CN1300311C - 壳聚糖内切酶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种壳聚糖内切酶的制备方法。用高产壳聚糖酶菌株(国家发明专利号ZL 02159880.0，菌种保藏号为CGMCC No.0851)，接种到加入适量壳聚糖、氮源和无机盐的溶液的发酵罐中培养，过滤除去大部分悬浮菌体，得到壳聚糖酶粗酶液，发酵粗酶液，先后采用超滤浓缩、有机溶剂或硫酸铵沉淀、阳离子交换和凝胶过滤、冷冻真空干燥等分离纯化的方法分离纯化得到一种壳聚糖内切酶。本发明的菌种遗传性稳定，发酵条件常规化，得到的壳聚糖内切酶纯度较高，适用于制备相对分子质量分布较窄的高纯度壳低聚糖产品。

Description

壳聚糖内切酶的制备方法
技术领域
本发明涉及一种壳聚糖内切酶的制备方法。
背景技术
壳聚糖(chitosan)是由氨基葡萄糖以β-1，4糖苷键连接成的具有生物活性的高分子聚合物，化学名为聚2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖。它主要是以被废弃的虾壳、蟹壳为原料，经脱钙、去除蛋白和脱乙酰基等化学过程而得到的。其分子结构式如下图所示。
壳聚糖具有许多独特的生物活性。1991年的国际甲壳素大会把壳聚糖确定为除了糖、蛋白质、脂肪、维生素和矿物质之外的第六大生命要素，对它们在医疗保健方面的作用给予了很高的评价。壳聚糖的许多生物活性需要以低分子量或者壳寡聚糖的形式才能体现出来，如抗肿瘤、免疫激活、用作基因载体等。但是由于人体内壳聚糖酶和胃酸的含量很少，壳聚糖的作用效果受到了很大的限制。
低聚糖的制备主要有化学法、氧化法、超声波法和酶降解法。同其他方法相比较，酶法降解制备壳低聚糖具有反应条件温和、操作简单、产物壳低聚糖的相对分子质量容易控制、不产生二次污染等优点。
目前用于壳聚糖降解的酶有专一性壳聚糖酶，也有非专一性酶如纤维素酶、脂肪酶、溶菌酶等，市售非专一性酶的纯度和活力都不大高，而成本较高，不适用于制备相对分子质量分布较窄的高纯度壳低聚糖产品。因此，制备高纯度壳聚糖内切酶是本领域研究的一个热点问题。本发明公开了一种制备高纯度壳聚糖内切酶的方法。从青霉菌发酵粗酶液中分离纯化得到一种壳聚糖内切酶，适用于制备相对分子质量分布较窄的高纯度壳低聚糖产品。
发明内容
本发明的目的提供一种制备壳聚糖内切酶的方法。
方法的步骤如下：
1)将保藏号为：CGMCC No.0851的高产壳聚糖酶生产菌(Penicillium sp)接种在5L的发酵罐中，培养基装液量3-4L，接种量为10％-20％，培养温度为26-32℃、搅拌速度为200-500r·min-1、通气量为1.5-5L·min-1，发酵50-80小时后，过滤除去悬浮菌体得到壳聚糖粗酶液，培养基为：壳聚糖5-40g/L、尿素0.5-3g/L、磷酸二氢钾0.2-1g/L、硫酸铵0.5-3g/L、硫酸镁0.1；
2)截留相对分子质量为2-20kDa的超滤膜对粗酶液进行超滤，然后，用3-5倍的冰乙醇沉淀或者用20％-80％硫酸铵分级沉淀得到壳聚糖粗酶沉淀物；
3)用pH 4.4-5.5，10-50mmol乙酸缓冲液溶解壳聚糖粗酶沉淀物，再上HiPrep 16/10SP XL阳离子交换柱，用含0.5-2mol氯化钠、10-50mmol乙酸缓冲液0-100％线形梯度洗脱，得到壳聚糖内切酶溶液；
