CN103735654A - 一种具有双向免疫调节作用的中药提取物和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了具有双向免疫调节作用的马甲子提取物及其作为制备治疗免疫功能异常疾病药物的用途。所述中药提取物为马甲子叶、马甲子根、马甲子茎叶或马甲子全株植物的甲醇、乙醇、乙酸乙酯、石油醚或类似溶媒提取物，主要含有萜类、黄酮类、生物碱类、香豆素类（包括上述物质的苷类和单体）、多糖类、纤维素等，其制剂包括片剂、胶囊剂、贴膏剂、颗粒剂、注射剂、栓剂、软膏剂、凝胶剂、涂膜剂、搽剂、洗剂和喷雾剂。马甲子提取物及其制剂具有双向免疫调节作用，可作为制备治疗免疫功能低下或自身免疫性疾病药物的应用。
Description
技术领域
本发明涉及中药技术领域，尤其涉及的是一种具有双向免疫调节作用的中药提取物和用途，具体是马甲子提取物及其制剂用于制备免疫功能低下及自身免疫性疾病药物的用途。
背景技术
人体的免疫功能是机体抵抗细菌、病毒入侵，清除体内损伤变性及衰老的细胞，清除体内代谢废物，维持机体内环境的稳定的重要机能。免疫功能紊乱是多种疾病的始动因素，也可在多种疾病病程中产生并加重病情。
免疫功能低下根据发病原因不同，可将免疫功能低下分为原发性和继发性两类。原发性是先天发育不全所致，大多数与遗传有关，多发生于儿童；继发性则由病毒、细菌、真菌等感染或药物、肿瘤、疲劳、失眠、营养不良、压力过大等原因引起，可见于各种年龄的人群，多数病后体弱，易发感染性疾病者属继发性免疫力低下。目前具有免疫增强功效的药物较多，如胸腺肽制剂、白介素-2、特异性免疫核糖核酸及转移因子、干扰素、左旋咪唑等，一些中药如人参、黄芪等也被认为有免疫增强作用。
免疫功能异常则常可引发或见于自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、红斑狼疮、硬皮病、甲状腺机能亢进、青少年糖尿病、原发性血小板紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、慢性肝病等，通常为难治性或致死性疾病。目前常用免疫抑制剂治疗，如肾上腺皮质激素、环孢菌素、雷公藤多苷、抗白介素-2单克隆抗体等。这些药物通常具有明显的毒副作用，安全窗较窄。
由于免疫低下患者本身的易感性，他们也容易收到细菌或病毒感染而产生自身免疫性疾病，进而表现为免疫功能低下和某些免疫功能异常亢进并存的状况，例如，红斑狼疮即表现为体液免疫亢进而细胞免疫低下。某些药物被认为具有免疫功能双向调节作用，如CN1241413公开了一种双向免疫调节剂的生产方法，CN1110303 C公开了一种具有抗病毒作用的植物提取物双向免疫调节剂，CN101224300 A公开了一种具有免疫调节作用的重组大肠杆菌外膜蛋白。总体来说，此类药物与单纯的免疫增强或抑制剂相比数量较少而需求较多。
马甲子（Paliurus ramosissimus (Lour.) Poir）为落叶灌木，是一种常见药用植物，据报道枝叶根花果均药用。性味苦、平，无毒。能除寒活血，发表解热，消肿，治跌打损伤及心腹疼痛。收载于《中药大辞典》及一些地方药物志。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种制备治疗免疫功能低下或（和）自身免疫性疾病的药物及其制备方法，具体是马甲子提取物用于制备治疗免疫功能低下相关疾病或（和）自身免疫性疾病的药物。免疫功能低下相关疾病或（和）自身免疫性疾病包括：感冒易感、体虚、艾滋病、类风湿性关节炎、红斑狼疮、硬皮病、甲状腺机能亢进、青少年糖尿病、原发性血小板紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、慢性肝病等。
本发明的技术方案如下：
一种用于制备治疗免疫功能低下相关疾病或（和）自身免疫性疾病药物的马甲子提取物，其特征在于，取马甲子全株植物或其中任一部位，加入马甲子体积的1-20倍的甲醇或乙醇提取，或者将甲醇或乙醇提取物进一步用乙酸乙酯或石油醚提取；提取液浓缩后干燥，制得马甲子提取物。
所述的马甲子提取物，马甲子为鲜品、冷冻干燥品或甲醇、乙醇、异丙醇等封存处理的样品；提取方法包括浸渍、回流或渗漉；干燥方法包括减压干燥、冷冻干燥、喷雾干燥或微波干燥。
所述的马甲子提取物，成分包括萜类、黄酮类、生物碱类、香豆素类、多糖类、纤维素类以及萜类、黄酮类、生物碱类、香豆素类的苷类和单体。
