CN108276500A - 一种通过果胶酶解得到的新型抗肿瘤化合物 - Google Patents

一种通过果胶酶解得到的新型抗肿瘤化合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种新型抗肿瘤化合物，以黑灵芝为原料，经过提取、精制分离、果胶酶解得到产物PSG‑果，能够刺激巨噬细胞，明显增强巨噬细胞的吞噬能力和细胞上清中TNF‑α的蛋白表达量，使机体的免疫功能加强，进而增强抵抗疾病的能力。对DPPH自由基的清除效果较好，具有较强的还原能力，可用于抗肿瘤。

Description

一种通过果胶酶解得到的新型抗肿瘤化合物
技术领域
本发明涉及一种新型抗肿瘤化合物，尤其涉及一种通过果胶酶解得到的新型抗肿瘤化合物。
背景技术
近年来随着人们生活方式的改变和医疗技术的提高，肿瘤检出人数也呈增高趋势，肿瘤已成为对人类健康造成严重威胁的重要疾病之一，由于对患者机体具有较高的损害性和较高的病死率，抗肿瘤药物的应用和研究一直是人们所关注的焦点，新的治疗理论和新型药物不断被开发和应用。
科学家们合成了许多分子靶标明确的抗肿瘤分子药物，但是由于化学合成药物的开发周期长以及研发费用昂贵，且临床毒副作用大，制约了药物的进一步研发和应用。中草药和植物药等天然药用材料中存在着广泛的生物活性物质，研究者可从中药中寻找毒副作用小、药理作用独特的抗肿瘤药物及抗肿瘤辅助药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型抗肿瘤药物，对免疫巨噬细胞则有明显的激活作用，通过刺激机体的免疫功能来消灭肿瘤细胞，而不是通过细胞毒作用直接抗肿瘤。
本发明的技术方案如下：
一种通过果胶酶解得到的新型抗肿瘤化合物，制备方法为：
(1)取干燥黑灵芝药材100g，加95％乙醇室温浸泡提取48h，过滤，重复一次，药渣于室温下置通风处晾干，然后将药渣与蒸馏水按质量体积(kg/L)比为1：20的比例混合，回流提取两次，每次提取时间依次为2h，1h，合并提取液，离心分离，减压浓缩；所得样品加入适量的95％乙醇使溶液中使得乙醇的体积分数为80％，然后进行沉淀，4℃下静置24h，离心过滤；沉淀物合并，依次以无水乙醇、无水乙醚、丙酮洗涤沉淀物，冷冻干燥得样品；取得到的干燥样品，以Sevag法除蛋白，即Sevag试剂(体积比氯仿∶正丁醇＝5∶1)和干燥样品以质量比1∶1混匀，静置，除去下层蛋白质变性层；将样品浓缩，重复除蛋白操作10次；浓缩除蛋白样品后用95％乙醇洗涤，再浓缩，冻干得粗提物样品；将粗提物样品使用透析袋透析3天，将袋内样品浓缩至小体积，冷冻干燥，得黑灵芝精提物；
(2)取上述得到的黑灵芝精提物500mg，加入蒸馏水配成浓度为3～5mg/mL的溶液，离心，上清液过凝胶柱层析，使用的层析系统是 Purifier 100生物大分子纯化系统，凝胶柱Hiload 26/60Superdex-200prep grade，上样前将样品和洗脱液过0.22μm微孔滤膜以保护分离柱，洗脱液为蒸馏水，流速为2mL/min，上样体积为5mL，分部收集体积为8mL/管，紫外检测器和示差折光检测器检测(RID-10A示差检测器)在线监测洗脱情况；取第6-14管合并，浓缩，冷冻干燥得到黑灵芝提取物PSG，为黄色或棕色的絮状固体；
(3)取PSG100mg，加30mL 100mM醋酸盐缓冲液(pH4.0)，用50μL果胶酶进行酶解，加盖，于37℃下保温24h，经中和后迅速升温至60℃灭酶5min，抽滤得酶解产物，并通过SephadexG-50凝胶柱色谱分离，获得酶解主产物PSG-果。
所述果胶酶为生化试剂，由Sigma公司生产。
本发明得到的果胶酶解产物PSG-果能够刺激巨噬细胞，明显增强巨噬细胞的吞噬能力和细胞上清中TNF-α的蛋白表达量，使机体的免疫功能加强，进而增强抵抗疾病的能力。对DPPH自由基的清除效果较好，具有较强的还原能力，可用于抗肿瘤。
