CN101891904B - 一种海带寡糖及其制备方法和它的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种属于生物农药领域的海带寡糖及其制备方法。该海带寡糖是以海带多糖为原料，经自由基降解、酸解法、碱解法、盐解法、酶解法、超声波降解法或γ-射线降解法降解而得到的多种寡糖的混合物，所述海带寡糖的聚合度为2～30，分子量为342Da～8000Da，21g/L海带寡糖水溶液的旋光度为-11.9°～-12.1°。本发明还公开了该海带寡糖在制备防治植物病害药物方面的应用。该制备方法快速，简便，产率高，而且得到的海带寡糖对植物病害的防治功效要优于海带多糖。
Description
技术领域
本发明属于生物农药领域，特别涉及一种海带寡糖及其制备方法和它在制备防治植物病害药物方面的应用。
背景技术
生物农药是以生物体为原料而制成的一类农药。它的特点是安全可靠，不污染环境，对人畜不产生公害，而且原料易获得，生产成本低，是当前农作物病虫害防治中具有广阔发展前景的一种农药。法国国家科研中心与法国海洋研究所通力合作，从被称为“昆布”的海洋生物中获得了“昆布素”，并以其为主要原料成功研制出一种新型农药-“IODUS40”植物疫苗。该产品的问世打破了化学农药在农药市场上的垄断地位。该农药具有生物降解性、无毒，能事先引起农作物的生物防御反应，提高农作物的“免疫力”和抗病能力，使农作物能时刻做好准备，顶住病虫的“袭击”。因此，从某种角度讲，“IODUS40”是一种植物疫苗。据开发公司Goёmar估计，“IODUS40”可使全法国化学农药使用量降低25％，即3000吨杀虫剂，这会大大降低环境污染程度，使法国向绿色生态农业更进一步。现在，“IODUS40”已获得法国农业部颁发的使用许可证。
海带多糖作为生物农药，在2009年3月29日，美国环保署官方网站上公告，文件编号：File Symbol：83941-R，文件中提到拟批准登记法国LaboratoiresGoёmar公司的(Saint-Malo)生物农药，VacciPlant(海带多糖3.5％)，用于防控一系列水果和蔬菜的真菌与细菌病害。VacciPlant充当疾病抵抗活化剂的角色。美环保署称，海带多糖是一种自然产生的低聚糖，无毒性且食用后不对人体造成伤害，无需进行残留研究。
生物农药同化学农药相比更适合在有害生物综合防治策略中应用。因为生物农药一般在环境中较易降解，可降低对环境的污染，其中的不少品种具有靶标专一的选择性，使用后对人畜和非靶标生物相对安全。某些生物农药的作用方式是非毒杀性的，比化学合成农药的作用更为广泛。因此，不断寻找农作物病虫害防治效果更好的生物农药是非常必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种海带寡糖。
本发明的第二个目的在于提供上述海带寡糖的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供上述海带寡糖在制备防治植物病害药物方面的应用。
一种海带寡糖，该海带寡糖是以海带多糖为原料，经自由基降解法、酸解法、碱解法、盐解法、酶解法、超声波降解法或γ-射线降解法降解而得到的寡糖混合物；所述海带寡糖为白色粉末，针状晶体，聚合度为2-30，分子量为342Da-8000Da，21g/L海带寡糖水溶液的旋光度为-11.9°～-12.1°。
上述海带寡糖的制备方法，具体技术方案为：首先采用自由基降解法、酸解法、碱解法、盐解法、酶解法、超声波降解法或γ-射线降解法将海带多糖降解，然后减压蒸馏浓缩降解后的溶液至原体积的三分之一，再向浓缩后的溶液中加入其三倍体积的乙醇，混匀后结晶、真空干燥，从而得到海带寡糖；