所述的马甲子提取物的制剂，包括马甲子提取物的片剂、胶囊剂、贴膏剂、颗粒剂、注射剂、栓剂、软膏剂、凝胶剂、涂膜剂、搽剂、洗剂和喷雾剂。
所述的马甲子提取物的应用，应用于制备治疗免疫功能低下相关疾病或（和）自身免疫性疾病的药物，包括单独使用马甲子提取物或以马甲子提取物为主要活性成分的药物组合物在制备治疗免疫功能低下相关疾病或（和）自身免疫性疾病药物中的用途。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
一、马甲子提取物的制备方法
1、全株乙醇提取物的制备
取马甲子全株1kg，加入8倍量的95%乙醇浸渍1天后，然后进行粉碎，再加入10倍量的95%乙醇浸渍2天提取，收集提取液，50℃减压回收乙醇至无醇味，干燥即得马甲子乙醇提取物。
2、茎叶乙醇、石油醚和乙酸乙酯提取物的制备
取马甲子茎叶1kg，加入10倍量的95%乙醇浸渍1天后，然后进行粉碎，再加入10倍量的95%乙醇回流提取，收集提取液，60℃减压回收乙醇至无醇味，干燥即得马甲子乙醇提取物。将马甲子乙醇提取物加水分散后，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，得到马甲子石油醚提取物和乙酸乙酯提取物。
3、全株石油醚和乙酸乙酯提取物的制备
取马甲子全株1kg，加入10倍量的甲醇浸渍1天后，然后进行粉碎，再加入8倍量的甲醇浸渍2天，收集提取液，40℃下减压回收甲醇，干燥即得马甲子甲醇提取物，将马甲子甲醇提取物加水分散后，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，得到马甲子石油醚提取物和乙酸乙酯提取物。
二、马甲子提取物的成分研究
样品供试液的配制：取全株乙醇提取物提取物样品1g，溶于25ml无水乙醇中，离心。取上清液2ml，无水乙醇稀释5倍，至终浓度为0.008g/ml。
1、三萜类成分的检识
1.1 L-B反应
将样品溶于乙酸酐中，加浓硫酸－乙酸酐（1：20）数滴，可产生黄→红→紫→蓝等颜色变化，最后褪色，表明含有三萜类化合物。
1.2 Kahlenberg反应
将样品的氯仿或醇溶液点于滤纸上，喷20%五氯化锑的氯仿溶液（或三氯化锑饱和的氯仿溶液），干燥后60－70℃加热，显蓝色，表明含有三萜类化合物。
1.3 R-H反应
将样品供试液滴在滤纸上，喷出25%三氯乙酸乙醇溶液，加热至100℃，显红色，逐渐变为紫色，表明含有三萜类化合物。
1.4 Salkowki反应
将样品溶于氯仿，加入浓硫酸后，在硫酸层呈现红色或蓝色，氯仿层有绿色荧光出现，表明含有三萜类化合物。
1.5 Tschugaeff反应
将样品溶于冰乙酸中，加乙酰氯数滴及氯化锌结晶数粒，稍加热，则呈现淡红色或紫红色，表明含有三萜类化合物。
2、黄酮类成分的检识
2.1盐酸－镁粉还原反应（还原反应显色）
取少量样品溶于1mL乙醇中，加入少许镁粉及浓盐酸，振荡片刻，观察反应颜色呈紫红色，表明含有黄酮类化合物。
2.2三氯化铝反应（金属离子的络合反应显色）
用玻璃棒蘸取样品供试液涂于滤纸上，吹干，喷1％的三氯化铝乙醇溶液，吹干，观察现象。置紫外灯下显鲜黄色，表明含有黄酮类化合物。
2.3三氯化铁反应（金属离子的络合反应显色）
用玻璃棒蘸取供试液涂于滤纸上，吹干，在紫外灯下观察荧光后，喷3％的三氯化铁乙醇溶液，吹干，出现暗蓝色荧光斑点，再经氨熏后转变为棕色荧光斑点，表明含有黄酮类化合物。
2.4碱性试剂显色
用玻璃棒蘸取供试液涂于滤纸上，干燥后，喷以氢氧化钠水溶液或暴露于氨蒸汽中，在日光灯下观察时，氨蒸汽能使样品色点转变为亮黄色，表明含有黄酮类化合物。
3、生物碱类成分的检识
3.1改良碘化铋钾（Dragendorff）法
①次硝酸铋0.85g溶于10ml冰醋酸与40ml水中；②碘化钾8g溶于20ml水中。试液①与试液②等量混合置棕色瓶内保存作贮备液。用前将1ml贮备液、4ml冰醋酸与12ml水混合。将样品供试液加入上述试剂中，呈红棕色溶液，加蒸馏水一摇即有沉淀产生，表明含有生物碱类化合物。
3.2碘-碘化钾（Wagner）法
碘1g与碘化钾10g溶于50ml水，加2ml乙酸，加水至100ml。取上述试剂适量，加入1 ml样品供试液即显棕褐色，表明含有生物碱类化合物。
3.3硅钨酸（Bertrand）法