附图说明
图1为PSG-果的高效凝胶渗透色谱图。
图2为PSG-果和PSG的红外光谱图。
图3为PSG-果清除DPPH自由基的能力示意图。
图4为硫酸亚铁标准曲线图。
具体实施例
实施例1：一种通过果胶酶解得到的新型抗肿瘤化合物，制备方法为：
(1)取干燥黑灵芝药材100g，加95％乙醇室温浸泡提取48h，过滤，重复一次，药渣于室温下置通风处晾干，然后将药渣与蒸馏水按质量体积(kg/L)比为1：20的比例混合，回流提取两次，每次提取时间依次为2h，1h，合并提取液，离心分离，减压浓缩；所得样品加入适量的95％乙醇使溶液中使得乙醇的体积分数为80％，然后进行沉淀，4℃下静置24h，离心过滤；沉淀物合并，依次以无水乙醇、无水乙醚、丙酮洗涤沉淀物，冷冻干燥得样品；取得到的干燥样品，以Sevag法除蛋白，即Sevag试剂(体积比氯仿∶正丁醇＝5∶1)和干燥样品以质量比1∶1混匀，静置，除去下层蛋白质变性层；将样品浓缩，重复除蛋白操作10次；浓缩除蛋白样品后用95％乙醇洗涤，再浓缩，冻干得粗提物样品；将粗提物样品使用透析袋透析3天，将袋内样品浓缩至小体积，冷冻干燥，得黑灵芝精提物；
(2)取上述得到的黑灵芝精提物500mg，加入蒸馏水配成浓度为3～5mg/mL的溶液，离心，上清液过凝胶柱层析，使用的层析系统是 Purifier 100生物大分子纯化系统，凝胶柱Hiload 26/60Superdex-200prep grade，上样前将样品和洗脱液过0.22μm微孔滤膜以保护分离柱，洗脱液为蒸馏水，流速为2mL/min，上样体积为5mL，分部收集体积为8mL/管，紫外检测器和示差折光检测器检测(RID-10A示差检测器)在线监测洗脱情况；取第6-14管合并，浓缩，冷冻干燥得到黑灵芝提取物PSG，为黄色或棕色的絮状固体；
(3)取PSG100mg，加30mL 100mM醋酸盐缓冲液(pH4.0)，用50μL果胶酶进行酶解，加盖，于37℃下保温24h，经中和后迅速升温至60℃灭酶5min，抽滤得酶解产物，并通过SephadexG-50凝胶柱色谱分离，获得酶解主产物PSG-果。
一、产物的理化性质
对实施例1制得PSG-果进行红外光谱分析，同时测定纯度、平均分子量、糖醛酸含量。
(1)纯度鉴定
用高效渗透凝胶色谱法进行纯度的检测，取测试样品3mg溶于1mL蒸馏水，1000rpm离心10min，用微孔过滤膜过滤后自动上样20μL，记录洗脱曲线用于判定该组分的纯度。
实验所用的HPLC的具体测试条件如下：
色谱柱为UltrahydrogelTM500 300mm×7.8mmid；流动相为0.1MNaCl；流速0.6mL/min；柱温35℃。
(2)分子量测定
液相色谱柱为UltrahydrogelTM500 300mm×7.8mmid，流动相为0.1MNaCl，流速为0.6mL/min，柱温为35℃。
配制各标准品Glc，T10，T40，T70，T500，T2000 2％溶液，各溶液在HPLC进样后得到相应的液相图谱。设定T2000的洗脱体积为柱的空体积V0，Glc的洗脱体积作为柱的总体积Vt，以公式Kav＝(Ve-V0)/(Vt-V0)计算，以LogMw-Kav作图得标准曲线。根据样品的Ve，从标准曲线上即得样品的分子量。由于洗脱液的流速恒定，所以可以绘制出保留时间与分子量关系的标准曲线，根据其回归方程即可求得各产物的分子量。
(3)糖醛酸含量测定
a、采用改良的硫酸咔唑法，以半乳糖醛酸为标准测定糖醛酸的含量。
b、高效液相色谱法
色谱条件
色谱柱：Sugar-PakⅠ(300mm×6.5mm)，流动相：0.0001mol/L EDTA水溶液，流速：0.6mL/min，示差检测器，柱温：90℃，示差检测池温度：40℃，进样量：20μL。
标准曲线的绘制