4)用Sephadex G50凝胶过滤柱过滤，乙酸缓冲液洗脱，浓缩、冷冻、真空干燥得到壳聚糖内切酶。
本发明的优点是：酶法降解制备壳低聚糖和壳寡糖具有反应条件温和，可以控制降解反应速率和产物相对分子质量，不产生二次污染等优点。特别是使用分离纯化后的内切壳聚糖酶降解壳聚糖，可以得到相对分子质量分布较窄的高纯度壳低聚糖产品。
具体实施方式
从高产壳聚糖酶菌株(国家发明专利号ZL 02159880.0，菌种保藏号为CGMCC No.0851)发酵粗酶液，先后采用超滤浓缩、有机溶剂或硫酸铵沉淀、阳离子交换和凝胶过滤的方法分离纯化得到一种壳聚糖内切酶。
本发明提供了利用青霉菌发酵制备壳聚糖粗酶液的方法。在5L的发酵罐中，装入培养基量为3-4L，接种量为10％-20％，培养温度为26-32℃、搅拌速度为200-450r·min-1、通气量为1.5-5L·min-1，培养时间50-80小时后，过滤除去悬浮菌体得到壳聚糖粗酶液。
本发明还提供了从壳聚糖粗酶液中分离纯化得到壳聚糖内切酶的方法。分别采用超滤浓缩、有机溶剂或者硫酸铵沉淀、阳离子交换和凝胶过滤、冷冻真空干燥等分离纯化的方法，从粗酶液中分离纯化得到壳聚糖内切酶。
实施例1：
1、粗酶液的制备
取试管斜面保藏菌种8支，活化5小时之后，分别加入无菌水15ml，洗下孢子。将获得的孢子悬液直接接入5L发酵罐培养基中进行培养。培养温度28℃，搅拌桨转速300r·min-1，通气量为4.5L·min-1，发酵罐培养基组成如下：初始pH值为5。
  壳聚糖   30g/L
  尿素   1g/L
  磷酸二氢钾   0.6g/L
  硫酸铵   1g/L
  硫酸镁   0.12g/L
发酵罐培养75小时后，在冰箱中4℃下保存发酵液2小时，然后在6000r·min-1离心后取上清液作为粗酶液，备用。
2、壳聚糖内切酶的分离纯化
(1)壳聚糖粗酶液的浓缩：取上述壳聚糖酶粗酶液，采用超滤方法浓缩，超滤膜面积0.1m2，截留相对分子质量2kDa，操作压力0.4MPa，截留部分为浓缩的粗酶液。
(2)壳聚糖酶的提取：取100ml上述粗酶液，按照冰乙醇和壳聚糖粗酶液3∶1的比例，加入冰乙醇，在4℃条件下静置，沉淀得到壳聚糖粗酶，用50ml、20mmol的乙酸缓冲液(pH 4.4)溶解。
(3)壳聚糖酶的粗分离：采用阳离子交换柱HiPrep 16/10SP XL，平衡缓冲液为30mmol乙酸缓冲液(pH 4.4)，洗脱缓冲液为含1mol氯化钠的30mmol乙酸缓冲液，0-100％线形梯度洗脱，分步收集。此过程可以将壳聚糖内切酶同外切酶、杂质蛋白质分开，收集壳聚糖内切酶溶液。
(4)壳聚糖内切酶的精制：根据壳聚糖内切酶和杂质蛋白相对分子质量的差异，采用凝胶过滤柱Sephadex G-50，缓冲液为20mmol乙酸缓冲液(pH 4.4)，精制得到壳聚糖内切酶溶液，比活力478U/mg，冷冻真空干燥后得到壳聚糖内切酶产品。
实施例2：
1、粗酶液的制备
取试管斜面保藏菌种10支，活化5小时之后，分别加入无菌水15ml，洗下孢子。将获得的孢子悬液直接接入5L发酵罐培养基中进行培养。培养温度30℃，搅拌桨转速400r·min-1，通气量为3.5L·min-1，发酵罐培养基组成如下：初始pH值为5。