所述自由基降解法是将海带多糖水溶液加热至20-90℃，然后向其中缓慢加入相当于海带多糖质量0.1-5％的引发剂，降解0.1-24小时；
所述酸解法是在20-100℃条件下，将海带多糖加入到0.1-11mol/L盐酸水溶液中；或将其加入到0.1-14mol/L硝酸水溶液中；或将其加入到0.1-14mol/L磷酸水溶液中；或将其加入到0.1-17mol/L硫酸水溶液中，降解0.1-24小时，其中海带多糖与酸的摩尔比小于1/100，零除外；
所述碱解法是在20-80℃条件下，向海带多糖水溶液中加入0.01-0.1mol/L氢氧化钠或氢氧化钾溶液，降解0.1-24小时，其中海带多糖与氢氧化钠或氢氧化钾的摩尔比小于1/100，零除外；
所述盐解法是在20-80℃条件下，将海带多糖加入到0.1-1wt％醋酸溶液，然后再加入0.1-4mol/L亚硝酸钠溶液，降解0.1-24小时，其中，海带多糖与醋酸的摩尔比小于1/100，零除外，海带多糖与亚硝酸钠的摩尔比小于1/100，零除外；
所述酶解法是在10-60℃条件下，将海带多糖水溶液pH值调节为2-6.8，然后向其中加入酶，其中酶与海带多糖的质量比为0.1-10∶100，所述酶为昆布多糖酶，岩藻多糖酶，几丁质酶，纤维素酶，溶菌酶，脂肪酶，壳聚糖酶，果胶酶，菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶中的一种或多种，降解0.1-24小时后用氢氧化钠调节pH值至6.5-7.5；
所述超声波降解法是在10-60℃条件下，将海带多糖水溶液采用振幅0.1-0.5cm、脉冲1-10s的超声波处理1-60min；
所述γ-射线降解法是在10-60℃条件下，向海带多糖水溶液中加入过氧化氢水溶液，其中海带多糖与过氧化氢的质量比小于1/100，零除外，采用γ射线辐照，辐照剂量10-400kGy，降解0.1-24小时。
所述自由基降解法中的引发剂为过氧化氢，或当量比为1～2∶1的氧化剂与还原剂的混合物，其中，所述氧化剂为过氧化氢或过硫酸钾，所述还原剂为硫代硫酸钠、亚硫酸钠或硫酸亚铁。
所述海带多糖水溶液的浓度为0.001-0.1g/mL。
一种包含上述海带寡糖的农药制剂，该制剂是浓度为0.001-0.1g/mL的海带寡糖的水溶液，将该制剂用水稀释200倍后，可直接喷于病害植物上。
所述海带寡糖在制备防治植物病害药物方面的应用，其中植物病害为真菌、细菌或病毒感染，比如，小麦叶锈病，小麦赤霉病，小麦粒线虫病，水稻稻瘟病，水稻细菌性褐条病，高粱大斑病，高粱坚黑穗病，玉米大斑病，玉米细菌性条纹病，向日葵茢当，向日葵褐斑病，大麦条纹病，水果溃疡病，水果炭疽病，烟草花叶病毒病，烟草猝倒病，黄瓜病毒病，黄瓜细菌性角斑病，瓜类枯萎病，棉花枯萎病，棉花细菌性角斑病，番茄晚疫病，茄科蔬菜青枯病，马铃薯早疫病，花生青枯病，花生根结线虫病等。植物可以为粮食植物、经济作物、蔬菜、果树等多种植物。
所述的原料海带多糖的核心结构是以α或β-(1→3或6)-D-葡萄糖为主链，含有少量α或β-(1→6或3)糖苷键支链的葡萄糖、甘露糖与半乳糖单元，部分羟基被硫酸酯化和磷酸酯化。
本发明的有益效果：本发明的海带寡糖是以海带多糖为原料，通过特定方法降解而成的理化性质更优的海带寡糖，制备方法快速，简便，产率高；该海带寡糖对细菌或真菌的防治功效要优于海带多糖。
具体实施方式
下面以实例来具体说明本发明的产品，制备及其在农作物上防治病害上的效果。以下实施例中所用原料海带多糖购自上海亿欣生物科技有限公司，多糖含量为95％，均重分子量为172000Da。
实施例1自由基降解法制备海带寡糖及应用
(1)制备
