CN104558229B - 一种枸杞多糖的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物大分子分离纯化技术领域，尤其是一种枸杞多糖的分离纯化方法。该方法使用新型温敏嵌段共聚物聚环氧乙烷‑聚环氧丙烷‑聚环氧乙烷与无机盐形成双水相体系，去除枸杞多糖中的蛋白质，色素等小分子杂质。使用透析法去除下相中的无机盐，乙醇沉淀得到多糖成品；借助温敏聚合物的温度响应行为，经过降温沉淀蛋白质，调节pＨ值，加热分相等多步骤的综合操作，对上相中的温敏聚合物成功地进行了回收。本发明提供了一种高效、绿色、低成本的除蛋白新方法，温敏嵌段共聚物得到了有效的回收再利用，克服了传统聚合物双水相方法成相聚合物价格昂贵且难以回收的缺点，大大降低了物耗与成本，为该方法大规模应用于工业化生产铺平了道路。
Description
技术领域
本发明属于生物大分子分离纯化技术领域，特别涉及一种枸杞多糖的分离纯化方法。
背景技术
枸杞多糖是由几种单糖组成的大分子物质，分子量在80~120 kDa之间，是枸杞中重要的活性物质。枸杞多糖具有良好的保健以及医药价值，在增强免疫功能、抗衰老、护肝、降血糖、降血脂、抑制肿瘤生长、对放疗的增敏、化疗的增效减毒都具有良好的功能。枸杞多糖凭借其良好的保健药用价值，展现出广阔的商业价值。传统枸杞多糖的提取方法多为水提醇沉法，所得枸杞粗多糖含有蛋白质杂质，需要除去。植物多糖粗蛋白质的传统方法有：①Sevage法；②三氯乙酸法；③鞣酸法。传统的除蛋白法均存在工艺繁琐，有机溶剂用量大，物耗能耗大，成本高，易造成多糖活性降低以及有机溶剂残留。
双水相体系（Aqueous Two-Phase System, ATPS）是一种或几种物质的水溶液以一定浓度混合，在一定条件下形成的互不相溶的两相水溶液体系。双水相萃取（AqueousTwo-Phase Extraction, ATPE）是基于双水相体系的一种极具前途的新型分离技术。与传统的有机溶剂萃取相同，双水相萃取原理也是依据物质在两相间的选择性分配。但相比于传统的溶剂萃取，双水相萃取可以更有效地分离极性有机物。同时，对于一些具有生物活性或极具价值的物质，该方法避免了大量有机溶解的使用可能会造成生物活性物质的变性和失活。总而言之，双水相萃取作为一种新型液液萃取分离技术，具有操作条件温和，安全无毒或低毒，工艺简单，具有良好的生物相容性，可与原有有机溶剂萃取生产中的其它流程有效结合等优势，具有良好的应用前景。但现有的双水相体系大多使用传统聚合物诸如聚乙二醇等，这类聚合物大多存在着回收分离困难，成本高等缺陷，这就限制了这些聚合物形成的双水相在工业化生产中的大规模应用。本方法采用新型温敏共聚物聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷（EOPOEO），相较于传统双水相中使用的聚合物，本方法中使用的EOPOEO得到了有效的回收再利用，相较于传统双水相大大降低了生产成本，同时更为环保，这就使得该方法在工业化大生产中具有良好的应用前景。
传统枸杞多糖的提取方法多为水提醇沉法，所得枸杞粗多糖会带有蛋白质、色素、等小分子杂质，这直接影响到了产品的质量。所以，必须对枸杞粗多糖进行纯化。使用EOPOEO-无机盐双水相体系对枸杞粗多糖进行纯化，借助多糖与蛋白质等杂质在两相间分配的不同，使得枸杞多糖与蛋白质等杂质的有效分离。最后，借助透析、醇沉和加热分相等手段回收产品和原料。
发明内容
本发明的目的在于克服目前枸杞多糖纯化工艺流程长、物耗能耗高、污染大的缺陷，提供一种工艺流程更为简单、成本低廉、绿色环保的枸杞纯多糖的分离纯化方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种枸杞多糖的分离纯化方法，其特征在于按照下述步骤进行：
（1）按比例将新型温敏嵌段共聚物聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷（EOPOEO）与无机盐混合，制备EOPOEO-无机盐双水相体系；
