CN101455736A - 一种酸枣仁提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种酸枣仁提取物，其通过如下方法制得：取酸枣仁粉碎过筛，脱脂，乙醇浸泡提取，除去酒精后，加水搅拌均匀，再用水饱和正丁醇萃取，最后浓缩、风干。本发明的酸枣仁提取物可通过常规的方法制备成口服液、颗粒剂、注射液或冻干粉针剂。该酸枣仁提取物可应用于制备预防家禽支原体、大肠杆菌、鸡法氏囊病、禽流感H9亚型病毒病药物组合物中，弥补我国目前疫苗预防效果不良造成的损失，替代抗菌素防治畜禽耐药细菌病，以控制传染病的流行和解决食品中抗菌素残留问题，从而保证食品安全，提高动物产品出口的竞争力。

Description

一种酸枣仁提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种具有预防家禽支原体、大肠杆菌、鸡法氏囊病、禽淋巴白血病新亚型病毒病的酸枣仁提取物及其制备方法和应用。

背景技术

进入21世纪以来，畜禽重大疫病在全球不断爆发，不仅严重地阻碍了畜牧业的健康发展，也引起了一系列的公共卫生突发事件，我国也未能幸免，先后发生禽流感、猪链球菌病、口蹄疫等重大疫情，给人民健康、社会安定造成了极大的危害。因此，研究和创制生物兽药新产品，已成为保障我国畜牧业发展、维护人民健康和生命安全、保持社会稳定和促进经济发展的国家重大需求。

酸枣仁为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill.var.spionA(Bunge)HuexH.F.Chou的干燥成熟种仁，主要分布于西北、东北、华北许多省区及南方的一些地区。化学研究表明，酸枣仁含有黄酮苷、三萜皂苷及有机酸等多种成分，其中三萜皂苷为主要的有效成分之一。现代药理实验证实，酸枣仁皂苷具有明显的免疫调节和抗组胺释放的活性。酸枣仁目前主要应用于镇静和催眠作用以及抗惊厥作用，同时用于血管保护及免疫增强。

国内已有关于用含有酸枣仁的中药组方治疗病毒性心肌炎、病毒性乙型肝炎的文献报道和专利，国外有关于枣树皮、叶片提取物或酸枣果实可抗真菌和病毒的文献报道，其中所述的酸枣仁提取物多是通过水或醇提取而得到的，其有效成分中主要含有酸枣仁皂苷，其黄酮类物质的比例小，均未见有在70～75％乙醇基础上通过正丁醇萃取所得的提取物作为药物抗禽淋巴白血病、传染性法氏囊病毒药物或作为抗家禽大肠杆菌、鸡支原体的文献报道或专利。

2005年农业部下发文件规定禁止把人类使用的抗病毒药物(病毒灵、金刚烷胺、金刚乙胺、阿昔洛伟)应用到畜禽药物中，防治抗病毒药物耐药性从畜禽向人类传递。但是，我国某些传染病仍缺乏有效的疫苗来控制，如呼吸繁殖综合症、猪心肌炎、猪无名高热等，开发有效药物来预防这些疾病的途径是迫在眉睫。此外，畜禽生产中支原体、大肠杆菌等广泛流行，控制这些细菌病主要依赖于抗菌素的治疗。而由于抗菌素的滥用，导致这些病菌耐药性的出现，使治疗和预防细菌传染病的难度加大。同时药物的残留也威胁到人类食品安全和身体健康。

开发天然中草药预防畜禽疾病是国家中药创新体系的主要组成部分，符合高效、毒性小、副作用少的国家产业结构调整方向，顺应绿色、环保的基本生产要求，产品的推广和应用可以解决抗生素药物残留、部分替代抗菌素，控制畜禽重大疫病流行和发生，提高我国畜禽产品出口的竞争力。

