CN104151372B - 单唾液酸四已糖神经节苷脂gm1原料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单唾液酸四已糖神经节苷脂钠GM1原料的制备方法，包括如下步骤：a. 取冻存新鲜猪脑，解冻，清洗，匀浆，将浆液加入浓盐酸搅匀、然后离心分离，即得沉淀脑蛋白；b. 将沉淀蛋白加入甲醇进行匀浆，然后搅拌，离心过滤，即得醇提液；c. 将醇提液浓缩，得醇提浓缩液；d. 将经上述步骤得到的醇提浓缩液，水解，然后离心分离，收集上清液，即得水解液；e. 将水解液连续多次循环超滤，截留分子量为1600道尔顿以上的物质，得GM1的初纯品，再将GM1的初纯品超滤，去除分子量为1500道尔顿以下的物质，既得GM1溶液纯品；f. 将GM1溶液纯品干燥，即得单唾液酸四已糖神经节苷脂钠GM1原料。
Description
技术领域
本发明涉及一种单唾液酸四已糖神经节苷脂GM1原料的制备方法。
背景技术
单唾液酸四已糖神经节苷脂GM1广泛存在于哺乳类动物大脑细胞膜表面和中枢神经组织中。单唾液酸四已糖神经节苷脂GM1对神经系统损伤后的修复、促进神经的生长和再生、促进神经支配功能的恢复、保护神经细胞膜等都有积极的作用。
目前获取单唾液酸四已糖神经节苷脂GM1的方法是从动物脑组织中提取分离。然而，神经节苷脂种类多，在脑组织中含量少，特别是其分子组成、结构物理化学性质等因素十分相近，所以高纯度GM1的提取分离难度大，特别是大规模工业化提取工艺还未见有报道和应用。到目前为止，国内GM1提取分离的工艺主要有Momoi.T方法和利用微生物转化的方法或者用硅胶柱从混合神经节苷脂中分离，成本太高，难以大规模应用于临床，操作步骤繁琐、工艺复杂、并消耗大量有机溶剂，提取的GM1含量仅为脑组织含量的万分之一，而且纯度不高、仅为99%。
本领域技术人员渴望获得一种成本低、纯度更高、能大规模工业化提取的单唾液酸四已糖神经节苷脂GM1原料，但一直没有解决这个技术问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是提供一种成本低、纯度更高、适于大规模工业化应用的单唾液酸四已糖神经节苷脂GM1原料的制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明的单唾液酸四已糖神经节苷脂GM1原料的制备方法，包括如下步骤：
a.取冻存新鲜猪脑，加水浸泡自然解冻，再用水清洗，然后加入猪脑重2-5倍重量的纯化水用胶体磨匀浆10min，将匀浆所得浆液倒入提取罐中加热至80-85℃后保温10-20min，再按猪脑重每1kg加入2-5 ml的比例加入浓度为12mol/L的浓盐酸搅匀、冷却至20-50℃，再以3500-4000r/min的速度离心分离5min，然后去除上层乳浊液，收集沉淀物，即得纯化脑蛋白；
b. 将经上述步骤得到的纯化脑蛋白加入甲醇进行匀浆，再用氢氧化钠调pH值为7-9，然后搅拌，离心过滤，收集上清液，即得醇提液；
c. 将经上述步骤得到的醇提液浓缩，得醇提浓缩液；
d. 将经上述步骤得到的醇提浓缩液，调pH值为2-5，水解，然后离心分离，收集上清液，即得水解液；
e. 将经上述步骤所得水解液连续多次循环超滤，截留分子量为1600道尔顿以上的物质，得GM1的初纯品，再将GM1的初纯品超滤，去除分子量为1500道尔顿以下的物质，既得GM1溶液纯品；