5g硅钨酸溶于100ml水中，加浓盐酸少量调至pH＝2左右。取上述试剂适量，加入1 ml样品供试液即显棕褐色，表明含有生物碱类化合物。
4、香豆素类成分的检识
4.1异羟肟酸铁反应
①a.盐酸羟胺20g溶于50ml水，用乙醇稀释至200ml，冷处保存；b.氢氧化钾50g溶于少许水中，加500ml乙醇。②氯化铁（FeCl3·6H2O）10g溶于20ml 36％盐酸溶液中，加乙醚200ml摇匀，置密闭容器内保存。使用时将试液①a.与①b.按1：2混合，滤去沉淀，滤液放冰箱保存。用玻璃棒蘸取样品供试液涂于滤纸上，先喷ab混合试液，稍干，再喷试液②，即显红色，表明含有香豆素类化合物。
4.2重氮化试剂反应
①对硝基苯胺0.35g，溶于浓盐酸5ml中，加水至50ml；②亚硝酸钠5g，加水50ml。取①、②液等量在冰水浴中混合后使用。取少量样品供试液滴加重氮化试剂，即显橙红色，表明含有香豆素类化合物。
5、成分定量分析
取马甲子茎叶石油醚提取物0.1g，三份，加入10ml容量瓶内，加乙酸乙酯至刻度，再从中精密吸取4ml溶液加入10ml容量瓶内，挥干溶剂后，加入5%香草醛-冰醋酸0.4ml、高氯酸1.6 ml，混匀，并由乙酸乙酯稀释至刻度，置70℃恒温水浴中加热15min，冷却至室温，并转移至10ml容量瓶中加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，在540nm波长处测定吸收度，计算供试品溶液中总三萜含量（含三萜以美洲茶酸计）。经计算1g马甲子提取物中三萜类成分含23mg。
取马甲子茎叶石油醚提取物0.1g，三份，精密称定，置50ml量瓶中，加乙醇适量，超声溶解，放冷，加乙醇至刻度，摇匀。精密量取1ml，置10ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取3ml，置25ml量瓶中，在510nm波长处测定吸光度，计算供试品溶液中总黄酮含量（含黄酮量以芦丁计）。经计算1g马甲子提取物中总黄酮含103mg。
取马甲子茎叶石油醚提取物0.1g，三份，精密称定，置具塞锥形瓶中,以18 %氨水2 ml 润湿1 h，加乙醚2氯仿2乙醇(25∶8∶2.5)混合溶剂30 ml，超声提取20 min，倾出上清液至小锥形瓶中，再加入上述混合溶剂30 ml，冷浸放置半小时,再超声震荡提取20 min，滤过,以相同溶剂15 ml分3 次洗涤残渣和滤纸,合并滤液于锥形瓶中，于60 ℃水浴上蒸干，准确加入10 ml氯仿使其全部溶解,再准确吸取5 mL 转移至小分液漏斗中，加6 mL氯仿，2 ml缓冲液(pH=5.0，0.2 M邻苯二甲酸氢钾缓冲液)。用1 mmol·L-1溴麝香草酚蓝溶液滴定,并不断震摇;接近终点时，分出氯仿层，再加入新鲜氯仿5 ml，继续滴定并不断震摇,静置分层，至水层略显黄色即为终点。计算总生物碱(含生物碱以马甲子碱B计) 。经计算1g马甲子提取物中生物碱含21mg。
取马甲子茎叶石油醚提取物0.1g，三份，精密称定，置50ml量瓶中，加乙醇适量，超声溶解，放冷，加乙醇至刻度，摇匀。精密量取1ml，置10ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀。精密量取3ml，置25ml量瓶中，在340nm波长处测定测定吸光度，计算供试品溶液中总香豆素含量（含香豆素量以伞形花内酯计）。经计算1g马甲子提取物中总香豆素含10.2mg。
取马甲子茎叶乙酸乙酯提取物0.1g，三份，加入10ml容量瓶内，加乙酸乙酯至刻度，再从中精密吸取4ml溶液加入10ml容量瓶内，挥干溶剂后，加入5%香草醛-冰醋酸0.4ml、高氯酸1.6 ml，混匀，并由乙酸乙酯稀释至刻度，置70℃恒温水浴中加热15min，冷却至室温，并转移至10ml容量瓶中加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，在540nm波长处测定吸收度，计算供试品溶液中总三萜含量（含三萜以美洲茶酸计）。经计算1g马甲子提取物中三萜类成分含108mg。
取马甲子茎叶乙酸乙酯提取物0.1g，三份，精密称定，置50ml量瓶中，加乙醇适量，超声溶解，放冷，加乙醇至刻度，摇匀。精密量取1ml，置10ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取3ml，置25ml量瓶中，在510nm波长处测定吸光度，计算供试品溶液中总黄酮含量（含黄酮量以芦丁计）。经计算1g马甲子提取物中总黄酮含497mg。
