CN102020684A

CN102020684A - 一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的提取方法

Info

Publication number: CN102020684A
Application number: CN200910177575XA
Authority: CN
Inventors: 胡增荣
Original assignee: Heilongjiang Harbin Medical University Pharm Co Ltd
Current assignee: Heilongjiang Harbin Medical University Pharm Co Ltd
Priority date: 2009-09-16
Filing date: 2009-09-16
Publication date: 2011-04-20

Abstract

一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的提取方法。该工艺步骤主要包括：采用分离糖类等同时具有亲水、亲脂性的天然产物的大孔树脂，吸附法分离脑组织总提物中的G1_S，用普通硅胶柱层析分离出了高质量的单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)干粉，由于硅胶柱层析后的产品依旧存在不同的金属离子杂质，所以使用阳离子交换柱进一步离子交换。该工艺经过对传统方法的改进后，节省大量溶剂和时间，提高了产率，大幅度降低了成本。

Description

一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的提取方法

技术领域

本发明涉及药品的制备方法，具体是从猪脑、牛脑、水牛脑做为提取原料，提取单唾液酸四己糖神经节苷脂的一种方法。

背景技术

单唾液酸四己糖神经节苷脂能促进由于各种原因引起的中枢神经系统损伤的功能恢复。作用机理是促进“神经重构”(包括神经细胞的生存、轴突生长和突触生成)。单唾液酸四己糖神经节苷脂对损伤后继发性神经退化有保护作用。应用单唾液酸四己糖神经节苷脂后对脑血流动力学参数的改善和损伤后脑水肿的减轻有良好的影响。单唾液酸四己糖神经节苷脂通过改善细胞膜酶的活性减轻神经细胞水肿。动物实验显示单唾液酸四己糖神经节苷脂可改善帕金森病所致的行为障碍。

LD₅₀是872mg/kg(i.v.)至＞8g/kg(s.c.)，取决于动物种类和给药途径。各种动物进行的亚急性和慢性毒性试验、致畸试验、生殖毒性试验、围产期毒性试验以及诱变性试验均未显示本品的任何毒性作用。

实验表明，本品无明显血管和肌肉刺激性，亦无溶血和过敏反应。

国内、外已有大量文献报道本品广泛用于治疗脊髓损伤及变性疾病、脑缺血性疾病、帕金森氏病、周围神经疾病、腰椎间盘突出术后。另外，本品也试用治疗糖尿病性、酒精中毒性、尿毒症性及其它中毒性周围神经病变的治疗，并取得了比较满意的疗效。

目前，随着我国社会经济的增长以及人口老龄化程度越来越高，脑血管意外的发病率正逐年上升，交通的发达和意外损伤等因素也使脑脊髓损伤的发生增多。不仅危及患者的生命，更严重的是伤后神经功能不能很好的恢复，常常给患者及家属带来沉重的负担，而目前除了在急性期给予对症支持治疗，恢复期利用神经营养药物及功能锻炼外，几乎没有什么特效药。

因此，国内外许多专家学者对此进行了大量的研究，从而单唾液酸四己糖神经节苷脂-GM1应运而生，为这些患者带来了希望的曙光。

神经节苷脂是含唾液酸的糖神经鞘脂类物质，是人体细胞膜的组成成分，在神经系统中含量尤其丰富，具有保护细胞膜、促进神经生长、恢复神经功能等作用。GM1是唯一可以透过血脑屏障的一种神经节苷脂，因此主要用于治疗中枢神经系统病变。GM1可以通过稳定细胞膜，恢复细胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，直接有效降低神经细胞内含水量，减轻脑水肿，并抑制Ca2+内流，阻止Ca2+积聚；GM1可以对抗兴奋性氨基酸和自由基的神经毒性作用。GM1通过一系列的药理作用促进受损神经的修复及再生，加快神经功能恢复的速度，加大恢复的程度。

