CN102875690A - 一种抗卵巢功能衰退的中药多糖提取物、制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药领域，提供了一种抗卵巢功能衰退中药多糖提取物、制备方法及用途，具体为：取枸杞子50-200份，桑椹40-160份和生地黄30-120份，混合均匀，取6-10倍于原料药重量的10-50%聚合物水溶液充分溶解后，按质量比为盐:聚合物=0.5-3:1加入盐充分振荡，静止分相，离心分离，去其上层清液得沉淀物。沉淀部分依次用乙醇、丙酮和乙醚洗涤后，真空干燥，得多糖部位。本发明从有效部位层面，通过适当的提取纯化方法和技术，尽可能多地提取和保留其中的多糖成分，以保证中药复方的药效，提高疗效，减少服用量，活性明确，毒副作用小。

Description

一种抗卵巢功能衰退的中药多糖提取物、制备方法及用途

技术领域

本发明属于中药领域，具体涉及一种抗卵巢功能衰退中药多糖提取物、制备方法及用途。

背景技术

卵巢功能衰退可引发不孕不育、生殖系统、心血管系统、骨质疏松等系列疾病，卵巢过早衰退(Premature ovarian failure，POF，即卵巢早衰)致使患者生活质量下降。此外，随着社会经济的发展，越来越多的职业女性选择延迟生育时间，但女性的最佳生殖时间窗同样受到卵巢功能的严重限制。因此探讨卵巢功能衰退衰老机制、预测卵巢功能衰退的指标以及防治卵巢功能过早衰退的措施是当今生殖健康领域的研究热点和难点。

流行病学研究显示卵巢早衰的发生率为1%，然而这l%的妇女如何最终达到卵巢衰竭的状态，POF初始阶段的状态如何，目前仍有很多未知。有研究发现，随年龄增加，卵泡密度逐渐下降，35岁以上妇女卵泡密度明显降低，是35岁以下者卵泡密度的1/4，40岁以上妇女卵泡密度急剧降低，部分妇女卵泡密度降至0。Nikolaou估计在一般人群中至少有10%的妇女经历着过早的卵巢衰退，那根据POF的1%发生率，至少有9%的妇女处于卵巢衰退的早期状态，有专家对此状态命名为卵巢早老化 (premature ovarian aging，POA)，并对两者病因学进行比较研究，结果支持了POA是POF一种早期阶段表现的观点。有研究提示治疗高促性腺激素闭经的效果与病程以及促卵泡生成素(FSH)水平有关。

激素替代治疗（Hormone replacement therapy，HRT）是目前现代医学治疗卵巢衰老相关症状和疾病的重要方法，但现有研究明显表明其具有多种副作用和远期致癌性，使其临床应用受到明显的限制。

发明内容

本发明针对现有技术不足，根据中国遵循传统中医理论，采用中药方剂治疗，通过“补肾益阴、疏肝养血”而达到延缓卵巢衰老的目的。本发明提供了一种枸杞、桑椹和生地黄组方形成的抗卵巢功能衰退有效中药复方，从有效部位层面，通过适当的提取纯化方法和技术，尽可能多地提取和保留其中的多糖成分，以保证中药复方的药效，提高疗效，减少服用量，活性明确，毒副作用小。

本发明目的是通过下面的技术方案实现的：

一种抗卵巢功能衰退的中药多糖提取物，采用如下方法制备而成：

1）按以下重量份取原料药：枸杞子50-200份，桑椹40-160份和生地黄30-120份，混合均匀，取6-10倍于原料药重量的10-50%聚合物水溶液充分溶解后，按质量比为盐:聚合物=0.5-3:1加入盐充分振荡，静止分相，离心分离，去其上层清液得沉淀物；

2）将步骤1）得到的沉淀部分依次用乙醇、丙酮和乙醚洗涤后，真空干燥，得多糖部位。

上述聚合物优选聚乙二醇、聚维酮、葡聚糖、壬苯环氧乙烯或右旋糖酐硫酸钠一种或几种的混合物，更优选聚维酮6000，上述的盐优选KH₂PO4、K₂HPO4、(NH₄)₂SO₄、柠檬酸铵、氯化钾或硝酸钠。