发明内容

本发明的目的是提供一种酸枣仁提取物。

本发明的又一目的是提供上述酸枣仁提取物的制备方法。

本发明的第三个目的是提供上述酸枣仁提取物在制备新的能够有效预防和治疗畜禽细菌病、支原体病、大肠杆菌病、禽淋巴白血病、鸡法氏囊病毒病药物组合物中的应用。

本发明的酸枣仁提取物，其通过如下方法制得：取酸枣仁粉碎过筛，脱脂，70～75％乙醇浸泡提取，除去酒精后，加水搅拌均匀，再用水饱和正丁醇萃取，最后浓缩、风干制得。

所述脱脂的方法是按体积重量比加入酸枣仁2～8倍量的石油醚，浸泡脱脂5～8次，脱脂完全后挥干石油醚；所述浸泡提取过程是按照体积重量比加入4～8倍量的70～75％的酒精浸泡提取2～7次，每次1～4小时，提取完成后除去酒精；所述萃取过程是按照体积重量比加入3～6倍量水搅拌混合，然后加入2～6倍量的水饱和正丁醇连续萃取4～6次。

上述酸枣仁提取物含有酸枣仁皂苷A：5.45～18.24mg/g、酸枣仁皂苷B：0.86～1.52mg/g、黄酮类物质：0.471～0.573mg/g。

本发明提供的酸枣仁提取物的制备方法，取酸枣仁粉碎过筛，脱脂，70～75％乙醇浸泡提取，除去酒精后，加水搅拌均匀，再用水饱和正丁醇萃取，最后浓缩、风干。

所述脱脂的方法是按体积重量比加入酸枣仁2～8倍量的石油醚，浸泡脱脂1～8次，脱脂完全后挥干石油醚；所述浸泡提取过程是按照体积重量比加入4～8倍量的70～75％的酒精浸泡提取2～7次，每次1～4小时，提取完成后除去酒精；所述萃取过程是按照体积重量比加入3～6倍量水搅拌混合，然后加入2～6倍量的水饱和正丁醇连续萃取2～6次。

本发明的酸枣仁提取物可应用于制备预防家禽支原体、大肠杆菌、鸡法氏囊病、禽淋巴白血病新亚型病毒病药物组合物中。所述的组合物为将酸枣仁提取物与常规的辅料或载体，按照常规的制剂方法制备成的片剂、颗粒剂、口服液、注射剂或冻干粉针剂。其中优选口服液和注射剂。可按照每天100～600mg/kg体重的方式对家禽施药，连续4-5天口服或拌料给予。

酸枣仁提取物可以广泛用于养殖业，替代部分抗病毒药物，弥补我国目前疫苗预防效果不良造成的损失，替代抗菌素防治畜禽耐药细菌病，以控制传染病的流行和解决食品中抗菌素残留问题，从而保证食品安全，提高动物产品出口的竞争力。

本发明使用75％乙醇提取获得的主要成分是酸枣仁皂苷A、B和黄酮类物质，黄酮类物质的含量高达0.573mg/g，酸枣仁皂苷A、B的含量达18.24mg/g和1.52mg/g，酸枣仁皂苷具有明显的免疫调节和抗组胺释放的活性。酸枣仁目前主要应用于镇静和催眠作用以及抗惊厥作用，同时用于血管保护及免疫增强作用。黄酮类物质具有降血压、抗凝血、降血糖、抗炎、抗菌、抗病毒和抗肿瘤等生理功能。通过酸枣仁皂苷的免疫增强作用，提高机体的非特异性免疫，从而提高机体抗病能力；同时通过黄酮物质增强机体的抗炎能力，增强机体对炎症的主动修复能力。故可以通过这两种物质同时增强机体的非特异性免疫来增强机体抗病能力。

本发明研究人员，通过了大量的实验室和临床验证，酸枣仁提取物的有效成分酸枣仁皂苷A、B，具有广谱抗细菌活性，有效防治畜禽支原体病、禽大肠杆菌病、禽流感H9亚型，可代替抗菌素和金刚烷胺防治家禽顽固性呼吸道疾病和病毒性疾病，从而有效提高家禽的成活率。

