CN103087120B

CN103087120B - 单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN103087120B
Application number: CN201310059889.6A
Authority: CN
Inventors: 黄晓霞; 屈英薇; 张洋
Original assignee: Changchun Xiangtong Pharmaceutical Co Ltd; Beijing Sihuan Pharmaceutical Co Ltd; Beijing Ao He Research Institute Co Ltd
Current assignee: Changchun Xiangtong Pharmaceutical Co Ltd; Beijing Sihuan Pharmaceutical Co Ltd; Beijing Ao He Research Institute Co Ltd
Priority date: 2013-02-26
Filing date: 2013-02-26
Publication date: 2015-12-02
Anticipated expiration: 2033-02-26
Also published as: CN103087120A

Abstract

本发明涉及单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法及其应用。该方法以阳离子树脂（优选为Dowex？50）为介质，在含有氯仿的酸性混合水溶液中，将动物脑组织来源的神经节苷脂混合物转化为富含GM1的混合物，所得转化产物中GM1的含量由转化前的7-10％提高到72-80％，进而减少7-12倍的动物脑组织用量（生产相同量的GM1），显著降低生产成本。

Description

单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法及其应用。

背景技术

神经节苷脂(ganglioside，Gls)是一类含唾液酸的膜糖脂/鞘糖脂，由亲水的寡糖链和亲脂的神经酰胺两部分组成。神经节苷脂位于神经元细胞的双层结构外层，为大多数哺乳动物细胞膜的组成成分和大脑形成记忆的重要物质，因其最早被发现于神经节细胞而得名。

单唾液酸四己糖神经节苷脂（Monosialotetrahexosylganglioside，GM1）为乳白色粉末，无味，有吸湿性，分子量为1551（GM1钠盐的分子量为1574），溶于水、甲醇-水、甲醇-氯仿，不溶于甲醇、丙酮、氯仿、乙醚，熔点为207-230℃，其紫外吸收最大波长位于205nm，可通过氨基正相高效液相色谱和薄层色谱（TLC）进行纯度鉴定，气相色谱可鉴定GM1分子中的糖基和神经酰胺残基。

能嵌入神经细胞膜，模仿内源性神经节苷脂的某些功能，调节膜介导的细胞功能，并刺激中枢神经系统损伤后潜在的代替机制而阻止损害的发生，保护未受损的神经组织，还能影响体外培养的神经元生长及其活性，促进其存活及生长。神经节苷酯GM1在神经系统的主要生理作用包括：1）促进神经细胞的生长、分化发育和神经再生；2）参与突触传递，维持脑的正常机能，参与各种记忆活动；3）在细胞与细胞、细胞与微生物、细胞与基质间的相互作用中起到介导作用；4）调节细胞膜中各种蛋白质功能，如离子通道、表皮生长因子受体等。

能通过血脑屏障，注射后快速在大脑和脊髓组织中分布，临床治疗效果十分显著，主要用于治疗血管性中枢神经系统疾病或创伤性中枢神经系统疾病，如脑卒中、脊髓损伤、脑外伤、各种慢性病后期的神经功能障碍、脑萎缩、阿尔茨海默病、帕金森氏病、脑血管意外、智力障碍等。意大利Fidia公司从牛脑组织中提取的GM1注射液（商品名Sygen）已于20世纪90年代在我国销售。

哺乳动物脑组织中主要包括GM1、GD1a、GD1b和GT1b等神经节苷脂成分。这些成分中的寡糖链和神经酰胺部分结构一致，主要差异在于寡糖链上唾液酸分子的位置和数量。其中，GD1a和GD1b的糖链上有两个唾液酸，但各自位置不同；GT1b的糖链上有三个唾液酸；GM1的糖链上有一个唾液酸。GD1a、GD1b和GT1b寡糖链上的唾液酸基团在酸性或酶催化条件下可降解，进而制得GM1。