上述10-50%聚合物水溶液为重量体积百分比。

上述中药多糖提取物，可以单独或与一种或一种以上的药学上可接受的载体组合制成制剂以供给药，如针剂、输液、滴丸、片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液等。

本发明所述中药多糖提取物各种剂型可以按照药学领域中熟知的方法进行制备。这些药用制剂中可以含有与载体组合的例如 0.05%~90%重量的活性成分，更常见约 15%~60%之间重量的活性成分。

本发明还提供了一种上述中药多糖提取物的制备方法，包括如下步骤：

1）按以下重量份取原料药：枸杞子50-200份，桑椹40-160份和生地黄30-120份，混合均匀，取6-10倍于原料药重量的10-50%聚合物水溶液充分溶解后，按质量比为盐:聚合物=0.5-3:1加入盐充分振荡，静止分相，离心分离，去其上层清液得沉淀物；

2）将步骤1）得到的沉淀部分依次用乙醇、丙酮和乙醚洗涤后，真空干燥，得多糖部位。

上述聚合物优选聚乙二醇、聚维酮、葡聚糖、壬苯环氧乙烯或右旋糖酐硫酸钠一种或几种的混合物，更优选聚维酮6000，上述的盐优选KH₂PO4、K₂HPO4、(NH₄)₂SO₄、柠檬酸铵、氯化钾或硝酸钠。

上述中药多糖提取物经药理实验证实其具抗卵巢功能衰退功能，所述的卵巢衰退症状优选多囊卵巢综合征、功能性月经不调、卵巢早衰或绝经期综合征。

本发明提供了一种上述中药多糖提取物在制备抗卵巢功能衰退药物中的应用。

本发明所述中药多糖提取物采用的中药复方由枸杞、桑椹和地黄组成，其中，枸杞味甘，性平。能补肝肾，益精血，明目, 主治肝肾阴亏，腰膝酸软，头晕，目眩，目昏多泪，虚劳咳嗽，消渴，遗精。现代医学研究证明：枸杞有免疫调节、抗氧化、抗衰老、 抗肿瘤、 抗疲劳、降血脂、降血糖、降血压、补肾、保肝、明目、养颜、健脑、 排毒、保护生殖系统、抗辐射损伤等十六项功能，其活性部位为枸杞多糖。桑椹味甘酸, 性寒,有补肝益肾、养血生津、滋液熄风、润肠通便的作用, 主治肝肾阴虚、耳鸣、津液不足、老年便秘、消渴、瘰疬、关节不利、神经衰弱等证，活性部位为多糖及其微量元素。生地黄味甘，苦，性寒，归心、肝、肺经，具有清热凉血、养阴、生津之功效，用于热病舌绛烦渴、阴虚内热、骨蒸劳热、内热消渴、吐血、衄血、发斑发疹等证，活性部位为多糖。

现有文献《枸杞多糖对自然衰老雌性大鼠卵巢保护作用机制的探讨》（韦敏，郑生智，马红等，《中药材》，2011年12期）公开发现枸杞多糖对大鼠卵巢系统具有保护作用。《六味地黄丸治疗卵巢早衰的实验研究》（杨兰英，《山西中医学院学报》2002年第01期）研究了六味地黄丸对大鼠下丘脑—垂体—卵巢轴的调节作用，恢复、改善卵巢功能，提高体内雌激素水平，调整内分泌的作用。但是尚无针对由枸杞、桑椹和地黄组成中药复方的多糖有效部位治疗卵巢功能衰退的报道。目前，含有枸杞、桑椹和地黄等药材的中药复方多用于男性疾病治疗与保健，未用于女性卵巢疾病治疗与保健，如申请号为CN201110196777.6，公开号为CN102258627A的中国专利文献“一种男士保健酒及其制备方法”公开了一种男士保健酒及其配制方法，炮制药材中含有鹿茸、不老草、肉苁蓉、锁阳、淫羊藿叶、海马、海狗肾、蛤蚧、生地黄、山萸肉、菟丝子、桑椹子、覆盆子、五味子、枸杞子、蛇床子、车前子、灵芝、吉林人参、云苓、冬虫夏草、红景天、雪莲、鹿鞭、牛鞭、狗鞭、雄蚕蛾、蜈蚣、当归、白芍、灸甘草、黑蚂蚁、红蚂蚁、炒枣仁、制首乌。申请号为CN200610067535.6，授权公告号为CN1857520的中国专利文献“治疗不育症的药物”公开了一种治疗不育症的药物，它的原料组成为，紫河车10－30份、淫羊藿10－30份、枸杞子10－20 份、沙苑子5－15份、女贞子10－30份、覆盆子5－15份、五味子5－15份、桑椹子5－15份、菟丝子5－15份、何首乌 10－30份、生地黄5－15份、当归10－30份和甘草梢5－15 份。主要适应由于男性引起的少精子症，畸形精子症、无精子症的不育症患者。申请号为CN200610074229.5 ，公开号为CN1861164的中国专利文献“一种治疗阴虚火旺型男子不育症的汤剂药物及制备方法”公开了一种治疗阴虚火旺型男子不育症的汤剂药物及制备方法，涉及治疗阴虚火旺型男子不育症的中草药配方，其药物是由下述重量份的原料制成的：炒黄柏、知母各12～15 克，生地黄、山萸肉、女贞子、桑椹、旱莲草、枸杞子、何首乌、牡丹皮、泽泻、炙龟板各9～12克。

