CN100383153C

CN100383153C - 一种聚唾液酸水解液的脱色方法

Info

Publication number: CN100383153C
Application number: CNB2006100414074A
Authority: CN
Inventors: 詹晓北; 郑志永; 吴剑荣; 朱莉
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2006-09-01
Filing date: 2006-09-01
Publication date: 2008-04-23
Anticipated expiration: 2026-09-01
Also published as: CN1916010A

Abstract

一种聚唾液酸水解液的脱色方法，属于生物工程技术领域。本发明以一株大肠杆菌经好氧发酵得到聚唾液酸发酵液，经去除菌体，用乙醇沉淀，用去离子水重新溶解配制成质量浓度为2%的聚唾液酸溶液，再经酸水解、碱中和、离心，离心后的聚唾液酸水解液通过以凹凸棒石为填料的层析柱进行吸附层析，淋洗，收集层析液，冷冻干燥后得唾液酸产品。水解后的唾液酸溶液中含有较多深棕红色的杂质，该溶液经过凹凸棒石吸附层析技术处理后冷冻干燥，得到精制的白色粉末唾液酸产品。

Description

一种聚唾液酸水解液的脱色方法

技术领域

一种聚唾液酸水解液的脱色方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

唾液酸又称燕窝酸，化学名为N-乙酰神经氨酸，因是燕窝的主要成分而得名。唾液酸在自然界分布很广，主要通过2-位异头碳的羟基以α-糖苷键连接在糖蛋白、糖脂和寡糖的末端，具有重要的生物学功能，唾液酸还是母乳的重要成分之一。唾液酸能有效抑制感冒病毒和一些病原微生物入侵红细胞。唾液酸的类似物Zanamivir(N-乙酰基-2，3-二脱氧-4-胍基唾液酸)和达菲(Tamiflu)已经被美国食品与药品管理局(FDA)批准为治疗流感的新药，并已经上市。唾液酸的衍生物SialylLewis^X可作为抗粘附药物，能有效治疗类风湿关节炎、脓毒性休克等疾病。

唾液酸的生产主要以发酵法、酶法合成、天然产物提取法为主，但以发酵法生产唾液酸最为经济，发酵法得到的产物是聚唾液酸，需要水解后才能得到唾液酸单体。聚唾液酸在水解过程中，产生了大量深棕红色的色素，部分唾液酸也可能在高温强酸性条件下被破坏生成其它杂质，这既影响了唾液酸产品的色泽，又影响了唾液酸产品的纯度，因此需要用适当的方法进行脱色处理。

聚唾液酸传统的脱色方法是采用树脂吸附和有机溶剂萃取，虽然这两种方法都能在一定程度上去除色素，但仍存在着一些问题：

1、唾液酸含有羧基离子，阳离子树脂对唾液酸的吸附性较差，可以保证对唾液酸的回收率，但色素的吸附能力相当有限，选择性不高。

2、唾液酸不溶于乙醚、氯仿等有机溶剂，而有机溶剂能去除一些色素，但聚唾液酸水解液中还存在着许多水溶性的色素，无法用有机溶剂萃取去除，因此需要寻找一些更有效的脱色方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种聚唾液酸水解液的脱色方法，以降低聚唾液酸水解液中的色素，使提取得到的唾液酸具有更好的质量，增加市场竞争优势。

本发明的技术方案：

一种聚唾液酸水解液的脱色方法，通过好氧培养一株产聚唾液酸的菌株大肠杆菌WXJYL-11(该菌种已在《无锡轻工大学学报》，2002，9(5)：456-459.公开)，在15L全自动发酵罐中，装液量9L，通风量10L/min，发酵罐搅拌转速500r/min，接种量4％(v/v)，保持罐压0.01MPa，37℃发酵60小时得聚唾液酸发酵液。

所用的培养基为：山梨醇40g/L，氯化铵4g/L，磷酸氢二钾20g/L，无水硫酸镁0.9g/L，胰蛋白胨1.5g/L，pH 7.8。

聚唾液酸发酵液经8000r/min离心10min后去除菌体，上清液中加入3倍乙醇沉淀，经离心后得到聚唾液酸，用去离子水重新溶解聚唾液酸沉淀物，配制成质量浓度为2％的聚唾液酸溶液。

加无机酸水解：用5％～10％(v/v)浓度的无机酸溶液(如硫酸或盐酸)将聚唾液酸溶液的pH调至1.0～2.0，水浴加热至75～85℃，维持该温度2～4h水解得到唾液酸单体。

中和：流加碱溶液(如氢氧化钡或氢氧化钠)至溶液的pH为7.0，7000转/分钟离心15分钟除去沉淀物，得唾液酸上清液。

填料预处理：将50克凹凸棒石填料用水浸润、悬浮后装入Φ40×250mm的层析柱中，对填料进行酸洗(0.5％～1.5％盐酸浸泡6小时)、水洗(清水洗涤至pH中性)、得到预处理的凹凸棒石填料。

