CN101168570B - 海带硫酸多糖的降解方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海带硫酸多糖的降解方法，其特征在于首先从海带中提取并分离海带硫酸多糖，然后通过过氧化氢降解得到低分子量海带硫酸多糖。该方法降解速度快，试剂用量极少，工艺简单，成本低廉，多余过氧化氢容易分解去除，硫酸基和总糖含量基本保持不变，且分子量分布集中，分子量范围可以控制。由于过氧化氢的漂白作用，所得低分子量硫酸多糖样品外观洁白。
Description
技术领域
本发明属于海洋生物技术领域，具体来说涉及海洋药物的研究与开发，特别涉及一种海带硫酸多糖的降解方法。
背景技术
海带硫酸多糖(Laminaria polysaccharide sulfate，LPS)是一种含有多种单糖和硫酸基的水溶性杂多糖。海带中LPS的含量随其种类、产地、季节和植物体不同部位而变化，LPS具有多种生物学功能，如抗肿瘤、抗病毒、降血糖血脂作用、免疫调节作用及调节细胞增殖作用。
不同来源的LPS，其结构、单糖组成和硫酸基含量各有差异。LPS的生物活性不仅与链中硫酸基的含量有关，而且与其分子质量密切相关。LPS分子质量越大，分子体积越大，越不利于多糖跨越多重细胞膜障碍进入生物体内发挥生物学活性。天然的LPS由于分子量大(从几十万至几百万)，其溶解性差，导致其应用受到很大的限制。
将大分子质量的海藻硫酸多糖降解后，一般能显著提高其活性，如低分子量的螺旋藻多糖的硫酸酯化物比高分子量的具有更良好的体外抗肿瘤活性。又如，普通肝素经化学解聚或酶催化降解后，得到的低分子量肝素(LMWH)及肝素寡糖，由于其分子量减小至(2～8)×103，因而表现出较好的生物药效，并且减少了毒作用。与普通肝素比较，LMWH作用时间长，生物利用度高，超低分子肝素被认为能够抑制冠状和外周动脉硬化的形成。因此，制备低分子质量的多糖及其硫酸酯化物，成为新药筛选的一个重要方向。但关于低分子量海带硫酸多糖(LPS)的研究还未有报道。
目前，国内外对多糖降解一般采用酸解法、碱解法、酶解法和超声波降解法。这些方法均存在以下不足：
1、酸解法：在酸性条件下，多糖降解产品分子量分布较难控制，特别是硫酸基损失较大。
2、碱解法：在碱性条件下，往往引起酸性多糖的改性及硫酸基的脱落，影响产品的活性，因此不适用于海藻硫酸多糖。
3、酶解法：是利用专一性糖苷酶通过开裂多糖中的某一糖苷键来达到降解的目的。但是由于酶的专一性强，因此不具有广泛的适用性，而且酶生产周期长，成本高，容易失去活性。这些缺点都使得该法目前无法推广应用。
4、物理降解法：包括超声波和微波等方法。这两种方法由于能耗高，仪器设备条件要求高，样品处理量小，目前无法应用于工业生产。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种海带硫酸多糖的降解方法，该方法降解速度快，试剂用量极少，工艺简单，成本低廉，多余过氧化氢容易分解去除，硫酸基和总糖含量基本保持不变，且分子量分布集中，分子量范围可以控制。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种海带硫酸多糖的降解方法，其特征在于首先从海带中提取并分离海带硫酸多糖，然后通过过氧化氢降解得到低分子量海带硫酸多糖。
上述海带硫酸多糖的过氧化氢降解方法，包括下述具体步骤：
(1)海带硫酸多糖的分离纯化
取海带用水浸泡溶胀后将海带粉碎，于95～100℃加热提取2～6h，冷却后过滤，取滤液加入氯化钙后离心，取上清液，向上清液中加入质量分数为2％～6％的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液与海带硫酸多糖结合得到悬浮液，所加入的十六烷基三甲基溴化铵的质量为多糖质量的30％～150％。将上述悬浮液加入离心机中离心沉淀，收集十六烷基三甲基溴化铵-海带硫酸多糖沉淀物，加入氯化钙盐解，使海带硫酸多糖游离释放出来，然后加入乙醇使海带硫酸多糖析出，离心沉淀得沉淀物，将所得沉淀物干燥即得到纯净的海带硫酸多糖；