此外，本发明技术方案采用双水相萃取法提取中药多糖有效部位，有别于多糖常规的提取方法，多糖提取工艺常见于水提醇沉法、超声法、微波法或调整pH值来提取。文献《微波法与传统工艺提取枸杞多糖的比较研究》(陈金娥,李成义,张海容.中成药,2006,28(4): 573-576)、《枸杞多糖的提取分离及其组成研究》（苟春林,苟金萍,张艳等.宁夏农林科技，2012,53(5):89-90,92）、《枸杞多糖提取方法的研究进展》(张爽,王飞娟,王燕.中国科技信息,2012, 7:148)、《枸杞多糖提取工艺优化方法的研究进展》(翁艳英,张贞发.科技信息,2012,11:19)、以及《黑果枸杞多糖的纯化工艺研究》(彭强,吕晓鹏,黄琳娟,等.西北农业学报,2012,21(2):121-126)等科技文献中多采用酶提法、水提法、超声法、微波法、碱提法、超临界萃取，纯化有脱盐、反渗透浓缩、冷冻升华干燥、超滤法、sevage除蛋白、过氧化氢除色素、透析法等进行枸杞多糖的提取和纯化。文献《桑椹多糖提取工艺的优化》(魏兆军,胡海梅,柏晓辉,等.食品科学,2007,28(11):261-264)、《新疆黑桑椹多糖的提取和测定》(江岩,李斌,郭晓军.食品科学,2008,29(8):224-226)、《新疆黑桑椹多糖超声提取工艺优选》(江岩.中国酿造.2009,3:138-140)等科技文献中公开了桑椹使用超声提取、水提醇沉，采用sevage除蛋白、透析法等手段纯化桑椹多糖。文献《超滤膜技术在多糖提取方面的应用》（胡亚芹,曹杨.生物技术通讯,2005,16(2):228-230）、《超声技术在熟地黄多糖提取中的应用》（陈传福,张晓伟,张培正.食品科学,2008,29(02):184-187）、《地黄多糖的提取纯化工艺研究》(赵平鸽,刘晓.中国药房,2010,21(23):2146-2148)、《地黄多糖的研究概况》（王玉华,王伟.上海中医药杂志,2007,41(5):81- 83）、《地黄多糖提取分离技术的研究进展》（许春鹃,薛进华,范启兰.赣南医学院学报,2012,32(2):315-316）等文献公开了使用酶提法、微波法、超声法、水提醇沉法、超滤法，采用sevage除蛋白、透析法、过氧化氢脱色、离子水逆流透析等工艺纯化多糖。上述文献中对枸杞、桑椹、地黄多糖的提取纯化工艺均为常规方法，工艺繁杂，且提取率不高。

本发明使用双水相萃取法，利用两种化学结构不同的亲水性高聚物或者一种亲水性高聚物与无机盐在水中以适当的浓度形成的互不相溶的两个水相体系，利用体系中多糖、蛋白质和其它生物分子在两个水相间分配系数的差异，而使得各自溶解度不同，从而进行分离。本发明工艺条件温和、处理时间短、后处理简便，不会引起生物活性物的失活和变性，即保留复方中各药材成分的综合作用，有利于发挥中药的多效性，又去除了组织物质和部分无效成分，延长了储存期，提高了纯度，减少了服用量，质量控制的再现性提高，同时提供了一种活性多糖的新的工业化提取途径，该法省时，省力，提取物多糖含量高，提取率高。

