CN1463989A - 利用黑曲霉纤维素酶制备低分子量壳聚糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种低分子量壳聚糖的制备方法，特别是涉及一种利用黑曲霉菌种培养的纤维素酶降解壳聚糖生产低分子量壳聚糖的方法。纯化的壳聚糖粉末用水溶胀后，加入乙酸溶液使之充分溶解，然后用乙酸氨或乙酸钠水溶液稀释，配制成纯化的壳聚糖的浓度为0.5－4wt％；用乙酸氨或乙酸钠水溶液溶解黑曲霉纤维素酶，配制成浓度为0.5－2mg/ml的酶液；在温度为40℃－55℃下，加入酶液进行酶解反应，其中壳聚糖与酶的重量比为5∶1－20∶1，摇晃均匀，反应完成后立即取出，煮沸，使酶灭活，然后减压抽滤移走酶，得到低分子量壳聚糖。

Description

利用黑曲霉纤维素酶制备低分子量壳聚糖的方法

                    技术领域

本发明涉及一种低分子量壳聚糖的制备方法，特别是涉及一种利用黑曲霉菌种培养的纤维素酶降解壳聚糖生产低分子量壳聚糖的方法。

                    背景技术

甲壳质(Chitin)是广泛地存在于蟹，虾中的天然高分子产物，它的脱乙酰基产物壳聚糖(Chitosan)具有许多特殊的性质，如碱性，保湿性，抗菌性，生理活性等，作为功能性材料在化妆品原料，医用材料，食品素材等各个领域的需求不断增加。壳聚糖是高分子化合物，在一般的溶剂中不溶，只有在酸性溶液中能溶解，随着壳聚糖浓度的上升，粘度显著增高，如脱乙酰度85％以上平均分子量为52万的1％(w/w)壳聚糖的醋酸溶液(1％醋酸)的表观粘度是0.097Pa·S，而4％壳聚糖的醋酸溶液的表观粘度是18.43Pa·S，平均分子量为100万以上的4％壳聚糖基本上成凝胶状，使用时操作很困难。因此为了得到高浓度并且低粘度的壳聚糖水溶液，降低壳聚糖分子量的很多研究方案被探讨。

降低壳聚糖分子量研究的代表方法有：在壳聚糖的酸性溶液中加热分解法，如：常将壳聚糖溶于一些无机酸如磷酸、盐酸中加热到一定温度进行降解(Hasegawa M，et al.Carbohydr Polym，1993，20：279.Domard A，et al.Int J Biol Macromol，1989，11：197.)。壳聚糖的氧化剂分解法，如：H₂O₂氧化降解法(Allan G G，et al.Carbohydr Res，1995，277：257)。但是这些方法有种种问题。酸性溶液中加热分解法调节壳聚糖的分解程度很困难，而且使用强酸加热，反应条件苛刻，同时产物分离提纯困难，生产成本高，污染严重。氧化剂分解法能够将分子量降到一定程度，但是要进一步降低分子量需要提高氧化剂的浓度，不但使低分子量产物易带黄色而且容易降低氨基的含有量。

在现有技术中，另一类受到重视的降解方法是酶解法。酶解法可分为专一性酶降解法和非专一性酶降解法两种。专一性酶解法由于酶的提取，分离和纯化困难，成本高，目前工业化生产有很大的困难。非专一性酶是指对壳聚糖有降解作用的蛋白酶，糖酶，脂酶等。如Riccardo A.A.Muzzarelli等人的研究表明麦胚脂肪酶或木瓜蛋白酶在微酸条件下能够降解壳聚糖(Muzzarelli R AA，et al.Enzyme Micro Technol，1995，17：541～545。Muzzarelli RA A，et al.Enzyme Micro Technol，1994，16：110～114)。但是壳聚糖的脱乙酰化度不能太高，以60％左右为宜。Einosuki等(EinosukiM，Fumiko Y，Hiroyuki K.Carbohydr.Res.1993，239：227～237)利用从Trichoderma riride来的纤维素酶水解壳聚糖，得到分子量主要为900-1500的低聚糖。张虎等(Hu Zhang，Yuguang Du，XingjuYu et al.Carbohydr.Res.1999，320：257～260)采用纤维素酶、α-淀粉酶和蛋白酶的非专一性复合酶对脱乙酰度为86％的壳聚糖进行降解，得到分子量小于2000的低聚糖。而林洪等申请的专利(公开号CN1339605A)中也是以非专一性复合酶讨论了壳聚糖的降解，即，木瓜蛋白酶∶纤维素酶∶果胶酶＝40-47∶25-31∶25-31。但是就纤维素酶而言，来源非常丰富：如绿色木霉，里氏木霉，黑曲霉，青霉等，并不是所有种类的纤维素酶对壳聚糖都有协同降解作用。日本的公开专利P2001-95595A提出了用来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维素酶和从中分离出的纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase I)能够有效地降解壳聚糖，使用的壳聚糖的脱乙酰度为98％以上。