f. 将经上述步骤所得GM1溶液纯品干燥，即得单唾液酸四己糖神经节苷脂GM1原料。
所述b步骤，将经a步骤所得纯化脑蛋白按猪脑重量3-6倍的比例加入浓度为75-95%的甲醇，胶体磨匀浆1次，倒入提取罐中，用6mol/L氢氧化钠调pH值为7-9，加热保温至40-60℃搅拌3-8h，再以3500-4000r/min的速度离心分离5min，弃沉淀，收集上清液，即得醇提液。
所述c步骤，将经b步骤所得醇提液，60-80℃条件下真空减压浓缩至猪脑重量的1/3-1/5，即得醇提浓缩液。
所述d步骤，将经c步骤所得醇提浓缩液，用6mol/L盐酸溶液调pH值为2-5，60-80℃条件下水解3-5h，然后冷却至20-50℃，以3500-4000r/min的速度离心分离5min，弃沉淀，收集上清液，再用6mol/L氢氧化钠溶液调pH值为7-8，即得水解液。
所述e步骤，将d步骤所得水解液置于能截留分子量为1600道尔顿的中空纤维超滤膜内进行连续多次循环超滤，截留分子量为1600道尔顿以上的物质，得GM1的初纯品，再将GM1的初纯品置于能够截留分子量为1500道尔顿的中空纤维超滤膜中超滤，去除分子量为1500道尔顿以下的物质，得GM1溶液纯品。
所述f步骤，将e步骤所得GM1溶液纯品以﹣60℃冷冻干燥或喷雾干燥，即得单唾液酸四己糖神经节苷脂GM1原料。
本发明的方法利用ph梯度的极性有机溶剂少量的甲醇，经调整ph值和温度、能高效地将GM1从猪脑组织中经过纯化蛋白、醇提、浓缩、水解、提纯、干燥步骤处理，所提取的GM1含量达到猪脑组织含量的千分之一，纯度可达99.9%以上，详见附图，其各项质量指标都符合相关标准要求；且有机溶剂用量少、工艺简单、周期短，因而成本低。
本发明的方法简单可控，能适用于大批量制备单唾液酸四已糖神经节苷脂GM1原料，能够一次性处理大量猪脑组织，纯化量大，可以进行规模化生产，适于大规模工业化应用。
采用本发明的方法制备的单唾液酸四已糖神经节苷脂GM1原料可以用于制备医用注射液、冻干粉针及口服制剂等。
附图说明
图1是本发明方法制备的单唾液酸四已糖神经节苷脂GM1原料的GM1含量HPLC色谱图。
具体实施方式
下面详细说明本发明方法的实施方式，但不仅限于以下实施例。
实施例一
本发明的单唾液酸四已糖神经节苷脂GM1原料的制备方法包括如下步骤：
a. 取冻存新鲜猪脑50Kg，加水浸泡自然解冻，再用水清洗，然后加入100kg纯化水用胶体磨匀浆10min，将匀浆所得浆液倒入提取罐中加热至80℃后保温10min，再加入150ml的比例加入浓度为12mol/L的浓盐酸搅匀、冷却至20℃，再以3500r/min的速度离心分离5min，然后去除上层乳浊液，收集沉淀物，即得纯化脑蛋白；
b. 将经a步骤所得纯化蛋白加入150kg浓度为75%的甲醇，胶体磨匀浆1次，倒入提取罐中，用6mol/L氢氧化钠调pH值为7，加热保温至40℃搅拌3h，再以3500r/min的速度离心分离5min，弃沉淀，收集上清液，即得醇提液；
c. 将经b步骤所得醇提液，60℃条件下真空减压浓缩至17kg，即得醇提浓缩液；
d. 将经c步骤所得醇提浓缩液，用6mol/L盐酸溶液调pH值为2，60℃条件下水解3h，然后冷却至20℃，以3500r/min的速度离心分离5min，弃沉淀，收集上清液，用6mol/L氢氧化钠溶液调pH7.5，即得水解液；