将0.01g/mL的海带多糖水溶液加热至60℃，然后向其中缓慢加入相当于海带多糖质量的1.5％的引发剂过氧化氢，降解4小时，然后减压蒸馏浓缩降解后的溶液至原体积三分之一，再向加入浓缩液中加入其三倍体积的乙醇，结晶并真空干燥，得到固体海带寡糖，产率为89％，纯度为95％。该寡糖为白色粉末，针状晶体，聚合度为18，分子量为3078Da，21g/L海带寡糖水溶液的旋光度为-12.1°。
(2)应用
A、将上述方法得到的海带寡糖配制成0.02g/mL的海带寡糖水溶液，然后将0.02g/mL的海带寡糖水溶液用水稀释200倍后喷洒到已被灰霉病菌轻度感染的45厘米高的西红柿的叶子上，对照组为3.5wt％海带多糖溶液稀释200倍，同时设定空白对照组清水。三天后通过计量实验组与空白对照组的病斑面积之比，确定防治病的效果。结果见表1。
表1实施例1所得海带寡糖抗西红柿灰霉病的结果
由表1可见，同海带多糖水溶液相比，海带寡糖水溶液在防治西红柿灰霉病的效果上更好，同时可以得知达到相同的处理效果，海带寡糖的使用浓度要低于海带多糖。
B、将上述0.02g/mL的海带寡糖水溶液用水稀释200倍后喷洒到已被黄萎菌轻度感染的棉花的叶子上，对照组仍为3.5wt％海带多糖溶液稀释200倍，同时设定空白对照组清水。三天后通过计量实验组与空白对照组的病斑面积之比，确定防治病的效果。结果见表2。
表2实施例1所得海带寡糖抗棉花黄萎菌病的结果
由表2可见，同海带多糖水溶液相比，海带寡糖水溶液在防治棉花黄萎菌病的效果上更好，同时可以得知达到相同的处理效果，海带寡糖的使用浓度要低于海带多糖。
C、将上述0.02g/mL的海带寡糖水溶液用水稀释200倍后直接喷洒到已被炭疽病菌轻度感染的辣椒的叶子上，对照处理为3.5wt％海带多糖水溶液稀释200倍，空白对照组为只喷清水。三天后通过计量实验组与空白对照组的病斑面积之比，确定防治病的效果。结果见表3。
表3实施例1所得海带寡糖抗辣椒炭疽病的结果
由表3可见，同海带多糖水溶液相比，海带寡糖水溶液在防治辣椒炭疽病菌的效果上更好，同时可以得知达到相同的处理效果，海带寡糖的使用浓度要低于海带多糖。
实施例2酸解法制备海带寡糖及应用
(1)制备
在80℃条件下，将1.3g海带多糖加入到40mL 0.2mol/L盐酸水溶液中，降解16小时，然后减压蒸馏浓缩降解后的溶液至原体积三分之一，再向加入浓缩液中加入其三倍体积的乙醇，结晶并真空干燥，得到固体海带寡糖，产率为90％，纯度为95％。该寡糖为白色粉末，针状晶体，聚合度为10，分子量为1710Da，，21g/L海带寡糖水溶液的旋光度为-11.9°。
(2)应用
将上述海带寡糖配制成0.02g/mL的水溶液，再用水稀释200倍后用于被黄萎菌轻度感染的棉花的叶子上，两组对照实验的设置同实施例1，得到的结果见表4。
表4实施例2所得海带寡糖抗棉花黄萎菌病的结果
由表4可见，同海带多糖水溶液相比，本实施例得到的海带寡糖水溶液在防治棉花黄萎菌病的效果上更好，同时可以得知达到相同的处理效果，海带寡糖的使用浓度要低于海带多糖。
实施例3碱解法制备海带寡糖及应用
(1)制备
所述碱解法是在60℃条件下，向10mL的0.1g/mL的海带多糖水溶液中加入100mL 0.05mol/L氢氧化钠溶液，降解20小时，然后减压蒸馏浓缩降解后的溶液至原体积三分之一，再向加入浓缩液中加入其三倍体积的乙醇，结晶并真空干燥，得到固体海带寡糖，产率为91％，纯度为94％。该寡糖为白色粉末，针状晶体，聚合度为15，分子量为2820Da，21g/L海带寡糖水溶液的旋光度为-12.0°。
(2)应用
将上述海带寡糖配制成0.02g/mL的水溶液，再用水稀释200倍后用于被炭疽病菌轻度感染的辣椒的叶子上，两组对照实验的设置同实施例1，得到的结果见表5。
表5实施例3所得海带寡糖抗辣椒炭疽病的结果