公开了单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法，该方法使用混合溶剂（氯仿：甲醇：水的体积比为1:2:0.75）从哺乳动物脑组织中提取总神经节苷酯，浓缩总神经节苷酯提取液后再进行酸水解（pH3.0-5.0）以提高GM1含量，浓缩水解产物经脱盐后溶解于混合溶剂（氯仿：甲醇：水的体积比为1:2:1.4）中进行阴离子交换柱层析（如Q-SepharoseF.F.或DEAE-Sepharose），其中，脑组织与混合溶剂的体积比为1：20，收集含GM1的洗脱峰，浓缩后再进行反相柱层析（SourcRPC30），所得GM1于冷丙酮中沉淀，收集沉淀，干燥，即得。该文献报道的GM1纯度大于98%，但存在操作复杂、制造成本高，难于工业化生产等缺陷。

目前，GM1主要来源于动物脑组织，从动物脑组织中提取总神经节苷酯混合物的方法业已成熟稳定，GM1产率的增加关键在于提高神经节苷脂混合物中其他神经节苷脂转化为GM1的转化率。多采用微生物转化法和无机酸转化法来提高神经节苷脂GM1的产率。微生物转化法是从土壤中筛选培养具备降解唾液酸活性的微生物菌落，使其与神经节苷脂混合物共同发酵培养，微生物在代谢过程中表达一种具备唾液酸降解活性的蛋白酶，专一高效地实现神经节苷脂的转化。然而，天然微生物在与神经节苷脂共同孵化培育过程中，会产生大量的菌体异源蛋白质和异源DNA，进而导致严重的用药安全隐患。无机酸转化法则在神经节苷脂混合物溶液中加入盐酸、硫酸或磷酸，调节pH值至3.0-5.0，保温反应，即可。该方法操作简单，所用化学试剂安全可靠，普遍用于GM1的生产。然而，该方法存在由神经节苷脂转化为GM1的效率不理想，实际转化率仅有理论转化率的60％左右，约有40％的GM1被过度酸化为脱唾液酸神经节苷脂GA1。

公开了一种转化神经节苷脂GM1的方法，该方法将神经节苷脂混合物用pH值3.0-5.0、浓度为10-50mmol/L的乙酸-乙酸钠缓冲溶液溶解为50-150g/L的溶液，以神经节苷酯质量计，在神经节苷脂混合物水溶液中加入30-50%经酸活化处理的阳离子树脂，再在55-75℃低速搅拌0.5-2.0小时，抽滤，浓缩，冷丙酮沉淀，收集沉淀，干燥，即得。该方法将神经节苷脂混合物中GM1的含量由7-10％提高到30-35％。

目前，通过化学合成手段制备神经节苷脂GM1存在难以克服的实际困难。因此，研究安全高效地将神经节苷脂混合物转化为GM1的制备方法具有十分重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法，包括下述步骤：

(1)将神经节苷脂混合物用乙醇、水、氯仿组成的混合溶剂溶解为浓度50-150g/L的混合溶液，调pH值2.0-3.0，搅拌混匀，制得神经节苷脂混合物溶液，其中，所述的神经节苷脂混合物选自牛脑神经节苷酯混合物、猪脑神经节苷脂混合物的任一种或其组合，所述混合溶剂中水：乙醇：氯仿的体积比为60-30:8-2:1；

(2)将阳离子树脂用纯净水漂洗干净，沥干水分后，再用5％的HCl溶液浸泡3h-5h后，用纯净水漂洗至中性，沥干水分，制得酸活化处理后的阳离子树脂，其中，优选所述的阳离子树脂为强酸性阳离子交换树脂，更优选为Dowex50；

(3)以神经节苷脂混合物的质量计，在步骤1）制得的神经节苷脂混合物溶液中加入10-30％的阳离子树脂，升温至60℃-80℃，搅拌，反应1h-4h，调节pH值至7.5-9.0，制得神经节苷脂混合物的酸水解液；

（4）收集神经节苷脂混合物的酸水解液中的上清液，将其浓缩至400-600g/L，在浓缩液中加入浓缩液体积量7-9倍的冷丙酮，搅拌，静置过夜，收集沉淀，干燥，即得。