e. 将d步骤所得水解液置于能截留分子量为1600道尔顿的中空纤维超滤膜内进行连续5次循环超滤，截留分子量为1600道尔顿以上的物质，得GM1的初纯品，再将GM1的初纯品置于能够截留分子量为1500道尔顿的中空纤维超滤膜中超滤，去除分子量为1500道尔顿以下的物质，得GM1溶液纯品；
f. 将e步骤所得GM1溶液纯品置于冷冻干燥机中以﹣60℃冷冻干燥，即得单唾液酸四已糖神经节苷脂GM1原料。
实施例二
a. 取冻存新鲜猪脑50Kg，加水浸泡自然解冻，再用水清洗，然后加入100kg纯化水用胶体磨匀浆10min，将匀浆所得浆液倒入提取罐中加热至85℃后保温15min，再加入250ml的比例加入浓度为12mol/L的浓盐酸搅匀、冷却至35℃，再以3800r/min的速度离心分离5min，然后去除上层乳浊液，收集沉淀物，即得纯化脑蛋白；
b. 将经a步骤所得纯化蛋白加入250kg浓度为75%的甲醇，胶体磨匀浆1次、10min，倒入提取罐中，用6mol/L氢氧化钠调pH值为8.5，加热保温至52℃搅拌6h，再以3800r/min的速度离心分离5min，弃沉淀，收集上清液，即得醇提液；
c. 将经b步骤所得醇提液，70℃条件下真空减压浓缩至12.5kg，即得醇提浓缩液；
d. 将经c步骤所得醇提浓缩液，用6mol/L盐酸溶液调pH值为3.5，75℃条件下水解4h，然后冷却至30℃，以3800r/min的速度离心分离5min，弃沉淀，收集上清液，用6mol/L氢氧化钠溶液调pH7.6，即得水解液；
e. 将d步骤所得水解液置于能截留分子量为1600道尔顿的中空纤维超滤膜内进行连续6次循环超滤，截留分子量为1600道尔顿以上的物质，得GM1的初纯品，再将GM1的初纯品置于能够截留分子量为1500道尔顿的中空纤维超滤膜中超滤，去除分子量为1500道尔顿以下的物质，得GM1溶液纯品；
f. 将e步骤所得GM1溶液纯品置于冷冻干燥机中以﹣60℃冷冻干燥，即得单唾液酸四已糖神经节苷脂GM1原料。
实施例三
a. 取冻存新鲜猪脑50Kg，加水浸泡自然解冻，再用水清洗，然后加入200kg纯化水用胶体磨匀浆10min，将匀浆所得浆液倒入提取罐中加热至85℃后保温20min，再加入250ml的比例加入浓度为12mol/L的浓盐酸搅匀、冷却至50℃，再以4000r/min的速度离心分离5min，然后去除上层乳浊液，收集沉淀物，即得纯化脑蛋白；
b. 将经a步骤所得纯化蛋白加入300kg浓度为95%的甲醇，胶体磨匀浆1次、10min，倒入提取罐中，用6mol/L氢氧化钠调pH值为9，加热保温至60℃搅拌8h，再以4000r/min的速度离心分离5min，弃沉淀，收集上清液，即得醇提液；
c. 将经b步骤所得醇提液，80℃条件下真空减压浓缩至10kg，即得醇提浓缩液；
d. 将经c步骤所得醇提浓缩液，用6mol/L盐酸溶液调pH值为3.8，80℃条件下水解5h，然后冷却至50℃，以4000r/min的速度离心分离5min，弃沉淀，收集上清液，用6mol/L氢氧化钠溶液调pH7.5，即得水解液；
e. 将d步骤所得水解液置于能截留分子量为1600道尔顿的中空纤维超滤膜内进行连续6次循环超滤，截留分子量为1600道尔顿以上的物质，得GM1的初纯品，再将GM1的初纯品置于能够截留分子量为1500道尔顿的中空纤维超滤膜中超滤，去除分子量为1500道尔顿以下的物质，得GM1溶液纯品；
f. 将e步骤所得GM1溶液纯品置于喷雾干燥机以180℃喷雾干燥，即得单唾液酸四已糖神经节苷脂GM1原料。