本发明研究人员还分别通过体外、体内试验，评价酸枣仁提取物的抗细菌功效。发现酸枣仁提取物可有效抑制、预防和治疗鸡毒支原体病、鸡大肠杆菌病、以及大肠杆菌与支原体混合感染。同时，发现酸枣仁口服液具有防治鸡法氏囊病、禽淋巴白血病新亚型。

本发明的酸枣仁提取物，主要具有以下几方面的优点：

1、产物的收率有明显提高；

2、产物的毒性对家禽较低；

3、对于禽流感、法氏囊病毒、鸡毒支原体和大肠杆菌感染具有很好的治疗或预防效果。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。

实施例1酸枣仁提取物的制备

将酸枣仁100g粉碎后过10目筛，筛过物加入6倍量(ml/g)石油醚浸泡脱脂6h，脱脂6次，脱脂完全后挥干石油醚。然后把药渣加入6倍量(ml/g)的75％的酒精浸泡提取，每次浸泡4h，连续提取4次，把所得提取物除去酒精后加入3倍量(ml/g)水搅拌混匀，然后在其中加入4倍量(ml/g)的水饱和正丁醇连续萃取4次，并浓缩，制得5g的酸枣仁胶膏，其提取率为5％。

酸枣仁提取物中酸枣仁皂苷A、B的定性与定量

定性实验：

取上述酸枣仁胶膏2g，加入25ml的水饱和正丁醇溶液，加热溶解，再加入25ml的正丁醇饱和氨水试液(浓氨水:水＝2:3，然后加入正丁醇饱和)，连续洗涤三次，每次取上层液。合并提取的上层液，然后在上层液中连续两次加入10ml正丁醇饱和氨水试液，每次取上层液，然后用旋转蒸发仪蒸干，用2ml甲醇溶解，作为供试品溶液。

以甲醇为溶剂，分别配制成浓度1mg/ml的酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的溶液，作为对照品溶液1和对照品溶液2。

照薄层色谱法(《中国药典》2005版一部)试验，吸取供试品溶液和空白对照液(甲醇)各10μL，对照品溶液1、2各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以水饱和的正丁醇溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷上1％的香草醛硫酸溶液，立即检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点，从而证明了酸枣仁口服液中的有效成分为酸枣仁皂苷A、B。

定量实验：

取甲醇，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取滤液10μl用HPLC进样分析，作为空白对照。

精密称取酸枣仁皂苷A标准品4.20mg置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容，精密量取0.5ml、1.5ml、2ml、2.5ml、3ml置10ml容量瓶中，甲醇定容，制得浓度分别为0.021mg/ml、0.063mg/ml、0.084mg/ml、0.105mg/ml、0.126mg/ml的溶液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取滤液10μl用HPLC进样分析，测得峰面积分别为30439、148208、203901、256385、330719，以峰面积为横坐标X、浓度为纵坐标Y，制得酸枣仁皂苷A的标准曲线为Y＝0.000355451X+10.8672，R²＝0.997538。

取酸枣仁皂苷B标准品10.20mg置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容，然后精密取0.5ml、1ml、1.5ml、2ml、2.5ml置5ml容量瓶中，甲醇定容，制得浓度分别为0.102mg/ml、0.204mg/ml、0.306mg/ml、0.408mg/ml、0.51mg/ml的溶液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取滤液10μl用HPLC进样分析，测得峰面积分别为473741、1148673、1504992、1930542、2422009，以峰面积为横坐标X、浓度为纵坐标Y，制得酸枣仁皂苷B的标准曲线为Y＝2.160201e^-007X-6.127302e^-007，R²＝0.9931019。