上样：取1～2升中和、离心后的聚唾液酸水解后的上清液以每分钟0.01～0.2填充床体积的速率泵入层析柱进行脱色处理，收集流出的层析液。

淋洗：样品处理后再泵入100～300毫升去离子水，淋洗层析柱，收集流出的层析液。

冷冻干燥：合并层析液后经冷冻干燥后得到唾液酸产品。

较优的聚唾液酸水解液的上样速率为每分钟0.01～0.1填充床体积。

本发明的有益效果：

聚唾液酸水解液经过凹凸棒石的吸附层析处理后，得到无色的澄清溶液，经冷冻干燥后得到白色粉末的唾液酸产品，经测定，吸附层析操作过程中，色素去除率为95.3％，而唾液酸的回收率达到97.2％，这说明凹凸棒石对聚唾液酸水解液中的色素具有高度的选择性，而基本上不吸附唾液酸。通过凹凸棒石处理，除去了色素类杂质，不但提高了唾液酸的纯度，还提高了唾液酸的产品质量。由于凹凸棒石是一种较为廉价的色素吸附剂，增加吸附层析操作，增加的生产成本相对于唾液酸的价格而言是很少的，但产品质量的提高，将有助于提高唾液酸的市场竞争力。

具体实施方式

实施例1.聚唾液酸发酵液的制备

菌株大肠杆菌(Escherichia coli)WXJYL-11江南大学生物工程学院生化工程实验室保藏和提供，该菌株已在《无锡轻工大学学报》，2002，9(5)：456-459.公开。

利用9L发酵培养基，在15L Biostat C10-3机械搅拌罐上进行发酵，接种量4％，发酵罐搅拌转速500r/min，通风量为10L/min，保持罐压0.01MPa，发酵温度37℃。发酵60小时得聚唾液酸发酵液，测定聚唾液酸含量2.7g/L。

实施例2.聚唾液酸水解液的制备

将实施例1得到的9L聚唾液酸发酵液在8000r/min离心10min后去除菌体，上清液中加入3倍乙醇沉淀，经离心后得到聚唾液酸，再加入去离子水重新溶解，配制成质量浓度为2％的聚唾液酸溶液。用5％～10％(v/v)浓度的无机酸溶液(如硫酸或盐酸)将聚唾液酸溶液的pH调至1.0～2.0，水浴加热至75～85℃，维持该温度2～4小时水解得到唾液酸单体。流加碱溶液(如氢氧化钡或氢氧化钠)至溶液的pH为7.0，7000r/min离心15分钟除去沉淀物，得唾液酸上清液。

实施例3.唾液酸水解液的脱色和产品制备

将50克凹凸棒石填料用水浸润、悬浮后装入Φ40×250mm的层析柱中，对填料进行酸洗(0.5～1.5％盐酸浸泡6小时)、水洗(清水洗涤至pH中性)得到预处理后的凹凸棒石填料。取1～2升中和、离心处理后的唾液酸上清液，以每分钟0.01～0.2层析柱体积的速率泵入层析柱进行脱色处理，收集流出液。样品处理后再泵入100～300毫升去离子水，淋洗层析柱，收集流出的层析液。合并层析液后经冷冻干燥后得到唾液酸产品。较优的聚唾液酸水解液的上样速率为每分钟0.01～0.1填充床体积。经测定，样品的色素去除率为95.3％，而唾液酸的回收率达到97.2％。

Claims

1.一种聚唾液酸水解液的脱色方法，包括以聚唾液酸的发酵液为原料，经去除菌体，用乙醇沉淀，用去离子水重新溶解配制成质量浓度为2％的聚唾液酸溶液，再经酸水解、碱中和、离心，其特征是离心后的聚唾液酸水解液通过以凹凸棒石为填料的层析柱进行吸附层析，淋洗，收集层析液，冷冻干燥后得唾液酸产品，工艺为：

填料预处理：将50克凹凸棒石填料用水浸润、悬浮后装入Φ40×250mm的层析柱中，对填料用0.5％～1.5％浓度的盐酸浸泡6小时进行酸洗，再用清水洗涤至pH中性，得到预处理的凹凸棒石填料；

上样：取1～2升中和、离心后的聚唾液酸水解液以每分钟0.01～0.2填充床体积的速率泵入层析柱进行脱色处理，收集流出的层析液；

淋洗：样品处理后再泵入100～300毫升去离子水，淋洗层析柱，收集流出的层析液；

冷冻干燥：合并层析液后经冷冻干燥后得到唾液酸产品。

2.根据权利要求1所述的脱色方法，其特征在于所述聚唾液酸水解液的上样速率为每分钟0.01～0.1填充床体积。