取马甲子全株乙酸乙酯提取物0.1g，三份，精密称定，置具塞锥形瓶中,以18 %氨水2 ml 润湿1 h，加乙醚2氯仿2乙醇(25∶8∶2.5)混合溶剂30 ml，超声提取20 min，倾出上清液至小锥形瓶中，再加入上述混合溶剂30 ml，冷浸放置半小时,再超声震荡提取20 min，滤过,以相同溶剂15 ml分3 次洗涤残渣和滤纸,合并滤液于锥形瓶中，于60 ℃水浴上蒸干，准确加入10 ml氯仿使其全部溶解,再准确吸取5 mL 转移至小分液漏斗中，加6 mL氯仿，2 ml缓冲液(pH=5.0，0.2 M邻苯二甲酸氢钾缓冲液)。用1 mmol·L-1溴麝香草酚蓝溶液滴定,并不断震摇;接近终点时，分出氯仿层，再加入新鲜氯仿5 ml，继续滴定并不断震摇,静置分层，至水层略显黄色即为终点。计算总生物碱(含生物碱以马甲子碱B计) 。经计算1g马甲子提取物中生物碱含107mg。
取马甲子全株乙酸乙酯提取物0.1g，三份，精密称定，置50ml量瓶中，加乙醇适量，超声溶解，放冷，加乙醇至刻度，摇匀。精密量取1ml，置10ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀。精密量取3ml，置25ml量瓶中，在340nm波长处测定测定吸光度，计算供试品溶液中总香豆素含量（含香豆素量以伞形花内酯计）。经计算1g马甲子提取物中总香豆素含186mg。
三、马甲子制剂的制备
1、片剂的制备
取马甲子全株乙醇提取物300 g，加入适宜辅料，如：100 g微晶纤维素，57.5g乳糖，20 g交联羧甲基纤维素钠等，压片制成片剂。
2、胶囊剂的制备
取马甲子茎叶乙酸乙酯提取物，加入适宜辅料，如：乳糖、可压性淀粉、羧甲基淀粉、微晶纤维素、等制成胶囊剂。
3、颗粒剂的制备
取马甲子全株甲醇提取物，加入适宜辅料，如：乳糖、淀粉、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、微粉硅胶等制成颗粒剂。
4、软膏剂的制备
取马甲子茎叶石油醚提取物，加入适宜辅料，如：十八醇、单硬脂酸甘油脂、甘油、硬脂酸等制成软膏剂。
5、栓剂的制备
取马甲子全株乙醇提物物，加入适宜辅料，如：混合脂肪酸甘油酯、PEG、蜂蜡等制成栓剂。
四、体外细胞学研究
1. 马甲子提取物对小鼠脾淋巴细胞体外增殖的影响
1.1. 小鼠脾淋巴细胞的制备
无菌取昆明小鼠脾脏，置于盛有适量RPMI1640培养基的平皿中，除去结缔组织，用注射器针芯研磨，经200目筛网过滤，转移至离心管中，用RPMI1640洗涤后，收集细胞，加入1ml红细胞裂解液。4°C下放置5-10min后，1500r/min离心5 min，弃取上清，用RPMI1640培养基洗涤2次，最后将细胞悬浮于1ml RPMI1640完全培养基中。经台盼蓝染色测定存活率，结果显示脾细胞存活率大于95%。将上述脾细胞悬液适当稀释，调整细胞密度为2×106个/ml备用。
马甲子提取物对小鼠脾淋巴细胞体外增殖的影响
将2×106个/ml的脾细胞悬液，按照每孔100μl加入96孔板中。设置空白组、对照组以及马甲子提取物组。对照组每孔再加入100μl的RPMI1640完全培养基；马甲子提取物组中，每孔再加入100μl含有不同浓度马甲子提取物的RPMI1640完全培养基溶液；另设空白组，只含有培养基。将上述96孔板置于5%CO2、37℃孵箱中培养60h。取出细胞板，将孔内液体吸出，用PBS洗涤3次后，加入100 μl培养基和20 μlMTT液（5 mg·ml－1），再次置于37℃、体积分数为5％CO2的湿度环境下培养4h后，取出细胞培养板，小心吸出上清液，加入150 μl二甲基亚砜，将培养板置于微孔板振荡器上振摇10min，使结晶物甲瓒充分溶解后，于酶联免疫检测仪上490nm比色，记录结果，按照公式（1）计算马甲子提取物对小鼠脾细胞体外平均存活率。
平均存活率(%)= 
×100%...................（1）
结果显示，马甲子提取物浓度为0.004 mg/ml、0.02 mg/ml、0.2 mg/ml时，小鼠脾细胞的平均存活率为117.85%、107.21%以及77.46%。结果表明低浓度马甲子提取物能促进小鼠脾细胞体外增殖，而高浓度马甲子提取物则对脾细胞的增殖具有抑制作用。
马甲子提取物对ConA诱导的脾细胞体外增殖的影响
