的绿原酸提取纯化方法，其特征在于，所述水萃取相通过高速逆流色谱分离纯化包括：按体积比计，乙酸乙酯/正丁醇/水＝4：1：5为分离溶剂体系，流速4mL/min，转速1000rpm，进行高速逆流色谱纯化和干燥处理得到高速逆流色谱纯化产物。

10.权利要求1-9任一权利要求所述的绿原酸提取纯化方法得到的绿原酸用于制备化妆品添加剂或食品添加剂的应用。