(2)海带硫酸多糖的过氧化氢降解
取经步骤(1)纯化后的海带硫酸多糖溶解于水中，制成一定浓度的海带硫酸多糖溶液；然后向海带硫酸多糖溶液加入过氧化氢，搅拌均匀后使体系中过氧化氢的质量分数为5％～10％；使其在80～95℃下降解0.5～3小时；反应完毕后，冷却至室温，用0.1～5mol/L NaOH溶液调节多糖溶液pH值至6.0～8.0；将上述多糖溶液浓缩至原体积的1/2～1/4；冷却后用3～5倍量无水乙醇沉淀多糖，放置过夜后抽滤得到的沉淀物干燥，得到平均分子量为2000～20000的低分子量海带硫酸多糖产物。
所述步骤(1)中海带硫酸多糖的平均分子量在5万～150万之间，硫酸基含量为3％～30％。
所述步骤(2)中海带硫酸多糖溶液中海带硫酸多糖的质量分数为2％～8％。
本发明与现有技术相比具有如下突出的优点及有益效果：
(1)本发明所使用的方法降解速度快，试剂用量极少，工艺简单，成本低廉；
(2)多余过氧化氢容易分解去除，没有引入新的杂质，纯度高；
(3)硫酸基和总糖含量基本保持不变，且分子量分布集中，分子量范围可以控制；
(4)由于过氧化氢的漂白作用，所得低分子量硫酸多糖样品外观洁白。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)海带硫酸多糖的分离纯化
取海带加水浸泡2h，溶胀后的海带粉碎成海带浆。于95℃加热提取6h，冷至室温进行过滤。取滤液加入氯化钙，离心去除海藻酸钙。向上清液中加入浓度为3％(质量分数)的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)溶液与LPS结合沉淀，CTAB的加入质量为多糖质量的40％。3000r/min离心10min，收集CTAB-LPS沉淀物。加入氯化钙进行盐解，将LPS游离释放出来，然后加入乙醇使LPS析出，经离心烘干得纯净的LPS。其平均分子量为17.2万，主要为α-1，4-L古罗糖醛酸和β-1，4-D-甘露糖醛酸为单体构成的嵌段共聚物、α-L-岩藻糖-4-硫酸酯的多聚物和β-D-吡喃葡萄糖的多聚物组成，硫酸基含量为25％。
(2)海带硫酸多糖的过氧化氢降解
称取上述海带硫酸多糖12g，加热溶解于300mL蒸馏水中，搅拌均匀制成海藻硫酸多糖溶液；然后迅速加入100mL质量分数为30％过氧化氢，搅拌均匀后最终体系中过氧化氢浓度为5％；控制降解反应的温度为85℃，降解2.5小时；冷却后用1mol/L的NaOH溶液调节多糖溶液pH值至7.0，在65℃减压旋转蒸发，浓缩至原体积的1/4，用3倍量无水乙醇沉淀降解产物。抽滤，沉淀真空干燥，得到小分子量海带硫酸多糖，其平均分子量为3200，硫酸基含量为24％。
实施例2
(1)海带硫酸多糖的分离纯化
取海带加水浸泡2h，溶胀后的海带粉碎成海带浆。于100℃加热提取2h，冷至室温进行过滤。取滤液加入氯化钙，离心去除海藻酸钙。向上清液中加入浓度为4％(质量分数)的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)溶液与LPS结合沉淀，CTAB的加入质量为多糖质量的110％。3000r/min离心10min，收集CTAB-LPS沉淀物。加入氯化钙进行盐解，将LPS游离释放出来，然后加入乙醇使LPS析出，经离心烘干得纯净的LPS。其平均分子量为25.3万，主要为α-1，4-L古罗糖醛酸和β-1，4-D-甘露糖醛酸为单体构成的嵌段共聚物、α-L-岩藻糖-4-硫酸酯的多聚物和β-D-吡喃葡萄糖的多聚物组成，硫酸基含量为16％。