将2×106个/ml的脾细胞悬液，按照每孔100μl加入96孔板中。设置空白组、对照组、ConA组以及马甲子提取物组。对照组每孔再加入100μl的RPMI1640完全培养基；ConA组每孔再加入100μl含有25μg/ml ConA的RPMI1640完全培养基溶液；马甲子提取物组中，每孔再加入100μl含有不同浓度马甲子提取物的RPMI1640完全培养基溶液（溶液中同时含有25μg/ml ConA）；另设空白组，只含有培养基。将上述96孔板置于5%CO2、37℃孵箱中培养60h。取出细胞板，将孔内液体吸出，用PBS洗涤3次后，加入100 μl培养基和20 μlMTT液（5 mg·ml－1），再次置于37℃、体积分数为5％CO2的湿度环境下培养4h后，取出细胞培养板，小心吸出上清液，加入150 μl二甲基亚砜，将培养板置于微孔板振荡器上振摇10min，使结晶物甲瓒充分溶解后，于酶联免疫检测仪上490nm比色，记录结果，按照公式（1）计算ConA组和马甲子提取物组对小鼠脾细胞体外平均存活率；再按照公式（2）计算马甲子提取物对ConA诱导的小鼠脾细胞体外增殖的增殖率。
相对增值率（%）=
×100%........................（2）
结果显示，马甲子提取物浓度为0.004 mg/ml、0.02 mg/ml、0.2 mg/ml时，相对于ConA组的相对增值率分别为15.11%、5.69%和-14.35%，说明马甲子提取物低浓度时对ConA诱导的小鼠脾细胞体外增殖有促进作用，而高浓度时则表现出抑制作用。
3. 马甲子提取物对LPS诱导的脾细胞体外增殖的影响
将2×106个/ml的脾细胞悬液，按照每孔100μl加入96孔板中。设置空白组、对照组、LPS组以及马甲子提取物组。对照组每孔再加入100μl的RPMI1640完全培养基；LPS组每孔再加入100μl含有20μg/ml LPS的RPMI1640完全培养基溶液；马甲子提取物组中，每孔再加入100μl含有不同浓度马甲子提取物的RPMI1640完全培养基溶液（溶液中同时含有20μg/ml LPS）；另设空白组，只含有培养基。将上述96孔板置于5%CO2、37℃孵箱中培养60h。取出细胞板，将孔内液体吸出，用PBS洗涤3次后，加入100 μl培养基和20 μlMTT液（5 mg·ml－1），再次置于37℃、体积分数为5％CO2的湿度环境下培养4h后，取出细胞培养板，小心吸出上清液，加入150 μl二甲基亚砜，将培养板置于微孔板振荡器上振摇10min，使结晶物甲瓒充分溶解后，于酶联免疫检测仪上490nm比色，记录结果，按照公式（1）计算LPS组和马甲子提取物组对小鼠脾细胞体外平均存活率；再按照公式（2）计算马甲子提取物对LPS诱导的小鼠脾细胞体外增殖的增殖率。
结果显示，马甲子提取物浓度为0.004 mg/ml、0.02 mg/ml、0.2 mg/ml时，相对于LPS组的相对增值率分别为34.37%、20.48%和-15.60%，说明马甲子提取物低浓度时对LPS诱导的小鼠脾细胞体外增殖有促进作用，而高浓度时则表现出抑制作用，这与上述马甲子提取物对ConA诱导的脾细胞体外增殖具双向免疫调节的结论是一致的。
五、药理学验证
1、乙醇、甲醇、石油醚提取物及乙酸乙酯提取物对免疫低下小鼠非特异性免疫功能的影响（腹腔巨噬细胞吞噬法）
KM小鼠80只，按体重分层随机均分为8组，分别为混悬剂对照组（0.5%西黄芪胶）、模型对照组（0.5%西黄芪胶）、阳性对照组（云芝多糖）、乙酸乙酯提取物小剂量组、乙酸乙酯提取物大剂量组、乙醇提取物组、甲醇提取物组、石油醚提取物组。灌胃给予试验药物或混悬剂，每日1次，连续14d。除混悬剂对照组外，给药第8、10、12d按25mg/kg腹腔注射给予环磷酰胺生理盐水溶液，造成免疫低下。第13d、14d分别腹腔注射6%淀粉溶液；至第14d末次给药后1h，腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水悬液1ml，30min后，颈椎脱臼处死动物，经腹腔注入生理盐水2ml，并轻揉腹部。1min后剪开腹部，吸取腹腔洗液1ml，平均分滴于2片载玻片上，放入湿盒内，37℃温育30min。后于生理盐水中漂洗，晾干，并以1:1丙酮-甲醇溶液固定，4%（v/v）Giemsa-PBS染色3min，蒸馏水漂洗晾干，镜检，计算吞噬百分率。
表1 马甲子乙醇、甲醇、石油醚提取物及乙酸乙酯提取物对免疫低下小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响（n=10,