                    发明内容

本发明的目的是提供一种新的高效降解壳聚糖的简单价廉的制备方法，即低分子量壳聚糖的制备方法是用由黑曲霉(Aspergillus niger)中生成的纤维素酶来分解壳聚糖，根据降解时间的不同，得到不同分子量的壳聚糖。

本发明提出的利用黑曲霉纤维素酶制备低分子量壳聚糖的方法，其步骤如下：

(1)壳聚糖的纯化：用浓度为0.1-2wt％的乙酸溶解购买来的壳聚糖，配制成浓度为1-3wt％的壳聚糖溶液，过滤除掉不溶物，室温下向滤液中加入过量的浓度为0.5-2M的NaOH溶液直至不再有新的白色凝胶状沉淀生成。将此白色沉淀过滤并且用蒸馏水洗至中性，得到白色壳聚糖沉淀，将此纯化过的壳聚糖干燥并磨成粉末备用。

(2)将步骤(1)纯化过的壳聚糖粉末用少许水溶胀后，再加入少量的浓度为0.1-2wt％的乙酸溶液使之充分溶解，然后用pH为4-7的浓度为0.001M-0.5M的乙酸氨或乙酸钠水溶液稀释，配制成纯化过的壳聚糖的浓度为0.5-4wt％，待用。

(3)用pH为4-7的浓度为0.001-0.5M的乙酸氨或乙酸钠水溶液溶解纤维素酶，配制成浓度为0.5-2mg/ml的酶液。

(4)将步骤(2)纯化过的壳聚糖溶液倒入容器中，置于水浴振荡器中至恒温40℃-55℃后，再加入步骤(3)相应比例的酶液进行酶解反应，其中纯化过的壳聚糖与酶的重量比为5∶1-20∶1，摇晃均匀，转速80-120r/min，反应完成后立即取出，煮沸10min使酶灭活，然后减压抽滤移走酶，得到低分子量壳聚糖。

壳聚糖与酶的比值小，降解效率高，但是成本也提高。壳聚糖与酶的比值大于20∶1，降解速率慢，不适于工业化生产。

利用作为纤维素的分解酶而广泛使用的黑曲霉纤维素酶分解壳聚糖得到低分子量壳聚糖，降低了成本。

低分子量壳聚糖制备方法的一个条件是先将壳聚糖用水溶胀后用少量醋酸溶解，再用醋酸氨或醋酸钠水溶液进一步溶解稀释后被纤维素酶降解。由于使用醋酸盐水溶液溶解壳聚糖，在用纤维素酶分解壳聚糖后，使生成的低分子量壳聚糖的分离简易化。

低分子量壳聚糖的制造方法中，溶解的壳聚糖水溶液的温度保持在40-55度范围内用纤维素酶分解。在此范围内纤维素酶的分解速度快，生成低分子量壳聚糖的效率高。

分子量是根据特性粘度法推算，使用乌氏粘度计(上海玻璃仪器一厂)测特性粘度，用NDJ-9S型数显粘度计(上海精密科学仪器有限公司)测定表观粘度，两种粘度的测定温度是25度。

在本发明中使用的壳聚糖是从甲壳类的外壳中提取的甲壳质经酸碱处理后得到的产物，例如利用水产加工的废弃物，能够降低成本。

                    附图说明

图1.酶解时间对表观粘度的影响示意图；

图2.壳聚糖酶解的再现性示意图；

图3.酶解时间对壳聚糖平均分子量的影响示意图；

图4.不同来源的纤维素酶对壳聚糖降解的影响示意图。

                 具体实施方式实施例1.实施例2-5中各种溶液的配制

从青岛海生生物工程有限公司购买低粘度壳聚糖(200-500mPa.S)，脱乙酰基程度在85％以上，分子量约520000。将买来的壳聚糖用浓度为1wt％的乙酸溶解，配置成浓度为2wt％的壳聚糖溶液，过滤除掉不溶物，室温下向滤液中加入过量的1MNaOH溶液直至不再有新的白色凝胶状沉淀生成。将此白色沉淀过滤并且用蒸馏水洗至中性，得到纯化过的白色壳聚糖沉淀，干燥并磨成粉末备用。