取上述薄层色谱实验中的供试品溶液2.5ml置于10ml的容量瓶中，用甲醇定容，充分混匀后，用0.45μm的微孔滤膜滤过，所得滤液作为供试品溶液，取10μl用HPLC进样分析，测得供试品溶液中酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的峰面积分别为3187305和1801148，通过上述酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的标准曲线，求得供试品溶液中的酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的浓度分别为11.44mg/g和1.31mg/g。

在酸枣仁皂苷A、B的定量实验中，利用Beckman Coulter高效液相色谱仪，Beckman Coulter UV-2紫外检测器，32Karat操作软件进行分析，色谱条件：

色谱柱：Platisil ODS柱(迪马公司，4.6mm×250mm 5μm)

流动相：甲醇:水＝67:33

流速：0.6ml/min

检测波长：204nm

柱温：15℃

按酸枣仁皂苷A峰计算理论塔板应不低于2000。

酸枣仁提取物中黄酮类物质的定性与定量

定性实验：

以甲醇为溶剂，称取Spinosin(斯皮诺素)对照品1.01g置于10ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制得对照品溶液。

以甲醇为溶剂，称取酸枣仁提取物2.0g置于25ml容量瓶中，加入甲醇溶解并定容，用滤纸过滤，用0.45μm滤膜过滤，然后取滤液2.5ml置于10ml容量瓶中，用甲醇稀释到刻度，摇匀，制得供试品溶液。

以甲醇为空白对照液。

吸取供试品溶液和空白对照液各10μL，对照品溶液5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯(5:3)为展开剂展开，取出，晾干，氨熏，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药品色谱相应位置上，显示一个相同颜色的荧光斑点。

定量实验：

标准曲线的制备：精密称取105℃干燥恒重的芦丁标准品5mg，加70％乙醇溶解定容至25ml容量瓶中，摇匀，作为标准品溶液。精密吸取标准品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL置于25mL容量瓶中，分别加入70％乙醇至6.0ml，加入1.0mL5％亚硝酸钠，摇匀，放置6min；加入1.0mL 10％硝酸铝，摇匀，放置6min；加入10.0mL10％NaOH溶液，加70％乙醇稀释至25mL，混匀，静置15min，以70％的乙醇溶液作为空白参比，在272±1nm波长处比色测定，测定吸光度分别为0.014、0.1、0.19、0.282、0.543，以芦丁浓度为纵坐标Y，吸光度为横坐标X，绘制标准曲线，得到回归方程：Y＝0.0862X+0.3102，R²＝0.9979。

精密称取上述酸枣仁提取物胶膏0.2g，用70％乙醇溶解定容至25ml容量瓶中，滤过后，精密量取滤液1.0ml，置25ml容量瓶中，按“标准曲线的制备”操作，测得供试品溶液芦丁的吸光度为0.61，通过上述芦丁的标准曲线，求得黄酮类物质的含量为：0.512mg/g。

实施例2 酸枣仁提取物的制备

将酸枣仁100g粉碎后过10目筛，筛过物加入2倍量(ml/g)石油醚浸泡脱脂3h，脱脂8次，脱脂完全后挥干石油醚。然后把药渣加入4倍量(ml/g)的73％的酒精浸泡提取，每次浸泡1h，连续提取7次，把所得提取物除去酒精后加入3倍量(ml/g)水搅拌混匀，然后在其中加入2倍量(ml/g)的水饱和正丁醇连续萃取2次，并浓缩，制得4.1g的酸枣仁胶膏，其提取率为4.1％。

酸枣仁提取物中酸枣仁皂苷A、B的定性与定量

定性实验：

定性实验的测定方法同实施例1，在所得的供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点，从而证明了酸枣仁口服液中的有效成分为酸枣仁皂苷A、B。

定量实验：

定量实验的测定方法同实施例1，测得供试品溶液中酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的峰面积分别为995919和2039112，通过酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的标准曲线Y＝0.000355451X+10.8672，R²＝0.997538和Y＝2.160201e^-007X-6.127302e^-007，R²＝0.9931019，求得供试品溶液中的酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的浓度分别为18.24mg/g和1.52mg/g。