（2）将枸杞粗多糖溶液加入步骤（1）所得的双水相体系中，振荡得混合体系，然后静置分相，将上下相分离；
（3）将步骤（2）得到的下相装入透析袋（8000-14000Da)中，于蒸馏水中透析24h以除去盐及其它小分子杂质；所得的透析液减压浓缩，再与95%的乙醇混合均匀，4℃下静置12h，得到纯化枸杞多糖；
（4）将步骤（2）中得到的上相于4℃下静置过夜以沉淀蛋白质，离心取上层清液，然后与0.11M的氢氧化钠混合，升温至70℃分相4h，将下层相分出以回收EOPOEO。
步骤（1）中，所述无机盐为磷酸二氢钠，硫酸铵, 柠檬酸钠,磷酸氢二钾。
步骤（1）中，所述双水相体系中无机盐的质量分数为12-28%，EOPOEO质量分数为12-28%。
步骤（2）中，所述混合体系中枸杞多糖的浓度为4-8mg/g。
步骤（2）中，所述静置分相的温度为5-35℃，时间为12h。
步骤（3）中，所述乙醇的用量为透析液浓缩后浓缩液体积的5倍。
步骤（4）中，所述0.11M的氢氧化钠与上层清液的质量比为1:10-10:1。
本发明的有益效果为：
（1）在EOPOEO-无机盐双水相体系中，加入枸杞粗多糖，将其中的蛋白质等小分子杂质萃取到双水相体系上相，而枸杞多糖分配在下相中。回收双水相体系中下相，加醇沉淀得到纯化的枸杞多糖。与传统工艺相比，缩短了工艺流程，减少了有机溶剂用量，降低了物耗和能耗。
（2）EOPOEO-无机盐双水相体系应用于除蛋白过程，与Sevage法、三氯乙酸法、鞣酸法等传统方法相比，条件温和，有机溶剂使用和残留少，绿色环保。
（3）本方法双水相体系中所用温敏嵌段共聚物EOPOEO经过降温、加入氢氧化钠、加热分相等步骤后，得到了有效的回收。同时，回收的聚合物被有效地再利用。与传统双水相体系相比，本方法解决了成相聚合物难以分离回收的难题，减少了物耗，大大降低了生产成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1
（1）将新型温敏嵌段共聚物聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷（EOPOEO）与磷酸二氢钠混合，制备EOPOEO-磷酸二氢钠双水相体系。双水相体系中磷酸二氢钠的质量分数为12%，EOPOEO质量分数为20%；
（2）将枸杞粗多糖溶液加入步骤（1）所述的EOPOEO-磷酸二氢钠双水相体系中，振荡混合，使体系中枸杞多糖的浓度为6mg/g，然后于15℃条件下静置分相12h，将上下层相分离；
（3）将步骤（2）得到的下相装入透析袋（8000-14000Da)中，于蒸馏水中透析以除去盐及其它小分子杂质。后将所得的透析产物与5倍体积的95%乙醇混合均匀，4℃下静置12h，得到纯化枸杞多糖。多糖的回收率为87.6%，蛋白质的残留率为44.4%；
（4）将步骤（2）中得到的上相4℃下静置过夜以沉淀蛋白质，离心取上层清液，然后与0.11M的氢氧化钠混合（质量比为1:9），升温至70℃分相4h，将下层相分出以回收EOPOEO，EOPOEO的回收率为94.5％。
实施例2
（1）将新型温敏嵌段共聚物聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷（EOPOEO）与磷酸二氢钠混合，制备EOPOEO-磷酸二氢钠双水相体系。双水相体系中磷酸二氢钠的质量分数为28%，EOPOEO质量分数为20%；
（2）将枸杞粗多糖溶液加入步骤（1）所述的EOPOEO-磷酸二氢钠双水相体系中，振荡混合，使体系中枸杞多糖的浓度为6mg/g，然后于15℃条件下静置分相12h，将上下层相分离；
（3）将步骤（2）得到的下相装入透析袋（8000-14000Da)中，于蒸馏水中透析以除去盐及其它小分子杂质。后将所得的透析产物与5倍体积的95%乙醇混合均匀，4℃下静置12h，得到纯化枸杞多糖。多糖的回收率为84.9%，蛋白质的残留率为6.4%；