精密称取半乳糖醛酸对照品适量，加超纯水溶解，摇匀，制得0.16432，0.32864，0.49296，0.65728，0.8216，0.98592，1.15024，1.31456，1.47888mg/mL的系列标准溶液。按上述色谱条件分别进样20μL，测定半乳糖醛酸峰面积，以半乳糖醛酸峰面积为横坐标，对照品浓度(mg/mL)为纵坐标，绘制标准曲线。求得回归方程。
样品糖醛酸含量的测定
分别称取一定量的样品，加超纯水溶解并定容至10mL，配制得到样品溶液。按标准曲线制作时的色谱条件测定，由回归方程计算样品中糖醛酸的含量。
(4)红外光谱(IR)分析
取1-2mg样品，用KBr压片进行常规IR分析，红外光谱仪测定参数如下：背景扫描次数：128次；分辨率：4.0cm-1；检测器：DTGS。
表1 PSG-果和PSG的糖醛酸含量和平均分子量
果胶酶主要功能是通过裂解或β消去作用切断多糖链中D-半乳糖醛酸的α-1,4糖苷键的裂解，使其裂解为多聚半乳糖醛酸。从表1的结果可知，PSG经果胶酶解后，得到的主要酶解产物PSG-果的平均分子量和糖醛酸含量都急剧下降，说明酶解反应比较成功，这点从图2的红外光谱图中也可以看出。
二、功能活性研究
1.体外免疫活性实验
(1)巨噬细胞的分离与纯化
取2只小鼠颈椎脱臼处死，先放入碘伏中3～5min，再放入体积分数75％酒精中浸泡5min脱色，腹腔注入10mL PBS缓冲液，用棉球轻揉腹部1～2min后吸取腹腔液于离心管中，以1000r/min离心5min，弃上清液收集巨噬细胞，胎盼兰染色证实细胞存活率在95％以上，用RPMI-1640培养液调整细胞密度至1.5×105个/mL。将巨噬细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，置二氧化碳培养箱(5％CO2、37℃)培养3h后，轻轻吸弃培养液，用PBS洗去未贴壁细胞，即得到纯化的腹腔巨噬细胞。
(2)试验分组及处理
将纯化的巨噬细胞用RPMI-1640培养液调整细胞密度为5×105/mL，并分为空白对照组(PBS)、阳性对照组(LPS)和不同剂量的给药组接种于96孔培养板中，每组设3个重复孔。每孔培养液总体积100μL，给药组添加GP的终浓度分别为0、10、100、200、400μg/mL，阳性对照组RPMI-1640培养液含LPS终浓度为2μg/mL。将各试验组均置于二氧化碳培养箱(5％CO2、37℃)中孵育至所需的时间，根据测定方法的不同进行不同处理，测定各个指标。
(3)巨噬细胞吞噬能力的检测
参考王晓京的方法进行。调节巨噬细胞的浓度5×105/mL，以每孔100μ1接种于96孔板，置5％CO2，37℃培养箱培养3h后洗去未贴壁细胞。每孔加入100μL含10％小牛血清的RPMI-1640，按所需剂量加入药物进行培养。培养48h后，每孔加入0.1％中性红生理盐水溶液100μ1，继续培养4h，倾去上清液，用PBS洗3遍，每孔加入细胞溶解液(冰醋酸:乙醇＝1:1)100μL，4℃下放置2-3h，待细胞溶解后在酶标仪上测定540nm处吸光度。
(4)TNF-α的蛋白表达检测
TNF-α的诱生：制备的巨噬细胞，加入100μg/mL的样品，在5％CO2，37℃下孵育48h后，收集巨噬细胞上清，-70℃保存，供测定TNF-α活性时使用。
细胞上清TNF-α的Western blot法：以牛血清白蛋白为标准蛋白，用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，样品分装-70℃保存。根据各样品蛋白浓度计算上样体积，将细胞上清液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。再通过电泳将凝胶上的样本转印到PDVF膜上。加入一抗Goat anti-TNF-α进行4℃孵育10～14h，然后加入HRP标记的二抗Rabbit anti-goatIg-G温育，最后采用ECL法进行显色定影,以β-actin作内参。
(5)统计学处理