  壳聚糖   20g/L
  尿素   2g/L
  磷酸二氢钾   0.8g/L
  硫酸铵   2g/L
  硫酸镁   0.2g/L
发酵罐培养70小时后，在冰箱中4℃下保存发酵液2小时，然后在6000r·min-1离心后取上清液作为粗酶液，备用。
2、壳聚糖内切酶的分离纯化
(1)壳聚糖粗酶液的浓缩：取上述壳聚糖酶粗酶液，采用超滤方法浓缩，超滤膜面积0.1m2，截留相对分子质量10kDa，操作压力0.4MPa，截留部分为浓缩的粗酶液。
(2)壳聚糖酶的提取：取100ml上述粗酶液，在4℃条件下缓缓加入硫酸铵使其达到20％饱和度，6000r·min-1离心除去沉淀，继续加入硫酸铵使其饱和度达到80％，6000r·min-1离心收集沉淀部分，用20ml 20mM的乙酸缓冲液(pH4.8)溶解。使用脱盐柱进行脱盐处理，备用。
(3)壳聚糖酶的粗分离：采用阳离子交换柱HiPrep 16/10SP XL，平衡缓冲液为20mM乙酸缓冲液(pH 4.8)，洗脱缓冲液为含1mol氯化钠的20mmol乙酸缓冲液，0-100％线形梯度洗脱，分步收集。此过程可以将壳聚糖内切酶同外切酶、杂质蛋白质分开，收集壳聚糖内切酶溶液。
(4)壳聚糖内切酶的精制：根据壳聚糖内切酶和杂质蛋白相对分子质量的差异，采用凝胶过滤柱Sephadex G50，缓冲液为20mmol乙酸缓冲液(pH 4.8)，精制得到壳聚糖内切酶溶液，比活力432U/mg，冷冻真空干燥后得到壳聚糖内切酶产品。
实施例3：
1、粗酶液的制备
取试管斜面保藏菌种10支，活化5小时之后，分别加入无菌水15ml，洗下孢子。将获得的孢子悬液直接接入5L发酵罐培养基中进行培养。培养温度28℃，搅拌桨转速500r·min-1，通气量为5L·min-1，发酵罐培养基组成如下：初始pH值为4.5。
  壳聚糖   25g/L
  尿素   0.8g/L
  磷酸二氢钾   0.8g/L
  硫酸铵   1.5g/L
  硫酸镁   0.3g/L
2、壳聚糖内切酶的分离纯化
(1)壳聚糖粗酶液的浓缩：取上述壳聚糖酶粗酶液，采用超滤方法浓缩，超滤膜面积0.1m2，截留相对分子质量5kDa，操作压力0.4MPa，截留部分为浓缩的粗酶液。
(2)壳聚糖酶的提取：取100ml上述粗酶液，在4℃条件下缓缓加入硫酸铵使其达到20％饱和度，6000r·min-1离心除去沉淀，继续加入硫酸铵使其饱和度达到80％，6000r·min-1离心收集沉淀部分，用20ml 10mmol的乙酸缓冲液(pH5.0)溶解。使用透析带对10mmol的乙酸缓冲液在4℃下透析20小时。
(3)壳聚糖酶的粗分离：采用阳离子交换柱HiPrep 16/10SP XL，平衡缓冲液为50mmol乙酸缓冲液(pH 5.0)，洗脱缓冲液为含1mol氯化钠的50mmol乙酸缓冲液，0-100％线形梯度洗脱，分步收集。此过程可以将壳聚糖内切酶同外切酶、杂质蛋白质分开，收集壳聚糖内切酶溶液。
(4)壳聚糖内切酶的精制：根据壳聚糖内切酶和杂质蛋白相对分子质量的差异，采用凝胶过滤柱Sephadex G-50，缓冲液为50mmol乙酸缓冲液(pH 5.0)，精制得到壳聚糖内切酶溶液，比活力453U/mg，冷冻真空干燥后得到壳聚糖内切酶产品。
实施例4：
1、粗酶液的制备