本发明的优选技术方案中，步骤1）中混合溶液的浓度为100g/L。

本发明的优选技术方案中，步骤1）中所述混合溶剂中水：乙醇：氯仿的体积比为45:5:1。

本发明的优选技术方案中，步骤1）中调节pH值的物质选自盐酸、硫酸、硝酸、醋酸、甲酸的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，步骤1）中所述混合溶液的pH值优选为2.4-2.8。

本发明的优选技术方案中，以神经节苷脂混合物的质量计，在步骤3）制得的神经节苷脂混合物溶液中加入20％的阳离子树脂。

本发明的优选技术方案中，步骤3）中的温度为65℃-68℃。

本发明的优选技术方案中，步骤3）中调节pH值的物质选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、磷酸钠、碳酸钾、磷酸钾的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，步骤4）中将神经节苷脂混合物的酸水解液中的上清液的浓缩至500g/L。

本发明的另一目的在于提供单唾液酸四己糖神经节苷脂，所述的单唾液酸四己糖神经节苷脂由本发明所述的制备方法制备得到，其中，单唾液酸四己糖神经节苷脂的含量为72%-80%。

本发明的另一目的在于提供单唾液酸四己糖神经节苷脂在制备治疗血管性中枢神经系统疾病或创伤性中枢神经系统疾病药物中的应用。

本发明的优选技术方案中，所述的血管性中枢神经系统疾病或创伤性中枢神经系统疾病选自脑卒中、脊髓损伤、脑外伤、各种慢性病后期的神经功能障碍、脑萎缩、阿尔茨海默病、帕金森氏病、脑血管意外、智力障碍的任一种或其组合。

为了清楚地表述本发明的保护范围，本发明对术语进行如下界定：

本发明用正相氨基柱检测法(参见文献：郑永彪等.离子对高效液相色谱法分离测定单唾液酸神经节苷脂的含量[J].药物分析杂志，2004，(2).)检测单唾液酸四己糖神经节苷脂的含量。

本发明所述的神经节苷脂混合物是指通过常规技术手段从动物脑组织主要是牛脑组织或猪脑组织获取的神经节苷脂混合物。神经节苷脂混合物成分主要为GM1、GD1b、GD1a和GT1b，其中GM1的含量占神经节苷脂混合物总量的7～10％，GD1b、GD1a和GT1b的总量占神经节苷脂混合物总量的80-87%。

本发明所述的阳离子树脂是指本领域常用的可用于催化酸水解反应的阳离子树脂，优选所述的阳离子树脂为强酸性阳离子交换树脂，更优选为Dowex50型阳离子树脂。

除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。

与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：

1、本发明改进单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法，以阳离子树脂（优选为Dowex50）为介质，在含有氯仿的酸性混合水溶液中，将动物脑组织来源的神经节苷脂混合物转化为富含GM1的混合物，所得转化产物中GM1的含量由转化前的7-10％提高到72-80％，进而减少7-12倍的动物脑组织用量（生产相同量的GM1），显著降低生产成本。

、本发明使用成本低廉的酸（如盐酸、硫酸、硝酸、醋酸、甲酸的任一种或其组合）进行酸水解，且降低了阳离子树脂的使用量，提高了产率（提高35-50%），降低了成本（成本下降35-60%）。

、本发明的制备方法具有工艺简便，适于工业化生产等优点。

具体实施方式

以下将结合实施例具体说明本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质。

实施例1猪脑神经节苷酯混合物的制备

猪脑神经节苷脂混合物的制备方法，包括如下步骤：

1）将新鲜猪脑组织经5000rpm离心去除游离水，用胶体磨粉碎后，3000r/min高速匀浆30min，成乳胶状后，注入提取罐中并加入10倍体积的甲醇：水的体积比为2：0.8的甲醇水溶液，2℃搅拌12h，制得提取液；

