CN102225955A - 一种安全高效的转化神经节苷脂gm1的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种安全高效的转化神经节苷脂GM1的方法，属于医药生物技术领域。本发明所公布的方法用于实现神经节苷脂混合物向神经节苷脂GM1的安全和高效率的转化，具体方法为：神经节苷脂混合物按50～150g/L的浓度溶解于pH值3.0～5.0的缓冲溶液中，按神经节苷脂混合物质量的30～50％比例加入阳离子交换树脂，升温至55～75℃，低速搅拌0.5～2.0小时，过滤，取滤液，浓缩并丙酮沉淀得转化产物。所得转化产物中神经节苷脂GM1的含量由转化前的7～10％增值到30～35％，且不引入生物源性和化学源性杂质，安全性稳定可靠，适合用于神经节苷脂GM1原料药的规模生产使用。

Description

一种安全高效的转化神经节苷脂GM1的方法

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，特别是涉及一种通过固相介质作用而非微生物作用进行神经节苷脂GM1转化的方法及其在GM1原料药生产中的应用。

背景技术

神经节苷脂(ganglioside，Gls)是大多数哺乳动物细胞膜的组成成分，是大脑形成记忆的最重要物质。神经节苷脂因其最早被发现于神经节细胞而得名，是一类含唾液酸的鞘糖脂，是由亲水的寡糖链和亲脂的神经酰胺两部分组成。目前单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)钠注射液已被批准用于临床使用。GM1可促进人体神经的生长，广泛地用于治疗各种创伤性和心脑血管疾病的神经损伤，各种慢性病后期的神经功能障碍、脑萎缩、阿尔兹海默病、智力障碍等。

神经节苷脂在哺乳动物脑组织中含量丰富，特别以牛脑组织和猪脑组织为制备神经节苷脂的主要原料。考虑到偶蹄目动物的相关潜在致病病毒(如疯牛病病毒等)因素，药用神经节苷脂GM1的制备要求选用猪脑组织为原料。

在哺乳动物的脑组织中，神经节苷脂成分相对一致，主要为GM1、GD1a、GD1b和GT1b等四类。神经节苷脂分子的寡糖链和神经酰胺部分结构一致，各类分子的主要差异在于寡糖链上唾液酸分子的位置和数量的差异。GD1a和GD1b在糖链上有两个唾液酸，但各自位置不同；GT1b在糖链上有三个唾液酸；GM1在糖链上有一个唾液酸。同时，在一定的酸性条件或酶催化条件下，可降解寡糖链上的唾液酸基团。(参见文献：范开等，中国专利CN1353112；于巍等，一株神经节苷脂内切糖苷酶产生菌的分离、鉴定及系统发育分析.微生物学报，2003，(2))

在神经节苷脂GM1的原料药生产制备中，为了增加GM1的产率，如何高效地实现神经节苷脂混合物中其他神经节苷脂向GM1的转化是一个关键的工艺环节。目前已见报道或用于生产实践的主要是微生物转化法和无机酸转化法。微生物转化法是从土壤中筛选培养具备降解唾液酸活性的微生物菌落，使其与神经节苷脂混合物共同发酵培养，微生物在代谢过程中会表达一种具备唾液酸降解活性的蛋白酶，能专一高效地实现神经节苷脂的转化。但这种方法在GM1医药原料中的使用具备严重的安全隐患。天然微生物在与神经节苷脂共同孵化培育过程中，会产生大量的菌体异源蛋白质和异源DNA，这些背景情况未知的异源生物大分子即使在GM1产品中存在微量的残留，也可能会导致严重的安全性事件，这是药品生产所不允许的。另一种转化方法是无机酸转化法，即在神经节苷脂混合物溶液中加入盐酸、硫酸或磷酸，调节pH值至3.0～5.0，保温反应即可。该方法操作简单，引入的化学试剂安全性可靠，目前普遍使用于GM1原料药的生产中。但该方法对转化GM1的效率不是很理想，实际转化率仅有理论转化率的60％左右，其余约40％的GM1被继续过度酸化为脱唾液酸神经节苷脂GA1了。

鉴于神经节苷脂GM1原料需求的日益增加，而通过化学合成手段制备神经节苷脂GM1的可行性目前暂不可能，因此发明一种能安全高效地把神经节苷脂混合物转化为GM1的可供药品原料生产使用的方法迫在眉睫，意义重大。