此外本发明克服现有的胶囊服用剂量大、贮存不便、时间短的特点，通过对全方原料药材用适宜的溶剂提取分离并筛选出药效较高部位，保留药材有效成分，去除组织物质和部分无效成分，活性明显提高，减少服用量，增强药物顺医性，质量控制的再现性提高，方便贮藏和运输。本发明的方法工艺简单安全，所得有效部位药效强于原方药材，生产成本低，适于工业化生产，制备出的组合物为活性成分可制成各种药物剂型，如软胶囊、片剂、滴丸、缓控释剂等等。

附图说明                                                                              

图1为流式细胞仪检测药物作用后的凋亡指数图。

具体实施方式

 以下将结合具体实施例对本发明做进一步阐述，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。本发明的实验动物，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心（生产许可证号：SCXK(军)2007-004）。

实施例1 

 称取一定量的聚维酮6000溶于去离子水中，按照表1配制溶液，备用。

按照表1中的各组方比例称取原料药，混合均匀，用聚维酮6000水溶液充分溶解后，按表1中的比例加入柠檬酸铵充分振荡，静止分相，离心分离，去其上层清液得沉淀物；所得沉淀部分用乙醇、丙酮和乙醚分别洗涤后，真空干燥，得多糖部位。

表1 提取工艺各组分及试剂比例

枸杞

桑椹

生地黄

聚维酮6000浓度

聚维酮6000用量

柠檬酸铵/聚维酮6000质量比

多糖含量

多糖提取物1

50份

100份

75份

10%

135份

0.5:1

68.39%

多糖提取物2

125份

160份

30份

30%

756份

2:1

75.63%

多糖提取物3

200份

40份

120份

50%

1800份

3:1

70.82%

 实施例2 提取工艺比较

样品1（常规水提醇沉法）：取200千克枸杞子、160千克桑椹和生地黄120千克，加7000千克水，浸泡30分钟，第一次煎煮1小时，第二次加7000千克水，煎煮1小时，过100目网，合并提取液，管式分离机离心（16000r/min），取上清液，减压浓缩至提取液1ml含1g生药，加入90%的乙醇醇沉两次（含醇量为80%），得沉淀部分和醇溶部分，沉淀部分干燥后经测定后确定多糖提取率为5.387%。

样品2（超声法）：取200千克枸杞子、160千克桑椹和生地黄120千克，加7000千克水混合，并在搅拌器内搅拌均匀，然后经管道缓慢流入容器，在该管道的管壁上设有超声波发生器，他对管道内缓慢流动的混合物进行超声振荡破碎处理，处理时间为30分钟，管式分离机离心（16000r/min），取上清液，减压浓缩至提取液1ml含1g生药，加入90%的乙醇醇沉两次（含醇量为80%），得沉淀部分和醇溶部分，沉淀部分干燥后经测定后确定多糖提取率为6.120%。

样品3（聚乙二醇-硫酸铵双相水系统）：称取聚乙二醇6000溶于去离子水中，配制为浓度为20%的溶液，备用。

按以下重量份取原料药：枸杞子200份，桑椹160份和生地黄120份，混合均匀，6倍体积取聚乙二醇水液充分溶解后，按硫酸铵/聚乙二醇6000质量比为2:1加入硫酸铵充分振荡，静止分相，离心分离，去其上层清液得沉淀物；所得沉淀部分用乙醇、丙酮和乙醚分别洗涤后，真空干燥，得多糖部位，经测定后确定多糖提取率为7.338%。

样品4（聚维酮-柠檬酸铵双相水系统）：称取聚维酮6000溶于去离子水中，配制为浓度为20%的溶液，备用。

按以下重量份取原料药：枸杞子200份，桑椹160份和生地黄120份，混合均匀，6倍体积取聚维酮水液充分溶解后，按柠檬酸铵/聚维酮6000质量比为2:1加入柠檬酸铵充分振荡，静止分相，离心分离，去其上层清液得沉淀物；所得沉淀部分用乙醇、丙酮和乙醚分别洗涤后，真空干燥，得多糖部位，经测定后确定多糖提取率为8.762%。