神经节苷脂在国内外已广泛临床应用，其确切的疗效以及良好的安全耐受性受到专家学者的高度评价。1996年起我国开始应用施捷因

治疗中枢神经系统病变包括脑脊髓创伤、脑血管意外等，获得了令人满意的效果，使许许多多患者最大程度地恢复了神经功能，也从残疾的边缘挽回了众多病人。得到了广大医生和患者的认可。国内在使用GM1治疗中枢神经系统病变方面积累了丰富的经验，相继在各种专业杂志上发表了有关实验和临床治疗的研究文章。

我们凭借自身技术优势，在单唾液酸四己糖神经节苷脂的提取上进行了有益的探索。

发明内容

神经节苷脂是存在于细胞表面的一类酸性鞘糖脂，在哺乳动物神经系统中的含量最高，目前由猪脑、牛脑、水牛脑等作为其主要来源。

在提取方法上，传统方法从脑组织中提取脂类活性成分是匀浆后用甲醇和氯仿混合溶剂提取，再用丙酮沉淀后碱性条件下水解。从总脂中分离GM₁的方法很多，国内外实验室多采用DEAE-Sephadex和latrobeads大颗粒硅胶球进行柱层析分离提取，或采用透析或α环糊精技术。上述方法的缺点是有机溶剂消耗量大，填料均需进口，故成本非常高。我们对此提取分离过程进行如下改进：我们将在中草药提取中分离有效成分广泛使用的大孔树脂用在了单唾液酸四己糖神经节苷脂提取中，吸附法分离脑组织总提物中的G1_S，再用国产细硅胶代替上述进口填料，用普通硅胶柱层析分离出了高质量的单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)干粉，由于硅胶柱层析后的产品依旧存在不同的金属离子杂质，所以使用阳离子交换柱进一步离子交换。该工艺经过对传统方法的改进后，节省大量溶剂和时间，提高了产率，大幅度降低了成本。制备物的纯度经检测与Sigma公司提供的产品含量相同：产物的脂-唾液酸含量分别为19.8％-21.2％(相当于神经节苷脂含量为93％-96％)

单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)制备共分为四步：

第一步：总脂的提取

以猪脑、牛脑、水牛脑等为原料，匀浆后用甲醇和氯仿混合溶剂提取，上清液加水和0.2％NaOH溶液水解，分层后得到水相粗提物。

第二步：粗孔树脂交换柱分离

粗提物用大孔树脂吸附，待饱和后用水洗至澄清，然后解吸，解样液浓缩后用丙酮沉淀，得神经节苷脂混合体。

第三步：硅胶柱层析

神经节苷脂混合体用硅胶柱层析，收集GM1部分，经浓缩得神经节苷脂(GM1)粗品。

第四步：离子交换树脂柱分离

GM1浓缩液溶解后上阳离子交换树脂柱，用5％盐酸、甲醇洗脱，然后蒸馏、浓缩，再用丙酮沉淀，真空干燥得GM1精制品。

实施例一

1.总脂的提取

a、称取5kg猪脑，加8倍量(40000ml)的氯仿-甲醇混合液(1∶3)，用高速组织捣碎机电动搅拌提取1小时(转速600转/分)，静置3小时，后抽取上清液，反复打浆三次，共合并三次抽取的上清液110L。

b、每10L上清液加入2500ml的水，搅拌1小时后静置36小时、分层；分出底部氯仿层共计26L，蒸馏后回收套用。

c、分出上清水相106L，按0.3％加入NaOH水解，pH约为10，水浴加热至沸腾55℃±5℃水解反应40分钟。

d、水解后用间苯二酚检测，显紫色，OD值0.2～0.35，冷却后备用。

2、粗孔树脂交换柱分离

a、取大孔吸附树脂(型号：D4020)，用水漂洗，除去碎粒及水溶性杂质，装入洁净的玻璃柱内(柱尺寸高：90cm直径：12cm)，装样量为玻璃柱的2/3。

b、进行酸处理，用5个柱体积的0.1％盐酸-甲醇洗涤树脂，然后用水将树脂洗到pH6.5～7.5，水用量约30L。

c、取上述冷却液上柱吸附，流速每小时2L，上样至流出液间苯二酚显色法显淡紫色，停止上样。一般吸附250L后得到饱和，饱和后用3倍柱体积水正洗、反冲树脂柱，尽可能使树脂松散，充分洗至洗涤水澄清。