（4）将步骤（2）中得到的上相4℃下静置过夜以沉淀蛋白质，离心取上层清液，然后与0.11M的氢氧化钠混合（质量比为1:10），升温至70℃分相4h，将下层相分出以回收EOPOEO，EOPOEO的回收率为97.8%。
实施例3
（1）将新型温敏嵌段共聚物聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷（EOPOEO）与磷酸二氢钠混合，制备EOPOEO-磷酸二氢钠双水相体系。双水相体系中磷酸二氢钠的质量分数为24%，EOPOEO质量分数为12%；
（2）将枸杞粗多糖溶液加入步骤（1）所述的EOPOEO-磷酸二氢钠双水相体系中，振荡混合，使体系中枸杞多糖的浓度为6mg/g，然后于15℃条件下静置分相12h，将上下层相分离；
（3）将步骤（2）得到的下相装入透析袋（8000-14000Da)中，于蒸馏水中透析以除去盐及其它小分子杂质。后将所得的透析产物与5倍体积的95%乙醇混合均匀，4℃下静置12h，得到纯化枸杞多糖。多糖的回收率为97.3%，蛋白质的残留率为36.1%；
（4）将步骤（2）中得到的上相4℃下静置过夜以沉淀蛋白质，离心取上层清液，然后与0.11M的氢氧化钠混合（质量比为10:1），升温至70℃分相4h，将下层相分出以回收EOPOEO，EOPOEO的回收率为97.2%。
实施例4
（1）将新型温敏嵌段共聚物聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷（EOPOEO）与磷酸二氢钠混合，制备EOPOEO-磷酸二氢钠双水相体系。双水相体系中磷酸二氢钠的质量分数为24%，EOPOEO质量分数为28%；
（2）将枸杞粗多糖溶液加入步骤（1）所述的EOPOEO-磷酸二氢钠双水相体系中，振荡混合，使体系中枸杞多糖的浓度为6mg/g，然后于15℃条件下静置分相12h，将上下层相分离；
（3）将步骤（2）得到的下相装入透析袋（8000-14000Da)中，于蒸馏水中透析以除去盐及其它小分子杂质。后将所得的透析产物与5倍体积的95%乙醇混合均匀，4℃下静置12h，得到纯化枸杞多糖。多糖的回收率为80.1%，蛋白质的残留率为14.7%；
（4）将步骤（2）中得到的上相4℃下静置过夜以沉淀蛋白质，离心取上层清液，然后与0.11M的氢氧化钠混合（质量比为1:9），升温至70℃分相4h，将下层相分出以回收EOPOEO，EOPOEO的回收率为93.5%。
实施例5
（1）将新型温敏嵌段共聚物聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷（EOPOEO）与磷酸二氢钠混合，制备EOPOEO-磷酸二氢钠双水相体系。双水相体系中磷酸二氢钠的质量分数为24%，EOPOEO质量分数为20%；
（2）将2g的20g/L枸杞粗多糖溶液加入步骤（1）所述的EOPOEO-磷酸二氢钠双水相体系中，振荡混合，使体系中枸杞多糖的浓度为4mg/g，然后于15℃条件下静置分相12h，将上下层相分离；
（3）将步骤（2）得到的下相装入透析袋（8000-14000Da)中，于蒸馏水中透析以除去盐及其它小分子杂质。后将所得的透析产物与5倍体积的95%乙醇混合均匀，4℃下静置12h，得到纯化枸杞多糖。多糖的回收率为97.1%，蛋白质的残留率为20%；
（4）将步骤（2）中得到的上相4℃下静置过夜以沉淀蛋白质，离心取上层清液，然后与0.11M的氢氧化钠混合（质量比为1:9），升温至70℃分相4h，将下层相分出以回收EOPOEO，EOPOEO的回收率为96.4％。
实施例6
（1）将新型温敏嵌段共聚物聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷（EOPOEO）与磷酸二氢钠混合，制备EOPOEO-磷酸二氢钠双水相体系。双水相体系中磷酸二氢钠的质量分数为24%，EOPOEO质量分数为20%；