在酸枣仁皂苷A、B的定量实验中的实验仪器及色谱条件同实施例1。

酸枣仁提取物中黄酮类物质的定性与定量

定性实验：

定性实验的测定方法同实施例1，在所得的供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点，从而证明了酸枣仁口服液中的有效成分含有spinosin。

定量实验：

定量实验的测定方法同实施例1，测得供试品溶液的吸光度为0.501，根据芦丁的标准曲线Y＝0.0862X+0.3102，R²＝0.9979，得到黄酮类物质的含量为0.471mg/g。

实施例3 酸枣仁提取物的制备

将酸枣仁150g粉碎后过10目筛，筛过物加入8倍量(ml/g)石油醚浸泡脱脂7h，脱脂5次，脱脂完全后挥干石油醚。然后把药渣加入8倍量(ml/g)的71％的酒精浸泡提取，每次浸泡2h，连续提取2次，把所得提取物除去酒精后加入5倍量(ml/g)水搅拌混匀，然后在其中加入6倍量(ml/g)的水饱和正丁醇连续萃取6次，并浓缩，制得9.6g的酸枣仁胶膏，其提取率为6.4％。

酸枣仁提取物中酸枣仁皂苷A、B的定性与定量

定性实验：

定性实验的测定方法同实施例1，在所得的供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点，从而证明了酸枣仁口服液中的有效成分为酸枣仁皂苷A、B。

定量实验：

定量实验的测定方法同实施例1，测得供试品溶液中酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的峰面积分别为1503235和1273167，通过酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的标准曲线Y＝0.000355451X+10.8672，R²＝0.997538和Y＝2.160201e^-007X-6.127302e^-007，R²＝0.9931019，求得供试品溶液中的酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的浓度分别为5.45mg/g和0.86mg/g。

酸枣仁提取物中黄酮类物质的定性与定量

定性实验：

定性实验的测定方法同实施例1，所得的供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点，从而证明了酸枣仁口服液中的有效成分含有spinosin。

定量实验：

定量实验的测定方法同实施例1，测得供试品溶液的吸光度为0.651，根据芦丁的标准曲线Y＝0.0862X+0.3102，R²＝0.9979，得到黄酮类物质的含量为0.573mg/g。

实施例4 酸枣仁口服液的制备

取实施例1制得的酸枣仁胶膏50g，加入95％的酒精15ml溶解，然后加入2ml吐温-80，搅拌均匀混合；然后加入20％苯甲酸乙醇溶液0.5ml，最后分步加入蒸馏水至100ml，每加入蒸馏水后应充分搅匀，配制成含酸枣仁胶膏500mg/ml的溶液。

本品为棕褐色或淡黄色液体，有轻摇易散的沉淀，其水溶液的pH为5-6，相对密度为1.05(要求应不低于1.01)。

实施例5 酸枣仁颗粒的制备

将实施例1制得的酸枣仁胶膏50g、糊精150g、蔗糖50g充分混合，制成颗粒，烘干，整粒，过16目过滤筛即得。

实验例1 酸枣仁提取物预防肉鸡大肠杆菌病的效果试验

选择4周龄雏鸡分成7组，每组10只，其中试验组6组，即以实施例1的75％酒精提取的酸枣仁提取物高(400mg/kg)、中(200mg/kg)、低(100mg/kg)剂量组、95％酒精提取的酸枣仁提取物高(400mg/kg)、剂量组、硫酸新霉素组(8mg/kg)、阴性对照组(指不给药只攻毒)。其余一组为正常对照组(指既不给药也不攻毒)。试验组除正常对照组外，在给药第四天后(即当天)，以0.5ml/只的剂量腹腔注射大肠杆菌菌液，攻毒后再连续用药3天，而阴性对照组和正常对照组给予等量生理盐水。然后连续观察10天，在观察期间，观察各组临床症状，并记录死亡鸡数，剖检确定死亡原因，结果如下表1所示。