结果明显可见用本发明方法提取最省时，省力，提取率最高，该方法为工业化提取多糖提供了新途径。

实施例3建立测定总多糖含量的方法

1）试剂与仪器

分析天平；721型分光光度计；恒温水浴锅；离心机；浓硫酸；无水乙醇

2）配制溶液

葡萄糖标准溶液:精密称取在硫酸干燥器中干燥至恒重的葡萄糖标准品0.1000g，加水配置成100mg/L的葡萄糖溶液。

蒽酮试剂：称取0.1g蒽酮溶于100ml 72%硫酸（当天配制）

3）标准曲线的制作

精密吸取葡萄糖标准使用液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8ml置于10ml具塞试管中，加水至1.0ml，加入蒽酮试剂4.0ml，置沸水浴中加热7分钟，取出置冷水浴中冷却，用1cm比色皿在620nm测定吸光度值。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，得回归方程为：Y=13.455x-0.0045，r=0.9949，线性范围为0.01-0.08mg/ml。样品多糖含量的测定按上述操作进行，称取多糖样品为50mg，移取溶液为1.00mL。

 4）精密度试验

精密量取标准品溶液（C=0.05mg/ml）1ml，共6份，按照标准曲线项下精密加入蒽酮试剂，测定其吸光度，结果显示其平均吸光度为0.668，RSD为1.98%。

5）重复性试验

   精密量取同一样品溶液1ml，共6份，按照标准曲线项下精密加入蒽酮试剂，测定其吸光度，结果显示其平均吸光度为0.664，RSD为2.06%。

实施例4 提取物的鉴别及确认

Molisch反应（α- 萘酚反应）鉴定糖类最常用的颜色反应。它的原理是：糖类在浓酸作用下所形成的糠醛及其衍生物可以与α- 萘酚作用，形成红紫色复合物。由于在糖溶液与浓硫酸两液面间出现红紫色的环，因此又称紫环反应。α- 萘酚也可用麝香草酚或其他的苯酚化合物代替，麝香草酚溶液比较稳定，其灵敏度与α- 萘酚一样。除了糖类之外，各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸、丙酮、甲酸、乳酸等都可以呈现近似的阳性反应。

本发明实施例1制备的干燥物经Molisch反应（α- 萘酚反应）鉴别为阳性反应。

实施例5活性多糖对离体卵巢颗粒细胞活性的影响

动物实验方法：取22-27日龄雌性大鼠，常规饲养48 h后颈椎脱臼法处死，无菌摘取大鼠的双侧卵巢，将卵巢破碎使颗粒细胞释放，用2mL含青霉素和链霉素的DMEM-F12培养液中稀释，并轻轻吹打，使其分散成单个细胞。离心过滤收集颗粒细胞。（1）MTT法：将一定浓度细胞悬液接种于24孔板，每孔80μl，每孔再加120μl培养液调整细胞密度至200μl/孔，每组设6个平行孔。将其置于5%CO₂培养箱中培养24h。取CO₂培养箱内培养了24 h的颗粒细胞悬液，每孔先后加入造模浓度氯化镉和1mg·mL^-1样品（样品1-3分别为本发明实施例1中多糖提取物1-3），平行设定正常对照组（生理盐水）和模型组（氯化镉和生理盐水）。常规培养20 h后于每孔中加入MTT溶液（5 mg·mL^-1）20 μL继续培养4 h，每孔加入80 μL的三联液，过夜培养，选择570 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度，结果见表2。（2）放射免疫法：将一定浓度细胞悬液接种于24孔板，每孔80μl，每孔再加120μl培养液调整细胞密度至200μl/孔，每组设6个平行孔。将其置于5%CO₂培养箱中培养24h。取CO₂培养箱内培养了24 h的颗粒细胞悬液，每孔先后加入造模浓度氯化镉和1mg·mL^-1不同样品，平行设定正常对照组（生理盐水）和模型组（氯化镉和生理盐水）。将其置于5%CO₂培养箱中培养24h。离心取其细胞上清液，用放免试剂盒测定E₂、P的含量，结果见表2。（3）流式细胞术：同法取得卵巢颗粒细胞后，将一定浓度细胞培养于培养瓶中，先后加入造模浓度氯化镉和1mg·mL^-1样品（样品1-3分别为本发明实施例1中多糖提取物1-3）与培养瓶中，平行设定正常对照组（生理盐水）和模型组（氯化镉和生理盐水），24小时后消化取得细胞悬液进行流式细胞仪检测（见图1），分析给药与卵巢颗粒细胞的凋亡关系。