上述例举了3个典型的实施例，但不限于这些实施例。申请人经过反复试验得到本发明的方法，方法简单可控，并按照该方法进行了反复的试验，所制备的单唾液酸四已糖神经节苷脂GM1原料都符合相关标准要求，试验数据详见下表。
Claims (6)
1.一种单唾液酸四己糖神经节苷脂GM1原料的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
a.取冻存新鲜猪脑，加水浸泡自然解冻，再用水清洗，然后加入猪脑重2-5倍重量的纯化水用胶体磨匀浆10min，将匀浆所得浆液倒入提取罐中加热至80-85℃后保温10-20min，再按猪脑重每1kg加入2-5 ml的比例加入浓度为12mol/L的浓盐酸搅匀、冷却至20-50℃，再以3500-4000r/min的速度离心分离5min，然后去除上层乳浊液，收集沉淀物，即得纯化脑蛋白；
b. 将经上述步骤得到的纯化脑蛋白加入甲醇进行匀浆，再用氢氧化钠调pH值为7-9，然后搅拌，离心过滤，收集上清液，即得醇提液；
c. 将经上述步骤得到的醇提液浓缩，得醇提浓缩液；
d. 将经上述步骤得到的醇提浓缩液，调pH值为2-5，水解，然后离心分离，收集上清液，即得水解液；
e. 将经上述步骤所得水解液连续多次循环超滤，截留分子量为1600道尔顿以上的物质，得GM1的初纯品，再将GM1的初纯品超滤，去除分子量为1500道尔顿以下的物质，即得GM1溶液纯品；
f. 将经上述步骤所得GM1溶液纯品干燥，即得单唾液酸四己糖神经节苷脂GM1原料。
2.根据权利要求1所述单唾液酸四己糖神经节苷脂GM1原料的制备方法，其特征在于：所述b步骤，将经a步骤所得纯化脑蛋白按猪脑重量3-6倍的比例加入浓度为75-95%的甲醇，胶体磨匀浆1次，倒入提取罐中，用6mol/L氢氧化钠调pH值为7-9，加热保温至40-60℃搅拌3-8h，再以3500-4000r/min的速度离心分离5min，弃沉淀，收集上清液，即得醇提液。
3.根据权利要求1所述单唾液酸四己糖神经节苷脂GM1原料的制备方法，其特征在于：所述c步骤，将经b步骤所得醇提液，60-80℃条件下真空减压浓缩至猪脑重量的1/3-1/5，即得醇提浓缩液。
4.根据权利要求1所述单唾液酸四己糖神经节苷脂GM1原料的制备方法，其特征在于：所述d步骤，将经c步骤所得醇提浓缩液，用6mol/L盐酸溶液调pH值为2-5，60-80℃条件下水解3-5h，然后冷却至20-50℃，以3500-4000r/min的速度离心分离5min，弃沉淀，收集上清液，再用6mol/L氢氧化钠溶液调pH值为7-8，即得水解液。
5.根据权利要求1所述单唾液酸四己糖神经节苷脂GM1原料的制备方法，其特征在于：所述e步骤，将d步骤所得水解液置于能截留分子量为1600道尔顿的中空纤维超滤膜内进行连续多次循环超滤，截留分子量为1600道尔顿以上的物质，得GM1的初纯品，再将GM1的初纯品置于能够截留分子量为1500道尔顿的中空纤维超滤膜中超滤，去除分子量为1500道尔顿以下的物质，得GM1溶液纯品。
6.根据权利要求1所述单唾液酸四己糖神经节苷脂GM1原料的制备方法，其特征在于：所述f步骤，将e步骤所得GM1溶液纯品以﹣60℃冷冻干燥或喷雾干燥，即得单唾液酸四己糖神经节苷脂GM1原料。
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