由表5可见，同海带多糖水溶液相比，该实施例得到的海带寡糖水溶液在防治辣椒炭疽病菌的效果上更好，同时可以得知达到相同的处理效果，海带寡糖的使用浓度要低于海带多糖。
实施例4盐解法制备海带寡糖及应用
(1)制备
在70℃条件下，将1.2g海带多糖加入到100mL 0.6wt％醋酸溶液，然后再加入100mL 0.1mol/L亚硝酸钠溶液，降解18小时，然后减压蒸馏浓缩降解后的溶液至原体积三分之一，再向加入浓缩液中加入其三倍体积的乙醇，结晶并真空干燥，得到固体海带寡糖，产率为90.3％，纯度为93％。该寡糖为白色粉末，针状晶体，聚合度为12，分子量为2108Da，21g/L海带寡糖水溶液的旋光度为-12.1°。
(2)应用
将上述海带寡糖配制0.02g/mL的水溶液，再用水稀释200倍后用于被灰霉病菌轻度感染的西红柿的叶子上，两组对照实验的设置同实施例1，得到的结果见表6。
表6实施例4所得海带寡糖抗西红柿灰霉病的结果
由表6可见，同海带多糖水溶液相比，该实施例得到的海带寡糖水溶液在防治西红柿灰霉病的效果上更好，同时可以得知达到相同的处理效果，海带寡糖的使用浓度要低于海带多糖。
实施例5酶解法制备海带寡糖及应用
(1)制备
在37℃条件下，将0.01g/mL海带多糖水溶液pH值调节为5，然后按1∶1的质量比加入果胶酶和昆布多糖酶，其中酶的总量与海带多糖的质量比为1∶100，降解16小时后用氢氧化钠调节pH值至7.0，然后减压蒸馏浓缩降解后的溶液至原体积三分之一，再向加入浓缩液中加入其三倍体积的乙醇，结晶并真空干燥，得到固体海带寡糖，产率为90％，纯度为95％。该寡糖为白色粉末，针状晶体，聚合度为23，分子量为5624Da，21g/L海带寡糖水溶液的旋光度为-12.0°。
(2)应用
将上述海带寡糖配制成0.02g/mL的水溶液，再用水稀释200倍后用于被灰霉病菌轻度感染的西红柿的叶子上，两组对照实验的设置同实施例1，得到的结果见表7。
表7实施例5所得海带寡糖抗西红柿灰霉病的结果
由表7可见，同海带多糖水溶液相比，该实施例得到的海带寡糖水溶液在防治西红柿灰霉病的效果上更好，同时可以得知达到相同的处理效果，海带寡糖的使用浓度要低于海带多糖。
实施例6超声波降解法制备海带寡糖及应用
(1)制备
在40℃条件下，将0.05g/mL海带多糖水溶液采用振幅0.3cm、脉冲5s的超声波处理30min，然后减压蒸馏浓缩处理后的溶液至原体积三分之一，再向加入浓缩液中加入其三倍体积的乙醇，结晶并真空干燥，得到固体海带寡糖，产率为89％，纯度为96％。该寡糖为白色粉末，针状晶体，聚合度为24，分子量为5931Da，21g/L海带寡糖水溶液的旋光度为-11.9°。
(2)应用
将上述海带寡糖配制成0.02g/mL的水溶液，再用水稀释200倍后用于被炭疽病菌轻度感染的辣椒的叶子上，两组对照实验的设置同实施例1，得到的结果见表8。
表8实施例6所得海带寡糖抗辣椒炭疽病的结果
由表8可见，同海带多糖水溶液相比，该实施例得到的海带寡糖水溶液在防治辣椒炭疽病菌的效果上更好，同时可以得知达到相同的处理效果，海带寡糖的使用浓度要低于海带多糖。
实施例7γ-射线降解法制备海带寡糖及应用
(1)制备
在40℃条件下，向0.005g/mL海带多糖水溶液中加入过氧化氢水溶液，其中海带多糖与过氧化氢的质量比为1∶200，采用γ射线辐照，辐照剂量80kGy，降解2小时，然后减压蒸馏浓缩降解后的溶液至原体积三分之一，再向加入浓缩液中加入其三倍体积的乙醇，结晶并真空干燥，得到固体海带寡糖，产率为91％，纯度为93％。该寡糖为白色粉末，针状晶体，聚合度为28，分子量为7159Da，21g/L海带寡糖水溶液的旋光度为-12.1°。
(2)应用
将上述海带寡糖配制成0.02g/mL的水溶液，再用水稀释200倍后用于被黄萎菌轻度感染的棉花的叶子上，两组对照实验的设置同实施例1，得到的结果见表9。