d、换用pH9-10的甲醇解吸，冲洗2～3小时，收集洗脱液约5000ml，解样液60℃减压蒸馏浓缩至1/10体积(约500ml)，浓缩液用3倍量丙酮沉淀，取沉淀物，自然风干即为神经节苷脂混合体。收率为猪脑湿重的1.5-2‰。

3、硅胶柱层析

a、取适量层析用硅胶(青岛海洋化工厂柱层析用80～100目与100～200目硅胶1∶1混合)，用醇相湿法装柱(柱尺寸高：90cm 直径：2cm)，并用甲醇洗5个柱体积，平衡后待用。

b、取神经节苷脂混合体20g，溶于20～40ml流动相中〔氯仿-甲醇-水(60∶35∶5)〕。充分溶解后上柱分离，流速：每小时25ml～35ml，TLC法检测流出液(TLC法条件展开剂：氯仿/甲醇/0.02％氯化钙＝55∶45∶9；点样量：10-20ul；展层至板边缘1cm处取出，邻苯二酚溶液喷雾显色，110℃烘烤15分钟。)，依次为前沿脂、GM₃、GM₁、GM₁下点，待TLC法显示只有单点时改流速为：每小时50ml～70ml，洗脱液用HPLC跟踪检测，控制质量达到98％以上时开始收集流动相，至含量又下降到98％以下为止，收集流动相约5000ml，所得即是用HPLC检测酸根部分含量大于98％的GM₁。

c、合并GM₁部分的洗脱液，50℃减压浓缩至体积为500ml，3倍量丙酮沉淀后即得GM1干粉。收率为混合体的10％。

4、离子交换树脂分离

a、阳离子交换树脂的预处理：取H⁺型阳离子交换树脂，用三倍量的5％盐酸甲醇溶液走冲洗树脂，并保留2～3小时，再用甲醇冲至pH6.5～7.5

b、收集硅胶柱层析的GM₁部分含有较多的金属离子，取10g，用50ml的5％盐酸甲醇溶液溶解，再加甲醇至1000ml，G₃漏斗过滤除去不溶物。

c、滤液通过离子交换树脂柱，收集得溶液pH为1.8～2.0，如果pH高于2.0，那么滤液需要树脂再生后再次过柱。

d、所收集滤液用饱和NaOH调pH至4.5，减压浓缩至100ml，用300ml丙酮沉淀，静止12小时后抽滤，所得滤出物用少量丙酮洗涤3次，抽干后真空干燥，得到GM₁干粉。

附图说明

图1是详细制备条件和工艺流程图。

Claims

1.一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的提取方法，其特征在于：a：总脂的提取；b：粗孔树脂交换柱分离；c：硅胶柱层析；d：离子交换树脂柱分离

2.根据权利要求1所述总脂的提取是以猪脑、牛脑或水牛脑为原料，匀浆后用甲醇和氯仿混合溶剂提取，上清液加水和0.2％NaOH溶液水解，分层后得到水相粗提物。

3.根据权利要求1所述粗孔树脂交换柱分离是粗提物用大孔树脂吸附，待饱和后用水洗至澄清，然后解吸，解样液浓缩后用丙酮沉淀，得神经节苷脂混合体。

4.根据权利要求1所述硅胶柱层析是指神经节苷脂混合体用硅胶柱层析，收集GM1部分，经浓缩得神经节苷脂(GM1)粗品。

5.根据权利要求1所述离子交换树脂柱分离指GM1浓缩液溶解后上阳离子交换树脂柱，用5％盐酸、甲醇洗脱，然后蒸馏、浓缩，再用丙酮沉淀，真空干燥得GM1精制品。