取试管斜面保藏菌种15支，活化5小时之后，分别加入无菌水15ml，洗下孢子。将获得的孢子悬液直接接入5L发酵罐培养基中进行培养。培养温度32℃，搅拌桨转速250r·min-1，通气量为5L·min-1，发酵罐培养基组成如下：初始pH值为4.5。
  壳聚糖   35g/L
  尿素   0.8g/L
  磷酸二氢钾   0.8g/L
  硫酸铵   1g/L
  硫酸镁   0.4g/L
2、壳聚糖内切酶的分离纯化
(1)壳聚糖粗酶液的浓缩：取上述壳聚糖酶粗酶液，采用超滤方法浓缩，超滤膜面积0.1m2，截留相对分子质量20kDa，操作压力0.4MPa，截留部分为浓缩的粗酶液。
(2)壳聚糖酶的提取：取100ml上述粗酶液，在4℃条件下缓缓加入硫酸铵使其达到20％饱和度，6000r·min-1离心除去沉淀，继续加入硫酸铵使其饱和度达到80％，6000r·min-1离心收集沉淀部分，用20ml 20mM的乙酸缓冲液(pH5.0)溶解。使用脱盐柱进行脱盐处理，备用。
(3)壳聚糖酶的粗分离：采用阳离子交换柱HiPrep 16/10SP XL，平衡缓冲液为20mM乙酸缓冲液(pH 5.0)，洗脱缓冲液为含1mol氯化钠的20mmol乙酸缓冲液，0-100％线形梯度洗脱，分步收集。此过程可以将壳聚糖内切酶同外切酶、杂质蛋白质分开，收集壳聚糖内切酶溶液。
(4)壳聚糖内切酶的精制：根据壳聚糖内切酶和杂质蛋白相对分子质量的差异，采用凝胶过滤柱Sephadex G50，缓冲液为20mmol乙酸缓冲液(pH 5.0)，精制得到壳聚糖内切酶溶液，比活力496U/mg，冷冻真空干燥后得到壳聚糖内切酶产品。

Claims (2)

1、一种壳聚糖内切酶的制备方法，其特征在于方法的步骤如下：
1)将保藏号为：CGMCC No.0851的高产壳聚糖酶生产菌Penicillium sp接种在5L的发酵罐中，培养基装液量3-4L，接种量为10％-20％，培养温度为26-32℃、搅拌速度为200-450r·min-1、通气量为1.5-5L·min-1，发酵50-80小时后，过滤除去悬浮菌体得到壳聚糖粗酶液，所述的培养基为：壳聚糖5-40g/L、尿素0.5-3g/L、磷酸二氢钾0.2-1g/L、硫酸铵0.5-3g/L、硫酸镁0.1-0.5g/L；
2)截留相对分子质量为2-20kDa的超滤膜对粗酶液进行超滤，然后，用2-4倍的冰乙醇沉淀或者用20％-80％硫酸铵分级沉淀得到壳聚糖粗酶沉淀物；
3)用pH 4.4-5.5，10-50mmol乙酸缓冲液溶解壳聚糖粗酶沉淀物，再上HiPrep 16/10SP XL阳离子交换柱，用含0.5-2mol氯化钠、10-50mmol乙酸缓冲液，0-100％线形梯度洗脱，得到壳聚糖内切酶溶液；
4)用Sephadex G 50凝胶过滤柱过滤，乙酸缓冲液洗脱，浓缩、冷冻、真空干燥得到壳聚糖内切酶。
2、根据权利要求1所述一种壳聚糖内切酶的制备方法，其特征在于所述高产壳聚糖酶生产菌Penicillium sp接种是使用斜面培养的菌种直接上发酵罐培养，接种的种子液制备方法是采用100-300ml无菌水洗下5-15支25ml斜面中培养得到的真菌孢子，直接接种到发酵罐中。
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