表1 酸枣仁提取物预防肉鸡大肠杆菌病的效果试验

结果表明，75％酸枣仁提取物高剂量组的存活率为60％，预防效果与硫酸新霉素组相当，并且显著高于95％酸枣仁提取物组以及阴性对照组。

实验例2 酸枣仁提取物体外抑制鸡毒支原体试验

将实施例1的酸枣仁提取物配制成浓度为100mg/ml的溶液。取24h能在培养基中达到对数生长期的鸡毒支原体培养物做适当稀释，使浓度达到1×10⁵cfu/mL作为本试验用菌液。取22支无菌试管，各管加入KM2培养基0.5mL。取0.5mL的100mg/ml的酸枣仁提取物溶液加入第2管，按2倍稀释法依次稀释至第13管，即第2-13管酸枣仁提取物浓度分别为：50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml、6.25mg/ml、3.125mg/ml、1.56mg/ml、0.78mg/ml、0.39mg/ml、0.195mg/ml、0.098mg/ml、0.049mg/ml、0.025mg/ml；取0.5ml的1.6mg/ml的磷酸泰乐菌素溶液加入第14管，然后按2倍稀释法依次稀释至第21管，即第14-21管的磷酸泰乐菌素的浓度为：0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/ml，然后在第1-21管中各加入0.5mL菌液及第22管中加入KM2培养基0.5mL，37℃培养。第1管为正常对照组，第22管为阴性对照组，把第14-21管作为磷酸泰乐菌素对照；重复3次。当正常对照组发生颜色改变(即培养液中酚红指示剂由红色变为橘黄色)且无混浊时，加药组不再出现颜色变化的最小药物浓度为最小有效抑制MP生长浓度(MIC)。结果如下表2所示。

表2 酸枣仁体外对鸡毒支原体S6株MIC测定结果

根据表2中的试验结果判定：酸枣仁口服液和磷酸泰乐菌素体外对支原体的MIC分别为：6.25mg/ml和0.025mg/ml，其对支原体的抑菌效果与磷酸泰乐菌素对支原体的抑菌效果属于统一敏感度的，均属于高度敏感。

实验例3 酸枣仁提取物治疗鸡毒支原体试验

人工感染鸡毒支原体强毒HS株培养物0.3ml/100g(鸡毒支原体第三代传代培养物，生长浊度为1×10⁸cfu)的鸡于感染后24h，开始施予实施2的酸枣仁口服液。将酸枣仁口服液分成高剂量组、中剂量组和低剂量组，即按鸡体重分成300mg/kg体重、150mg/kg体重、75mg/kg体重；对照药硫氰酸红菌素以10mg/kg体重给鸡饮水；另设一个感染不治疗的阳性对照组，每组鸡30只，饮用药液每天配换一次，连续用药5天，停药后观察17天。

评价指标：每天记录死亡情况，将死亡鸡解剖，观察气囊病变。发病鸡出现呼噜，张嘴，喘气，鼻腔流黏液都判断为阳性。感染20天后将存活下来的鸡各组抽取8只称重、采血分离血清作血清平板凝集反应，检测肉鸡体内鸡毒支原体抗体，并将全部鸡剖杀观察气囊病变，将每侧气囊分成4个等级，病变越严重则分值越高。测定气囊病变的公式为：(对照鸡气囊平均损伤分-试验鸡气囊平均损伤分)/对照鸡气囊损伤分×100％，计算气囊损伤减少率。