±s）
| 组别 | 剂量 | 吞噬百分率 |
| 混悬剂对照 | —— | 0.40±0.09** |
| 模型对照 | —— | 0.17±0.07 |
| 阳性对照（云芝多糖） | 0.4g/kg | 0.36±0.11** |
| 乙酸乙酯提取物小剂量 | 0.1g/kg | 0.26±0.08** |
| 乙酸乙酯提取物大剂量 | 0.4g/kg | 0.32±0.10** |
| 甲醇提取物 | 1.2g/kg | 0.32±0.11** |
| 石油醚提取物 | 1.2g/kg | 0.31±0.07** |
| 乙醇提取物 | 1.2g/kg | 0.36±0.11** |
与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
结果如表1所示。马甲子乙酸乙酯提取物在0.1g/kg及以上剂量灌胃给予14日，可显著提高免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力，且0.4g/kg剂量组作用强度与云芝多糖组无显著性差异；乙醇、甲醇、石油醚提取物1.2g/kg也可有效增强免疫低下小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力，提示该四类提取物对免疫低下动物均具有较好的免疫增强作用。
2、乙醇、甲醇、石油醚提取物及乙酸乙酯提取物对免疫低下小鼠特异性免疫功能的影响（2，4-二硝氟苯所致耳肿胀法）
KM小鼠80只，按体重分层随机均分为8组，分别为混悬剂对照组（0.5%西黄芪胶）、模型对照组（0.5%西黄芪胶）、阳性对照组（云芝多糖）、乙酸乙酯提取物小剂量组、乙酸乙酯提取物大剂量组、乙醇提取物组、甲醇提取物组、石油醚提取物组。灌胃给予试验药物或混悬剂，每日1次，连续14d。除混悬剂对照组外，给药第8、10、12d按25mg/kg腹腔注射给予环磷酰胺生理盐水溶液，造成免疫低下。给药第9d以1%2，4-二硝氟苯（DNFB）溶液（取100mgDNFB加入到1：1的丙酮-植物油混合物中混匀，定容至10ml）25μl涂抹小鼠腹部。至第13d给药后1h，取10μl1%DNFB溶液涂抹于小鼠左耳；涂抹后24h，即末次给药后1h，颈椎脱臼处死动物，耳片称重，计算耳肿胀度。
表2 马甲子乙醇、甲醇、石油醚提取物及乙酸乙酯提取物对免疫低下小鼠DNFB所致耳肿胀的影响（n=10,
±s）
| 组别 | 剂量 | 耳肿胀度（mg） |
| 混悬剂对照 | —— | 11.05±1.72** |
| 模型对照 | —— | 6.06±0.63 |
| 阳性对照（云芝多糖） | 0.4g/kg | 7.11±1.73** |
| 乙酸乙酯提取物小剂量 | 0.1g/kg | 7.20±1.32* |
| 乙酸乙酯提取物大剂量 | 0.4g/kg | 8.04±1.55** |
| 甲醇提取物 | 1.2g/kg | 8.31±1.45** |
| 石油醚提取物 | 1.2g/kg | 7.31±1.56* |
| 乙醇提取物 | 1.2g/kg | 7.09±1.06* |
与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
结果如表2所示。马甲子乙酸乙酯提取物可提高免疫低下小鼠的DNFB所致耳肿胀程度，提示其对免疫低下动物的细胞免疫功能具有增强作用；乙醇、甲醇、石油醚提取物1.2g/kg与乙酸乙酯提取物作用类似，提示该四类提取物均具有较好的增强免疫低下动物特异性免疫的作用。
3、乙醇、甲醇、石油醚提取物及乙酸乙酯提取物对正常小鼠非特异性免疫功能的影响（腹腔巨噬细胞吞噬法）
KM小鼠80只，按体重分层随机均分为8组，分别为混悬剂对照组（0.5%西黄芪胶）、增强作用阳性对照组（云芝多糖）、抑制作用阳性对照组（环磷酰胺）、乙酸乙酯提取物小剂量组、乙酸乙酯提取物大剂量组、乙醇提取物组、甲醇提取物组、石油醚提取物组。除抑制作用阳性对照组于第13d一次性皮下注射给予外，其余各组灌胃给予试验药物或混悬剂，每日1次，连续14d。第13d、14d分别腹腔注射6%淀粉溶液；至第14d末次给药后1h，腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水悬液1ml，30min后，颈椎脱臼处死动物，经腹腔注入生理盐水2ml，并轻揉腹部。1min后剪开腹部，吸取腹腔洗液1ml，平均分滴于2片载玻片上，放入湿盒内，37℃温育30min。后于生理盐水中漂洗，晾干，并以1:1丙酮-甲醇溶液固定，4%（v/v）Giemsa-PBS染色3min，蒸馏水漂洗晾干，镜检，计算吞噬百分率。