2）将提取液过滤，收集滤液经大孔吸附树脂D-101层析柱分离纯化，用甲醇：水的体积比为1：2的甲醇水溶液洗除杂质，再用无水甲醇洗脱，收集含有神经节苷脂混合物的洗脱液；

3）将神经节苷脂混合物的洗脱液在40℃真空浓缩，并经-20℃冷冻干燥后，按照本发明所述的检测方法，制得GM1含量为7-10%的神经节苷酯混合物。

实施例2单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法

单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法，包括下述步骤：

（1）取实施例1制得的神经节苷脂混合物1000克，将其溶解于10升由水、乙醇和氯仿组成的混合溶剂，用盐酸调节pH值2.5，搅拌混匀，制得神经节苷脂混合物溶液，其中，所述混合溶剂中水：乙醇：氯仿的体积比为45:5:1；

（2）将阳离子树脂（Dowex50）用纯净水漂洗干净，沥干水分，用5％的HCl溶液浸泡3h，再用纯净水漂洗至中性，沥干水分，制得酸活化处理后的阳离子树脂（Dowex50）；

（3）称取200克酸活化处理后的阳离子树脂（Dowex50），将其加入到步骤（1）中制得的神经节苷脂混合溶液中；水浴升温至75℃，搅拌反应2h，用8mol/LNaOH溶液调节pH值至9.0，制得神经节苷酯混合物转化液；

（4）抽滤步骤（3）制得的神经节苷酯混合物转化液，滤渣用纯净水淋洗，合并滤液，将滤液在85℃真空减压浓缩至500g/L，待浓缩液冷却至室温后，加入浓缩液体积8倍量的冷丙酮，搅拌，静置过夜，滤过，收集沉淀，70℃鼓风干燥8h，得干品950克，收率为95%。

采用本发明所述的正相氨基柱检测法测定所得产品中GM1的纯度为79.6％。

实施例3-5单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法

实施例3-5制备GM1的方法和步骤基本同实施例2，不同之处见表1。

表1

	实施例3	实施例4	实施例5
				乙醇、水、氯仿的体积比	30:8:1	60:2:1	50:3:1
步骤（1）中反应液pH值	2.4	2.8	2.6
				产品收率（％）	95%	93%	96%
所得产品中GM1纯度(％)	73.1	72.1	78.4

Claims

1.一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法，包括下述步骤：

(2)将阳离子树脂用纯净水漂洗干净，沥干水分后，再用5％的HCl溶液浸泡3h-5h后，用纯净水漂洗至中性，沥干水分，制得酸活化处理后的阳离子树脂；所述的阳离子树脂为强酸性阳离子交换树脂；

（4）收集神经节苷脂混合物的酸水解液中的上清液，将其浓缩至400-600g/L，在浓缩物中加入浓缩物体积的7-9倍量的冷丙酮，将浓缩物沉淀过夜，收集沉淀，干燥，即得。

2.根据权利要求1所述的制备方法，步骤1）中调节pH值的物质选自盐酸、硫酸、硝酸、醋酸、甲酸的任一种或其组合。

3.根据权利要求1所述的制备方法，步骤3）中调节pH值的物质选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、磷酸钠、碳酸钾、磷酸钾的任一种或其组合。

4.根据权利要求1所述的制备方法，步骤1）中所述混合溶液的浓度为100g/L。

5.根据权利要求1所述的制备方法，步骤1）中所述混合溶液的pH值为2.4-2.8。

6.根据权利要求1所述的制备方法，步骤1）中所述混合溶剂中水：乙醇：氯仿的体积比为45:5:1。

7.根据权利要求1所述的制备方法，步骤2）中所述的阳离子树脂为Dowex50。

8.根据权利要求1所述的制备方法，步骤3）中所述神经节苷脂混合物溶液中加入20％的阳离子树脂。

9.根据权利要求1所述的制备方法，步骤3）中所述加入阳离子树脂后升温至65℃-68℃。

10.根据权利要求1所述的制备方法，步骤4）中将神经节苷脂混合物的酸水解液中的上清液浓缩至500g/L。