MTT法和放射免疫法结果显示模型组与正常对照组在细胞增殖活性及雌孕激素分泌能力上均有显著性差异（p<0.01），可见造模成功。样品1-3在细胞增殖活性及雌孕激素分泌能力上均与模型组有显著性差异，可见提取的活性多糖对离体卵巢颗粒细胞具有显著的增殖作用，能显著提高离体卵巢颗粒细胞的雌孕激素分泌水平（均p<0.01），其中可能由于样品2的多糖含量高于样品1及样品3，样品2活性在数据上略高于样品1和样品3，但组间未见差异。

表2活性多糖对离体卵巢颗粒细胞活性的影响（                                                

±SD, n=6）

组别

阳性对照组

样品1

样品2

样品3

模型组

正常对照组

MTT吸收度(A)

0.435±0.091**

0.405±0.037**

0.413±0.022**

0.408±0.023**

0.233±0.064ΔΔ

0.465±0.093

雌激素（pmol/L）

83.89±5.33**

72.63±2.48**

75.14±2.07**

73.02±2.64**

36.19±1.98ΔΔ

101.85±6.38

孕激素（nmol/L）

0.38±0.06

0.58±0.04**

0.62±0.03**

0.60±0.05**

0.36±0.03ΔΔ

0.69±0.07

*P<0.05，**P<0.01 vs 模型组.  ^ΔP<0.05，^ΔΔP<0.01 vs正常对照组

流式细胞术结果显示：附图1中，UL代表死细胞，UR代表晚期凋亡，LL代表活细胞，LR代表早期凋亡，UR+LR为凋亡总值。图1A（正常对照组）凋亡值为25.70，图1B（模型组）凋亡值为86.65，图1C（阳性对照组）凋亡值为47.04，图1D（样品1组）凋亡值为33.66，图1E（样品2组）凋亡值为25.72，图1F（样品3组）凋亡值为26.30，根据数值可见样品1-3对卵巢颗粒细胞具有较好的抗凋亡作用。

实施例6  活性多糖对多囊卵巢综合征模型大鼠的影响

24d龄未成年SD雌性大鼠，体重30-40g，0.5mg18-甲基炔诺酮日1次皮下注射，在27d龄时，加用HCG 1.5IU 日2次皮下注射，共注射21d。造模成功后，随机分为模型组、样品（样品1-3分别为本发明实施例1中多糖提取物1-3）组及阳性药组（二甲双胍0.018g/d），每组各10只，另取45d龄SD雌性大鼠10只为正常对照组，每天灌胃1次，正常对照组和模型组给予等容积生理盐水，连续给药15天后，末次给药后取血检测血清中FSH、LH、T浓度，结果见表3。结果显示模型组与正常对照组均有显著性差异（p<0.01），灌服阳性药、样品1-3（高低剂量）15天后FSH、LH、T水平均与模型组有不同显著性的差异。