(2)海带硫酸多糖的过氧化氢降解
称取上述海带硫酸多糖24g，加热溶解于300mL蒸馏水中，搅拌均匀制成海藻硫酸多糖溶液；然后迅速加入200mL质量分数为30％过氧化氢，搅拌均匀后最终体系中过氧化氢浓度为10％；控制降解反应的温度为90℃，降解1小时；冷却后用3mol/L的NaOH溶液调节多糖溶液pH值至6.0，在55℃减压旋转蒸发，浓缩至原体积的1/2，用5倍量无水乙醇沉淀降解产物。抽滤，沉淀真空干燥，得到小分子量海带硫酸多糖，其平均分子量为9550，硫酸基含量为15％。
实施例3
(1)海带硫酸多糖的分离纯化
取海带加水浸泡2h，溶胀后的海带粉碎成海带浆。于100℃加热提取4h，冷至室温进行过滤。取滤液加入氯化钙，离心去除海藻酸钙。向上清液中加入浓度为5％(质量分数)的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)溶液与LPS结合沉淀，CTAB的加入质量为多糖质量的150％。3000r/min离心10min，收集CTAB-LPS沉淀物。加入氯化钙进行盐解，将LPS游离释放出来，然后加入乙醇使LPS析出，经离心烘干得纯净的LPS。其平均分子量为150万，主要为α-1，4-L古罗糖醛酸和β-1，4-D-甘露糖醛酸为单体构成的嵌段共聚物、α-L-岩藻糖-4-硫酸酯的多聚物和β-D-吡喃葡萄糖的多聚物组成，硫酸基含量为5％。
(2)海带硫酸多糖的过氧化氢降解
称取上述海带硫酸多糖24g，加热溶解于300mL蒸馏水中，搅拌均匀制成海藻硫酸多糖溶液；然后迅速加入150mL质量分数为30％过氧化氢，搅拌均匀后最终体系中过氧化氢浓度为9％；控制降解反应的温度为90℃，降解1小时；冷却后用5mol/L的NaOH溶液调节多糖溶液pH值至8.0，在50℃减压旋转蒸发，浓缩至原体积的1/2，用5倍量无水乙醇沉淀降解产物。抽滤，沉淀真空干燥，得到小分子量海带硫酸多糖，其平均分子量为20000，硫酸基含量为4.5％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种海带硫酸多糖的降解方法，其特征在于包括下述具体步骤：
(1)海带硫酸多糖的分离纯化
取海带用水浸泡溶胀后将海带粉碎，于95～100℃加热提取2～6h，冷却后过滤，取滤液加入氯化钙后离心，取上清液，向上清液中加入质量分数为2％～6％的十六烷基三甲基溴化铵溶液与海带硫酸多糖结合得到悬浮液，所加入的十六烷基三甲基溴化铵的质量为多糖质量的30％～150％，将上述悬浮液加入离心机中离心沉淀，收集十六烷基三甲基溴化铵-海带硫酸多糖沉淀物，加入氯化钙盐解，使海带硫酸多糖游离释放出来，然后加入乙醇使海带硫酸多糖析出，离心沉淀得沉淀物，将所得沉淀物干燥即得到纯净的海带硫酸多糖；
(2)海带硫酸多糖的过氧化氢降解
取经步骤(1)纯化后的海带硫酸多糖溶解于水中，制成一定浓度的海带硫酸多糖溶液；然后向海带硫酸多糖溶液加入过氧化氢，搅拌均匀后使体系中过氧化氢的质量分数为5％～10％；使其在80～95℃下降解0.5～3小时；反应完毕后，冷却至室温，用0.1～5mol/L NaOH溶液调节多糖溶液pH值至6.0～8.0；将上述多糖溶液浓缩至原体积的1/2～1/4；冷却后用3～5倍量无水乙醇沉淀多糖，放置过夜后抽滤得到的沉淀物干燥，得到平均分子量为2000～20000的低分子量海带硫酸多糖产物；
所述步骤(2)中海带硫酸多糖溶液中海带硫酸多糖的质量分数为2％～8％。
2.根据权利要求1所述的海带硫酸多糖的降解方法，其特征在于：所述步骤(1)中海带硫酸多糖的平均分子量在5万～150万之间，硫酸基含量为3％～30％。
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