表3 马甲子乙醇、甲醇、石油醚提取物及乙酸乙酯提取物对正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响（n=10,
±s）
| 组别 | 剂量 | 吞噬率 |
| 空白对照 | —— | 0.49±0.11 |
| 增强作用阳性对照（云芝多糖） | 0.4g/kg | 0.47±0.19 |
| 抑制作用阳性对照（环磷酰胺） | 0.1g/kg | 0.12±0.03** |
| 乙酸乙酯提取物小剂量 | 0.1g/kg | 0.41±0.13 |
| 乙酸乙酯提取物大剂量 | 0.4g/kg | 0.37±0.08* |
| 甲醇提取物 | 1.2g/kg | 0.33±0.07** |
| 石油醚提取物 | 1.2g/kg | 0.36±0.12* |
| 乙醇提取物 | 1.2g/kg | 0.36±0.10** |
与混悬剂对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
结果如表3所示。马甲子乙酸乙酯提取物0.4g/kg剂量灌胃给予14日，可在一定程度抑制正常小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力，而0.1g/kg则未观察到明显作用；乙醇、甲醇、石油醚提取物1.2g/kg也表现不同程度的抑制效应，提示该四类提取物对正常动物有轻度的免疫抑制作用。
4、乙醇、甲醇、石油醚提取物及乙酸乙酯提取物对正常小鼠特异性免疫功能的影响（2，4-二硝氟苯所致耳肿胀法）
KM小鼠80只，按体重分层随机均分为8组，分别为混悬剂对照组（0.5%西黄芪胶）、增强作用阳性对照组（云芝多糖）、抑制作用阳性对照组（环磷酰胺）、乙酸乙酯提取物小剂量组、乙酸乙酯提取物大剂量组、乙醇提取物组、甲醇提取物组、石油醚提取物组。除抑制作用阳性对照组于第13d一次性皮下注射给予外，其余各组灌胃给予试验药物或混悬剂，每日1次，连续14d。给药第9d以1%2，4-二硝氟苯（DNFB）溶液（取100mgDNFB加入到1：1的丙酮-植物油混合物中混匀，定容至10ml）25μl涂抹小鼠腹部。至第13d给药后1h，取10μl1%DNFB溶液涂抹于小鼠左耳；涂抹后24h，即末次给药后1h，颈椎脱臼处死动物，耳片称重，计算耳肿胀度。
表4 马甲子乙醇、甲醇、石油醚提取物及乙酸乙酯提取物对正常小鼠DNFB所致耳肿胀的影响（n=10,
±s）
| 组别 | 剂量 | 耳肿胀度（mg） |
| 混悬剂对照 | —— | 10.78±1.19 |
| 增强作用阳性对照（云芝多糖） | 0.4g/kg | 10.59±1.33 |
| 抑制作用阳性对照（环磷酰胺） | 0.1g/kg | 5.66±0.72** |
| 乙酸乙酯提取物小剂量 | 0.1g/kg | 9.54±1.21* |
| 乙酸乙酯提取物大剂量 | 0.4g/kg | 7.28±0.98** |
| 甲醇提取物 | 1.2g/kg | 7.15±1.17** |
| 石油醚提取物 | 1.2g/kg | 9.12±1.34** |
| 乙醇提取物 | 1.2g/kg | 8.52±1.63** |
与混悬剂对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
结果如表4所示。马甲子乙酸乙酯提取物0.1g/kg即可抑制正常小鼠DNFB所致耳肿胀程度，提示其对正常动物具有一定的细胞免疫功能抑制作用；乙醇、甲醇、石油醚提取物1.2g/kg与乙酸乙酯提取物作用类似，提示该四类提取物均具有一定的特异性免疫抑制作用。
5、乙醇、甲醇、石油醚提取物及乙酸乙酯提取物对小鼠实验性红斑狼疮的治疗作用及对细胞免疫的影响
KM小鼠80只，按体重分层随机均分为8组，分别为混悬剂对照组（0.5%西黄芪胶）、模型对照组（0.5%西黄芪胶）、阳性对照组（雷公藤多苷）、乙酸乙酯提取物小剂量组、乙酸乙酯提取物大剂量组、乙醇提取物组、甲醇提取物组、石油醚提取物组。除混悬剂对照组外均按0.5ml/只腹腔注射降植烷（pristane），灌胃给予药物或混悬剂，每日1次，连续30d。末次药后24h眼眶采血，4℃冷冻离心分离血清，ELISA测定血清中抗dsDNA抗体水平。