发明内容

本发明旨在公开一种以阳离子树脂为介质，在酸性水溶液条件下把动物脑组织来源的神经节苷脂混合物转化为富含神经节苷脂GM1的混合物的方法。

本发明专利是通过以下途径得以实现的：

(1)神经节苷脂混合物水溶液的制备：取神经节苷脂混合物，用pH值3.0～5.0、浓度10～50mmol/L的乙酸-乙酸钠缓冲溶液溶解为50～150g/L的溶液。

(2)转化介质的处理与添加：取阳离子树脂适量，用纯净水漂洗干净，沥干水分，用5％HCl溶液浸泡3～5小时，再用纯净水漂洗至中性，沥干水分。按神经节苷脂混合物水溶液中神经节苷脂质量的30～50％的量加入阳离子树脂至溶液中。

(3)转化条件：添加有阳离子转化介质的神经节苷脂混合物溶液升温至55～75℃，低速搅拌0.5～2.0小时。

(4)浓缩与干燥：转化后溶液抽滤，用纯净水淋洗，合并滤液。真空减压浓缩至约500g/L浓度，加入5～8倍量冷丙酮沉淀过夜，滤过，收集沉淀，70℃鼓风干燥过夜即得。

具体实施方式

现以一个较佳工艺条件举例阐明本发明所述方法：

取神经节苷脂混合物1000克，溶解于10升pH值3.5、浓度25mmol/L的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，搅拌混匀，备用。

取阳离子树脂适量，用纯净水漂洗干净，沥干水分，用5％HCl溶液浸泡3小时，再用纯净水漂洗至中性，沥干水分。称取500克树脂加入溶解好的神经节苷脂混合物中。

水浴升温至70℃，低速搅拌2.0小时，用8mol/L NaOH溶液调节pH值至9.0。

抽滤，用纯净水淋洗，合并滤液。85℃真空减压浓缩至约500g/L浓度，加入8倍量冷丙酮沉淀过夜，滤过，收集沉淀，70℃鼓风干燥8小时。得干品820克。

用正相氨基柱检测法(参见文献：郑永彪等.离子对高效液相色谱法分离测定单唾液酸神经节苷脂的含量[J].药物分析杂志，2004，(2).)测定所得产品中GM1含量，结果为31.3％。

Claims (8)

1.一种以阳离子树脂为介质，在酸性水溶液条件下把动物脑组织来源的神经节苷脂混合物转化为富含神经节苷脂GM1的混合物的方法。

2.根据权利要求1所述的富含神经节苷脂GM1的混合物，其特征为GM1的含量在25～35％。

3.根据权利要求1所述的动物脑组织来源的神经节苷脂混合物，其特征为由牛脑组织或猪脑组织提取制备所得。

4.根据权利要求1所述的动物脑组织来源的神经节苷脂混合物，其特征为主要由经免疫检疫合格的猪脑组织提取制备所得。

5.根据权利要求1所述的动物脑组织来源的神经节苷脂混合物，其特征为主要神经节苷脂成分为GM1、GD1b、GD1a和GT1b等。

6.根据权利要求1所述的动物脑组织来源的神经节苷脂混合物，其特征为GM1的含量在7～10％。

7.一种制备权利要求1和2所述的富含神经节苷脂GM1的混合物的方法，其特征是包括以下步骤：

(1)神经节苷脂混合物水溶液的制备：取神经节苷脂混合物，用pH值3.0～5.0、浓度10～50mmol/L的乙酸-乙酸钠缓冲溶液溶解为50～150g/L的溶液。

(2)转化介质的处理与添加：取阳离子树脂适量，用纯净水漂洗干净，沥干水分，用5％HCl溶液浸泡3～5小时，再用纯净水漂洗至中性，沥干水分。按神经节苷脂混合物水溶液中神经节苷脂质量的30～50％的量加入阳离子树脂至溶液中。

(3)转化条件：将添加有阳离子转化介质的神经节苷脂混合物溶液升温至55～75℃，低速搅拌0.5～2.0小时。

(4)浓缩与干燥：转化后溶液抽滤，用纯净水淋洗，合并滤液。真空减压浓缩至约500g/L浓度，加入5～8倍量冷丙酮沉淀过夜，滤过，收集沉淀，70℃鼓风干燥过夜即得。

8.一种制备权利要求1至7所述的富含神经节苷脂GM1的混合物的方法，其特征是该方法所制备的产品不含具潜在安全隐患的微生物杂质污染，不含有毒副作用的化工试剂污染，可有效用于神经节苷脂GM1原料药的生产使用。