纯化过的壳聚糖粉末用少许水溶胀后，再加入少量浓度为1wt％的乙酸溶液使之充分溶解，然后用pH为5-6的0.1M的乙酸氨水溶液溶解，配制成壳聚糖的浓度为2wt％。

用pH为5-6的浓度为0.02M的乙酸氨水溶液溶解黑曲霉纤维素酶，配制成浓度为2mg/ml的酶液。

使用的黑曲霉的纤维素酶是中国科学院理化技术研究所培养生产的来自黑曲霉菌的纤维素酶(1号)，在实施例5中作为对比使用了市场销售的来自黑曲霉的纤维素酶(2号，Fluka，Cellulasefrom Aspergillus niger)，来自里氏木霉的纤维素酶(3号，Sigma，Cellulase EC 3.2.1.4，from Trichodema reesei)，酶溶液配置成2mg/ml。

中国科学院理化技术研究所培养生产的来自黑曲霉的纤维素酶的粗酶液用水萃取后，加乙醇沉淀，搅拌，静置后，弃其上清液，减压过滤，收集沉淀放于真空干燥箱中初步干燥后，置于冰箱冷冻室中缓慢冷冻干燥，得粗纤维素酶粉(1号)。该酶经电泳分析确定其主要成分的分子量约为67kD。酶的酸稳定性范围是pH4-8。热稳定范围在35～55℃，35℃以下活性很低，高于60℃时很快失活。

实施例2.

取实施例1中配置的浓度为2wt％的壳聚糖溶液150mL四份，装入四个250mL三角瓶中，加入酶液使壳聚糖∶酶的重量比分别为10∶1，水浴45℃、pH6.0、100r/min的条件下进行酶解，分别反应5min、30min、60min、240min后，用数显粘度计测表观粘度(见图1)，结果表明：降解速度非常快，5分钟粘度降到了16.4％，240min粘度降到了4％。

实施例3.

取实施例1中配置的浓度为2wt％的壳聚糖溶液150mL二份，装入二个250mL三角瓶中，在温度50℃、pH5.0、壳聚糖∶酶的重量比为10∶1的条件下，酶解时间分别为30min和60min后，测特性粘度，算出平均分子量。同样的实验第二天又重复操作一次，测试酶解的重复性。结果表明：在同样的试验条件下，壳聚糖酶解的产物平均分子量稳定，再现性好(见图2)。

实施例4.

取实施例1中配置的浓度为2wt％的壳聚糖溶液1000mL四份，在温度50℃、pH5.0、壳聚糖∶酶的重量比为5∶1的条件下，分别酶解1h、4h、8h、24h后，测特性粘度，算出平均分子量(见图3)。结果表明：随着反应时间的延长，壳聚糖的平均分子量从520000分别降解到35000、11000、5800和2200，降解效果明显。实施例5.

选用Fluka公司生产的来源于黑曲霉菌的纤维素酶(2号)和Sigma公司生产的来源于里氏木霉的纤维素酶(3号)与自制的纤维素酶(1号)，在温度50℃、pH5.0、壳聚糖∶酶重量比为10∶1、酶解5min的条件下进行壳聚糖酶解研究，并测表观粘度(见图4)。结果表明：2号纤维素酶对壳聚糖降解的效果没有1号高，而3号纤维素酶的降解效果虽然与中国科学院理化技术研究所培养生产的纤维素酶对壳聚糖降解的效果差不多，但3号是精制酶，而1号是粗酶，因此使用3号成本比1号高。

Claims (4)

1.一种利用黑曲霉纤维素酶制备低分子量壳聚糖的方法，其特征是：该方法的步骤为：

(1)用乙酸溶解壳聚糖，配制成浓度为1-3wt％的壳聚糖溶液，过滤除掉不溶物，室温下向滤液中加入过量的浓度为0.5-2M的NaOH溶液直至不再有新的白色凝胶状沉淀生成；将此白色沉淀过滤并且用蒸馏水洗至中性，将得到的纯化的壳聚糖沉淀干燥并磨成粉末备用；

(2)将步骤(1)纯化的壳聚糖粉末用水溶胀后，再加入乙酸溶液使之充分溶解，然后用乙酸氨或乙酸钠水溶液稀释，配制成纯化的壳聚糖的浓度为0.5-4wt％，待用；

(3)用乙酸氨或乙酸钠水溶液溶解纤维素酶，配制成浓度为0.5-2mg/ml的酶液；

(4)将步骤(2)纯化的壳聚糖溶液倒入容器中，置于水浴振荡器中至恒温40℃-55℃后，再加入步骤(3)相应比例的酶液进行酶解反应，其中壳聚糖与酶的重量比为5∶1-20∶1，摇晃均匀，反应完成后立即取出，煮沸，使酶灭活，然后减压抽滤移走酶，得到低分子量壳聚糖；

所述的纤维素酶是黑曲霉纤维素酶。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述的壳聚糖是从甲壳类的外壳中提取的甲壳质，经酸碱处理后得到的产物。

3.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述的乙酸浓度为0.1-2wt％。

4.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述的乙酸氨或乙酸钠水溶液的pH为4-7，浓度为0.001M-0.5M。

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