所有数据以均数±标准差(x±s)表示，用SPSS11.0统计软件对数据进行处理，检验水准ɑ＝0.05。
2.体外抗氧化活性实验
(1)对DPPH自由基的清除作用
由于本发明产物不溶于高浓度的乙醇溶液，所以要测定本发明产物对DPPH自由基的清除作用，还需要对其方法进行一定的改良，改良后的方法如下：
DPPH以95％乙醇配成0.2mmol/L溶液。取1mL不同浓度的样品溶液，2mL新鲜配制的DPPH乙醇溶液和2mL 95％乙醇于同一具塞试管中，充分混匀，于暗处反应30min后，取出于525nm处测定吸光度。空白组用2mL 95％乙醇代替DPPH溶液，对照组为2mL DPPH溶液与3mL95％乙醇混合。每组样品一式三份，取平均值。
反应体系吸光度越低，说明清除DPPH自由基能力越强，DPPH自由基清除率计算公式为：
清除率＝[1-(Ai-Aj)/Ac]×100％
其中，Ai为样品组吸光度值，Aj为空白组吸光度值，Ac为对照组吸光度值。
(2)总还原能力的测定
样品总还原能力的测定采用铁离子还原能力法(FRAP)。
试剂配制：10mmol/L 2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪(TPTZ)溶液：称取0.0312g TPTZ，用40mmol/L盐酸溶液定容至10mL；FRAP工作液：300mmol/L pH3.6的醋酸盐缓冲液，10mmol/L TPTZ溶液以及20mmol/L的三氯化铁溶液以10:1:1组成。
标准曲线：取不同浓度0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mmol/L的硫酸亚铁标准液0.2mL于反应管中，分别加入6mL FRAP工作液以及0.6mL超纯水，混匀后，准确反应5min，在593nm下测定吸光度，超纯水作为空白。以硫酸亚铁溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，作标准曲线。
在相同条件下测定一定浓度的样品，平行三次，取平均值。样品的还原能力以FRAP值来表示，单位为mmol/g，FRAP值越大，表示还原能力越强。
3.结果与讨论
(1)各受试物对巨噬细胞吞噬能力的影响
非特异性免疫应答是机体生来就有的免疫特性，例如机体皮肤表面的自然屏障，对病毒复制的干扰，吞噬细胞对异物的吞噬等生理的、化学的及细胞的防御。巨噬细胞参与非特异性免疫，其吞噬功能是免疫系统维持自身内环境稳定的重要手段，也是机体产生免疫应答的基础，大多数抗原经巨噬细胞处理后，免疫原性大大增加。因此吞噬是非特异性免疫的关键环节。测定小鼠巨噬细胞的吞噬能力，一般是观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的情况，通过计数来计算吞噬百分率。本发明是采用细胞培养液中添加不同终浓度的受试物，测定巨噬细胞吞噬中性红的能力，根据测定OD值的大小来判定各样品对巨噬细胞吞噬能力的影响。
表2 PSG及PSG-果对巨噬细胞吞噬中性红的影响(x±s,n＝3)
注：▲与空白对照组相比p<0.05，▲▲与空白组相比p<0.01；
从表2的测定结果看：A540值各受试物组均极显著高于空白对照PBS组(p<0.05)，表明小鼠巨噬细胞在PSG-果样品的诱导下，吞噬中性红的能力明显提高，并且随着药物添加浓度的增加，巨噬细胞的吞噬能力也明显增加。与PSG相比，巨噬细胞吞噬能力的刺激也有所增加。
(2)各受试物对细胞上清TNF-α的蛋白表达的影响
TNF-α主要是由激活的巨噬细胞产生的一种内源性细胞因子，是一种具有广泛重要生物学作用的蛋白质。它能作用于淋巴细胞、肝细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞，使机体的免疫功能加强，进而增强抵抗疾病的能力。我们利用Westernblot法检测了PSG和PSG-果对小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中TNF-α蛋白表达情况的影响。