 表3 本发明组和对照组血清中FSH、LH、T浓度的比较（±SD, n=10）

组别

阳性对照组

样品1高剂量组

样品1低剂量组

样品2高剂量组

样品2低剂量组

样品3高剂量组

样品3低剂量组

模型组

正常对照组

FSH/U·L-1

6.21±0.11**

6.26±0.09*

6.01±0.06*

6.31±0.09**

6.28±0.08**

6.30±0.05**

6.21±0.07**

6.02±0.10ΔΔ

6.81±0.12

LH/U·L-1

11.94±1.79**

15.33±1.02*

16.56±1.24

14.43±1.34*

15.37±1.01*

14.98±1.21*

15.24±1.38*

17.24±1.32ΔΔ

10.67±2.33

T/nmol·L-1

21.42±0.37**

26.35±0.43**

27.68±0.87**

23.03±0.84**

27.33±0.74**

23.62±0.92**

28.43±0.60**

44.39±0.84ΔΔ

19.65±0.69

*P<0.05，**P<0.01 vs 模型组.  ^ΔP<0.05，^ΔΔP<0.01 vs正常对照组

实施例7 活性多糖对卵巢早衰大鼠性激素水平的影响

    采用9d龄SD雌性大鼠，连续腹腔注射14天环磷酰胺8mg/（kg·d）造模。造模成功后，随机分为模型组、样品（样品1-3分别为本发明实施例1中多糖提取物1-3）组及阳性药组（倍美力0.075mg/kg），每组各10只，另取23d龄SD雌性大鼠10只为正常对照组，每天灌胃1次，正常对照组和模型组给予等容积生理盐水，连续给药35天后，末次给药后取血检测血清中FSH、E₂浓度，结果见表4。结果显示模型组与正常对照组均有显著性差异（p<0.01），灌服阳性药、样品1-3（高低剂量）35天后FSH、E₂水平均与模型组有不同显著性的差异。

表4 本发明组和对照组血清中FSH、E ₂ 浓度的比较（±SD, n=10）

组别

阳性对照组

样品1高剂量组

样品1低剂量组

样品2高剂量组

样品2低剂量组

样品3高剂量组

样品3低剂量组

模型组

正常对照组

FSH/U·L-1

0.101±0.010**

0.144±0.011**

0.152±0.014**

0.123±0.012**

0.134±0.015**

0.127±0.009**

0.139±0.017**

0.194±0.017ΔΔ

0.081±0.014

E2/pg·mL-1

91.59±24.00**

88.76±9.72*

85.34±9.30

92.87±10.55**

87.42±9.46*

91.64±9.532**

88.34±9.08*

75.39±15.38ΔΔ

109.35±19.11

*P<0.05，**P<0.01 vs 模型组.  ^ΔP<0.05，^ΔΔP<0.01 vs正常对照组

Claims (8)

1.一种抗卵巢功能衰退的中药多糖提取物，其特征在于采用如下方法制备而成：

1）按以下重量份取原料药：枸杞子50-200份，桑椹40-160份和生地黄30-120份，混合均匀，取6-10倍于原料药重量的10-50%聚合物水溶液充分溶解后，按质量比为盐:聚合物=0.5-3:1加入盐充分振荡，静止分相，离心分离，去其上层清液得沉淀物；

2）将步骤1）得到的沉淀部分依次用乙醇、丙酮和乙醚洗涤后，真空干燥，得多糖部位。

2.如权利要求1所述的抗卵巢功能衰退的中药多糖提取物，其特征在于所述聚合物为聚乙二醇、聚维酮、葡聚糖、壬苯环氧乙烯或右旋糖酐硫酸钠一种或几种的混合物，所述的盐为KH₂PO₄、K₂HPO₄、(NH₄)₂SO₄、柠檬酸铵、氯化钾或硝酸钠。

3.如权利要求2所述的抗卵巢功能衰退的中药多糖提取物，其特征在于所述聚合物为聚维酮6000。

4.如权利要求1-3所述的抗卵巢功能衰退的中药多糖提取物，其特征在于加入药剂学上可接受的相应辅料，所述药剂是针剂、输液、滴丸、片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液。

5.一种如权利要求1所述的抗卵巢功能衰退的中药多糖提取物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1）按以下重量份取原料药：枸杞子50-200份，桑椹40-160份和生地黄30-120份，混合均匀，取6-10倍于原料药重量的10-50%聚合物水溶液充分溶解后，按质量比为盐:聚合物=0.5-3:1加入盐充分振荡，静止分相，离心分离，去其上层清液得沉淀物；

2）将步骤1）得到的沉淀部分依次用乙醇、丙酮和乙醚洗涤后，真空干燥，得多糖部位。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述聚合物为聚乙二醇、聚维酮、葡聚糖、壬苯环氧乙烯或右旋糖酐硫酸钠一种或几种的混合物，所述的盐为KH₂PO₄、K₂HPO₄、(NH₄)₂SO₄、柠檬酸铵、氯化钾或硝酸钠。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述聚合物为聚维酮6000。

8.如权利要求1-3所述的抗卵巢功能衰退的中药多糖提取物在制备抗卵巢功能衰退药物中的应用。

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