表9实施例7所得海带寡糖抗棉花黄萎菌病的结果
由表9可见，同海带多糖水溶液相比，本实施例得到的海带寡糖水溶液在防治棉花黄萎菌病的效果上更好，同时可以得知达到相同的处理效果，海带寡糖的使用浓度要低于海带多糖。
Claims (1)
1.一种海带寡糖在制备防治西红柿灰霉病、棉花黄萎菌病或辣椒炭疽病的药物中的用途，其特征在于，所述海带寡糖的制备方法如下：
将0.01g/mL的海带多糖水溶液加热至60℃，然后向其中缓慢加入占海带多糖质量的1.5％的过氧化氢，降解4小时，然后减压蒸馏浓缩降解后的溶液至原体积三分之一，再向浓缩液中加入其三倍体积的乙醇，结晶并真空干燥，得到固体海带寡糖，产率为89％，纯度为95％；该海带寡糖为白色粉末，针状晶体，聚合度为18，分子量为3078Da，21g/L海带寡糖水溶液的旋光度为-12.1°，该海带寡糖可制备防治西红柿灰霉病、棉花黄萎菌病或辣椒炭疽病的药物；
或者，在80℃条件下，将1.3g海带多糖加入到40mL 0.2mol/L盐酸水溶液中，降解16小时，然后减压蒸馏浓缩降解后的溶液至原体积三分之一，再向浓缩液中加入其三倍体积的乙醇，结晶并真空干燥，得到固体海带寡糖，产率为90％，纯度为95％；该海带寡糖为白色粉末，针状晶体，聚合度为10，分子量为1710Da，21g/L海带寡糖水溶液的旋光度为-11.9°，该海带寡糖制备防治棉花黄萎菌病的药物；
或者，碱解法是在60℃条件下，向10mL的0.1g/mL的海带多糖水溶液中加入100mL 0.05mol/L氢氧化钠溶液，降解20小时，然后减压蒸馏浓缩降解后的溶液至原体积三分之一，再向浓缩液中加入其三倍体积的乙醇，结晶并真空干燥，得到固体海带寡糖，产率为91％，纯度为94％；该海带寡糖为白色粉末，针状晶体，聚合度为15，分子量为2820Da，21g/L海带寡糖水溶液的旋光度为-12.0°；该海带寡糖制备防治辣椒炭疽病的药物；
或者，在70℃条件下，将1.2g海带多糖加入到100mL 0.6wt％醋酸溶液，然后再加入100mL 0.1mol/L亚硝酸钠溶液，降解18小时，然后减压蒸馏浓缩降解后的溶液至原体积三分之一，再向浓缩液中加入其三倍体积的乙醇，结晶并真空干燥，得到固体海带寡糖，产率为90.3％，纯度为93％；该海带寡糖为白色粉末，针状晶体，聚合度为12，分子量为2108Da，21g/L海带寡糖水溶液的旋光度为-12.1°；该海带寡糖制备防治西红柿灰霉病的药物；
或者，在37℃条件下，将0.01g/mL海带多糖水溶液pH值调节为5，然后按1∶1的质量比加入果胶酶和昆布多糖酶，其中酶的总量与海带多糖的质量比为1∶100，降解16小时后用氢氧化钠调节pH值至7.0，然后减压蒸馏浓缩降解后的溶液至原体积三分之一，再向浓缩液中加入其三倍体积的乙醇，结晶并真空干燥，得到固体海带寡糖，产率为90％，纯度为95％；该海带寡糖为白色粉末，针状晶体，聚合度为23，分子量为5624Da，21g/L海带寡糖水溶液的旋光度为-12.0°；该海带寡糖制备防治西红柿灰霉病的药物；
或者，在40℃条件下，向0.005g/mL海带多糖水溶液中加入过氧化氢水溶液，其中海带多糖与过氧化氢的质量比为1∶200，采用γ射线辐照，辐照剂量80kGy，降解2小时，然后减压蒸馏浓缩降解后的溶液至原体积三分之一，再向浓缩液中加入其三倍体积的乙醇，结晶并真空干燥，得到固体海带寡糖，产率为91％，纯度为93％；该海带寡糖为白色粉末，针状晶体，聚合度为28，分子量为7159Da，21g/L海带寡糖水溶液的旋光度为-12.1°；该海带寡糖制备防治棉花黄萎菌病的药物。
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