另取一批动物同样分组及复制模型，注射pristane后第24日，除混悬剂对照组外，各组动物腹腔注射5%鸡红细胞生理盐水悬液0.2ml/只，并继续给药持续至注射pristane后第30日。末次给药后24h于眼眶取血20μl，加入1ml生理盐水中，随后分别加入4％鸡红细胞生理盐水悬液0.5ml和10％豚鼠血清0.5ml,混匀后于37℃孵育0.5h，3000rpm离心10min，取上清液1ml，加入3ml都氏液，540nm比色。
表5 马甲子乙醇、甲醇、石油醚提取物及乙酸乙酯提取物对实验性红斑狼疮小鼠的影响（n=10,
±s）
| 组别 | 剂量 | 血清dsDNA含量（OD） | 溶血素水平（OD×10-1） | |
| 混悬剂对照 | —— | 0.26±0.028** | 1.70±0.19** | |
| 模型对照 | 0.4g/kg | 2.56±0.381 | 2.52±0.29 | |
| 阳性对照（雷公藤多苷） | 0.03g/kg | 1.63±0.101** | 0.82±0.17** | |
| 乙酸乙酯提取物小剂量 | 0.1g/kg | 2.23±0.285 | 2.09±0.31* | |
| 乙酸乙酯提取物大剂量 | 0.4g/kg | 2.08±0.452* | 1.82±0.26** | |
| 甲醇提取物 | 1.2g/kg | 2.25±0.309 | 2.00±0.24** | |
| 石油醚提取物 | 1.2g/kg | 2.10±0.347* | 2.12±0.25* | |
| 乙醇提取物 | 1.2g/kg | 2.11±0.251* | 2.04±0.30** |
与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
结果如表4所示。马甲子乙酸乙酯提取物0.4g/kg可有效降低实验性红斑狼疮小鼠血清中dsDNA抗体水平，提示其可用于红斑狼疮治疗；乙醇、甲醇、石油醚提取物1.2g/kg与乙酸乙酯提取物作用类似，提示该四类提取物均具有一定的对红斑狼疮的作用。红斑狼疮可表现为体液免疫异常升高，本实验显示模型动物溶血素水平显著高于正常动物，马甲子乙酸乙酯提取物0.1g/kg即可有效降低此异常升高的溶血素水平，乙醇、甲醇、石油醚提取物1.2g/kg与乙酸乙酯提取物作用类似，提示该四类提取物均对异常免疫功能亢进有显著抑制作用。
Claims (7)
1.一种具有双向免疫调节作用的马甲子提取物，其特征在于，所述提取物作为制备治疗免疫功能异常疾病药物的应用。
2.根据权利要求1所述的马甲子提取物，其特征是，将马甲子叶、马甲子根、马甲子茎叶或马甲子全株植物的鲜品、冷冻干燥品直接用有机溶媒提取纯化，或将马甲子鲜品用有机溶媒预处理后再提取纯化；有机溶媒包括甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、石油醚；所述提取方法包括浸渍、回流或渗漉；所述干燥方法包括减压干燥、冷冻干燥、喷雾干燥或微波干燥。
3.根据权利要求1所述的马甲子提取物，其特征是，成分包括萜类、黄酮类、生物碱类、香豆素类、多糖类和纤维素类以及萜、黄酮、生物碱、香豆素的苷类和单体。
4.根据权利要求1所述的马甲子提取物的制剂，其特征是，包括片剂、胶囊剂、贴膏剂、颗粒剂、注射剂、栓剂、软膏剂、凝胶剂、涂膜剂、搽剂、洗剂和喷雾剂。
5.根据权利要求1所述的马甲子提取物的应用，其特征是，在制备免疫功能低下或（和）自身免疫性疾病药物的应用，包括单独使用马甲子提取物或以马甲子提取物为主要活性成分的药物组合物在制备治疗免疫功能低下或（和）自身免疫性疾病药物中的用途。
6.根据权利要求5所述免疫功能异常的免疫功能低下，包括感冒易感、体虚、肿瘤、艾滋病等。
7.根据权利要求5所述免疫功能异常的自身免疫性疾病，包括类风湿性关节炎、红斑狼疮、硬皮病、甲状腺机能亢进、青少年糖尿病、原发性血小板紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、慢性肝病等。
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