1、酸枣仁口服液对感染肉鸡成活率的影响

酸枣仁口服液对感染肉鸡成活率的影响结果如表3所示。

表3 药物治疗鸡毒支原体的结果

由表3可见，口服液以75mg/kg体重剂量口服，连续饮水5天能明显地降低感染鸡的发病率，治疗药物浓度越高，治疗效果越好，其结果接近单方的红霉素。

2、酸枣仁口服液保护鸡气囊损伤的效果

酸枣仁口服液保护鸡气囊损伤的效果，如下表4所示。

表4 各组鸡气囊损伤程度比较结果

注：气囊损伤分＝(胸气囊+腹腔气囊)/剖检鸡只数量；气囊损失减少率＝(对照组-试验组气囊损伤积)/对照组气囊损伤积分

由表4可见，酸枣仁口服液150mg/kg体重可以降低鸡毒支原体对气囊的损伤程度，治疗效果接近红霉素。

3、酸枣仁口服液对肉鸡增重的影响

酸枣仁口服液对肉鸡增重的影响，结果见如下表5所示

表5 试验鸡增重比较结果

由表5可见，感染后，酸枣仁口服液高、中、低剂量组日增重分别为15.9、19.1和16.5克/天，红霉素为15.6克/天。与对照组相比，口服液中剂量组显著性增加日增重。

4、酸枣仁口服液对鸡毒支原体抗体的影响

酸枣仁口服液对鸡毒支原体抗体的影响，结果如下表6所示。

表6 试验鸡体内鸡毒支原体抗体检测结果

由表6可见，酸枣仁口服液各剂量组可以降低鸡毒支原体的抗体阳性率，各试验组分别为20.0％、30.0％和40.0％，均显著性低于红霉素对照组。

综上所述，本发明的酸枣仁口服液能够提高鸡的增重，并且明显高于阳性对照组，特别是中剂量组，其显著性非常高。

实验例4 酸枣仁提取物预防鸡法氏囊病试验

选择临床20日龄海蓝褐雏鸡，将实施例2的酸枣仁口服液分成高剂量组(300mg/kg)、中剂量组(150mg/kg)和低剂量组(75mg/kg)、高免卵黄抗体对照组、病毒稀释液组(阳性对照组)、空白对照组(阴性对照组)，每组15只，共90只鸡。以法氏囊北京株BC6/85(中国兽药监察所)为攻毒株，BID₅₀10^-5/0.1ml，攻毒以100BID₅₀/0.1ml通过点眼途径。除空白对照组外，其它各组均攻毒，每只鸡点眼0.2ml，攻毒48h后给药。酸枣仁口服液组连续给药7天，每天分两次给药，给药后观察3天后剖检。整体观察试验组和对照组的精神状态采食量、腹泻情况，鸡只的死亡数量。剖检重点观察法氏囊的病变情况，是否肿大或萎缩、出血、表面是否有胶冻样渗出物。观察胸肌和腿肌病变指数是否出血、出血程度，测定病变指数，结果如下表7、8所示。

表7 酸枣仁口服液治疗法氏囊感染中体重变化情况

注：增重率＝(试验组后体重-试验前体重)/试验前体重×100％

表8 酸枣仁口服液治疗法氏囊试验结果

注：法氏囊病变指数：严重出血4分；中度3分；轻度1分；胸肌和腿肌病变指数：严重出血3分/侧，中度出血2分/侧，轻度出血1分/侧。

由表7、8可见，高免卵黄抗体组的增重率最好，酸枣仁口服液中剂量组的增重率其次，酸枣仁口服液高剂量组的增重率最低。从法氏囊的出血病变情况可以看出，感染对照组法氏囊病变最重，酸枣仁口服液中剂量组的病变最轻。从胸肌腿肌出血情况看，感染对照组和卵黄抗体组的病变最重，酸枣仁口服液中剂量组和高剂量组的病变最轻。