表3 PSG及PSG-果对巨噬细胞上清TNF-α蛋白表达的影响(x±s,n＝3)
表3的结果表明，PSG-果刺激巨噬细胞，其细胞上清中TNF-α的蛋白表达量与未酶解前相比显著提高，大约达到PSG的3倍以上。
(3)各受试物对DPPH自由基的清除作用
由图3可知，PSG经果胶酶处理后，其清除DPPH自由基的能力增强，且随着添加浓度的增加，其清除效果愈好。
(4)各受试物总还原能力的测定
许多研究证实，抗氧化活性与还原力有关。还原力是表示抗氧化物质提供电子能力的重要指标，可以通过提供电子使自由基变为稳定的物质，以中断自由基的连锁反应。也有研究表明还原能力与还原酮的存在有关，还原酮可提供氢原子，中止自由基的链式反应；同时，它还能够与过氧化物的前提物质反应阻止过氧化物的产生，从而起到抗氧化的作用。
本实验利用铁离子还原能力的方法测定PSG及其衍生物的还原能力。抗氧化剂能将Fe3+还原为Fe2+，Fe2+与三吡啶三吖嗪(TPTZ)络合生成蓝色物质，在593nm处有特征吸收，吸光度与浓度呈正相关，吸光度越大，FRAP值也越大，也就说明抗氧化剂效果越好。硫酸亚铁含量的标准曲线如图4所示，同时对不同样品进行测定，平行三次，通过标准曲线换算出FRAP值，所得结果见表4。
从表4中可知，PSG具有较强的还原能力，甚至超过对照物BHT。PSG-果的还原能力比起PSG有所提高，结论和清除DPPH自由基一致。
表4 PSG-果和PSG的总还原能力(FRAP值)
处理(Treatment) FRAP Value(mmol/g)
PSG 0.2066
PSG-果 0.227
BHT 0.1594

Claims (1)

1.一种通过果胶酶解得到的新型抗肿瘤化合物，其特征在于：制备方法为：
(1)取干燥黑灵芝药材100g，加95％乙醇室温浸泡提取48h，过滤，重复一次，药渣于室温下置通风处晾干，然后将药渣与蒸馏水按质量体积(kg/L)比为1：20的比例混合，回流提取两次，每次提取时间依次为2h，1h，合并提取液，离心分离，减压浓缩；所得样品加入适量的95％乙醇使溶液中使得乙醇的体积分数为80％，然后进行沉淀，4℃下静置24h，离心过滤；沉淀物合并，依次以无水乙醇、无水乙醚、丙酮洗涤沉淀物，冷冻干燥得样品；取得到的干燥样品，以Sevag法除蛋白，即Sevag试剂(体积比氯仿∶正丁醇＝5∶1)和干燥样品以质量比1∶1混匀，静置，除去下层蛋白质变性层；将样品浓缩，重复除蛋白操作10次；浓缩除蛋白样品后用95％乙醇洗涤，再浓缩，冻干得粗提物样品；将粗提物样品使用透析袋透析3天，将袋内样品浓缩至小体积，冷冻干燥，得黑灵芝精提物；
(2)取上述得到的黑灵芝精提物500mg，加入蒸馏水配成浓度为3～5mg/mL的溶液，离心，上清液过凝胶柱层析，使用的层析系统是Purifier 100生物大分子纯化系统，凝胶柱Hiload 26/60Superdex-200prep grade，上样前将样品和洗脱液过0.22μm微孔滤膜以保护分离柱，洗脱液为蒸馏水，流速为2mL/min，上样体积为5mL，分部收集体积为8mL/管，紫外检测器和示差折光检测器检测(RID-10A示差检测器)在线监测洗脱情况；取第6-14管合并，浓缩，冷冻干燥得到黑灵芝提取物PSG，为黄色或棕色的絮状固体；
(3)取PSG100mg，加30mL 100mM醋酸盐缓冲液(pH4.0)，用50μL果胶酶进行酶解，加盖，于37℃下保温24h，经中和后迅速升温至60℃灭酶5min，抽滤得酶解产物，并通过SephadexG-50凝胶柱色谱分离，获得酶解主产物PSG-果。
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