综合上述体重变化、法氏囊病变指数、胸肌和腿肌病变指数，酸枣仁口服液中剂量组对鸡传染性法氏囊病的治疗效果最好。

实验例5 酸枣仁提取物预防禽淋巴白血病新亚型病毒感染试验

选择3周龄鸡分成5组，即酸枣仁口服液高、中、低剂量组、感染对照组和金刚烷胺对照组(10mg/kg体重)。酸枣仁提取物试验组分别按高(300mg/kg体重)、中(150mg/kg体重)、低剂量组(75mg/kg体重)及金刚烷胺组连续口服4天，第5天继用禽淋巴白血病病毒新亚型稀释100倍ID₅₀(10^5.4ID₅₀)，每只通过腹腔感染接种0.25mL。攻毒后再连续口服药物3天，观察14天的鸡的呼吸道症状和肾脏肿胀。对活鸡使用安乐死，用无菌棉拭子从喉头和气管取分泌物，进行病毒分离。剖检鸡只的气管、肺脏和其它内脏器官，观察病变，结果如下表9所示。

表9 酸枣仁提取物对禽淋巴白血病新亚型的预防效果

注：发病率＝呼吸困难鸡/试验鸡数量；肺脏病变指数是指肺脏出血面积/肺脏表面积。

由表9可见，按上述酸枣仁口服液三个剂量组，试验鸡发病率分别为10％、20％和40％，黄芪多糖组为50％，病毒对照组为70％，其中酸枣仁口服液高剂量组比黄芪多糖对照组效果好。肺脏病变指数分别为0.1、0.2、0.3、0.5和0.9。说明酸枣仁提取物口服液能够预防新发现的鸡淋巴白血病亚型，其效果优于黄芪多糖。

Claims (8)

1、一种酸枣仁提取物，其通过如下方法制得：取酸枣仁粉碎过筛，脱脂，70％～75％乙醇浸泡提取，除去酒精后，加水搅拌均匀，再用水饱和正丁醇萃取，最后浓缩、风干。

2、如权利要求1所述的酸枣仁提取物，其特征在于，所述脱脂的方法是按体积重量比加入酸枣仁2～8倍量的石油醚，浸泡脱脂5～8次，每次3h～7h，脱脂完全后挥干石油醚；所述浸泡提取过程是按照体积重量比加入4～8倍量的70％～75％的酒精浸泡提取2～7次，每次1～4小时，提取完成后除去酒精；所述萃取过程是按照体积重量比加入3～6倍量水搅拌混合，然后加入2～6倍量的水饱和正丁醇连续萃取4～6次。

3、如权利要求1或2所述的酸枣仁提取物，其特征在于，所述酸枣仁提取物含有酸枣仁皂苷A：5.45～18.24mg/g、酸枣仁皂苷B：0.86～1.52mg/g、黄酮类物质：0.471～0.573mg/g。

4、权利要求1-3任一所述的酸枣仁提取物的制备方法，其特征在于，取酸枣仁粉碎过筛，脱脂，70％～75％乙醇浸泡提取，除去酒精后，加水搅拌均匀，再用水饱和正丁醇萃取，最后浓缩、风干。

5、如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述脱脂的方法是按体积重量比加入酸枣仁2～8倍量的石油醚，浸泡脱脂1～8次，脱脂完全后挥干石油醚；所述浸泡提取过程是按照体积重量比加入4～8倍量的70％～75％的酒精浸泡提取2～7次，每次1～4小时，提取完成后除去酒精；所述萃取过程是按照体积重量比加入3～6倍量水搅拌混合，然后加入2～6倍量的水饱和正丁醇连续萃取2～6次。

6、权利要求1-3任一所述的酸枣仁提取物在制备预防家禽支原体、大肠杆菌、鸡法氏囊病、禽淋巴白血病新亚型病毒病药物组合物中的应用。

7、如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的组合物为将酸枣仁提取物与常规的辅料或载体，按照常规的制剂方法制备成的片剂、颗粒剂、口服液、注射剂或冻干粉针剂。

8、如权利要求7所述的应用，其特征在于，按照每天100～600mg/kg体重的方式对家禽施药，连续4-5天口服或拌料给予。