（2）将枸杞粗多糖溶液加入步骤（1）所述的EOPOEO-磷酸二氢钠双水相体系中，振荡混合，使体系中枸杞多糖的浓度为8mg/g，然后于15℃条件下静置分相12h，将上下层相分离；
（3）将步骤（2）得到的下相装入透析袋（8000-14000Da)中，于蒸馏水中透析以除去盐及其它小分子杂质。后将所得的透析产物与5倍体积的95%乙醇混合均匀，4℃下静置12h，得到纯化枸杞多糖。多糖的回收率为75.2%，蛋白质的残留率为26.1%；
（4）将步骤（2）中得到的上相4℃下静置过夜以沉淀蛋白质，离心取上层清液，然后与0.11M的氢氧化钠混合（质量比为1:9），升温至70℃分相4h，将下层相分出以回收EOPOEO，EOPOEO的回收率为97.2%。
实施例7
（1）将新型温敏嵌段共聚物聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷（EOPOEO）与磷酸二氢钠混合，制备EOPOEO-磷酸二氢钠双水相体系。双水相体系中磷酸二氢钠的质量分数为24%，EOPOEO质量分数为20%；
（2）将2.5g的20g/L枸杞粗多糖溶液加入步骤（1）所述的EOPOEO-磷酸二氢钠双水相体系中，振荡混合，使体系中枸杞多糖的浓度为5mg/g，然后于5℃条件下静置分相12h，将上下层相分离；
（3）将步骤（2）得到的下相装入透析袋（8000-14000Da)中，于蒸馏水中透析以除去盐及其它小分子杂质。后将所得的透析产物与5倍体积的95%乙醇混合均匀，4℃下静置12h，得到纯化枸杞多糖。多糖的回收率为86.4%，蛋白质的残留率为13.7%；
（4）将步骤（2）中得到的上相4℃下静置过夜以沉淀蛋白质，离心取上层清液，然后与0.11M的氢氧化钠混合（质量比为1：9），升温至70℃分相4h，将下层相分出以回收EOPOEO，EOPOEO的回收率为96.5%。
实施例8
（1）将新型温敏嵌段共聚物聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷（EOPOEO）与磷酸二氢钠混合，制备EOPOEO-磷酸二氢钠双水相体系。双水相体系中磷酸二氢钠的质量分数为24%，EOPOEO质量分数为20%；
（2）将枸杞粗多糖溶液加入步骤（1）所述的EOPOEO-磷酸二氢钠双水相体系中，振荡混合，使体系中枸杞多糖的浓度为5mg/g，然后于35℃条件下静置分相12h，将上下层相分离；
（3）将步骤（2）得到的下相装入透析袋（8000-14000Da)中，于蒸馏水中透析以除去盐及其它小分子杂质。后将所得的透析产物与5倍体积的95%乙醇混合均匀，4℃下静置12h，得到纯化枸杞多糖。多糖的回收率为96.3%，蛋白质的残留率为5.6%；
（4）将步骤（2）中得到的上相4℃下静置过夜以沉淀蛋白质，离心取上层清液，然后与0.11M的氢氧化钠混合（质量比为1:9），升温至70℃分相4h，将下层相分出以回收EOPOEO，EOPOEO的回收率为98.5%。
实施例9
（1）将新型温敏嵌段共聚物聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷（EOPOEO）与硫酸铵混合，制备EOPOEO-硫酸铵双水相体系。双水相体系中硫酸铵的质量分数为12%，EOPOEO质量分数为20%；
（2）将枸杞粗多糖溶液加入步骤（1）所述的EOPOEO-硫酸铵双水相体系中，振荡混合，使体系中枸杞多糖的浓度为6mg/g，然后于15℃条件下静置分相12h，将上下层相分离；
（3）将步骤（2）得到的下相装入透析袋（8000-14000Da)中，于蒸馏水中透析以除去盐及其它小分子杂质。后将所得的透析产物与5倍体积的95%乙醇混合均匀，4℃下静置12h，得到纯化枸杞多糖。多糖的回收率为79.5%，蛋白质的残留率为39.3%；
（4）将步骤（2）中得到的上相4℃下静置过夜以沉淀蛋白质，离心取上层清液，然后与0.11M的氢氧化钠混合（质量比为1:9），升温至70℃分相4h，将下层相分出以回收EOPOEO，EOPOEO的回收率为94.5％。
实施例10
（1）将新型温敏嵌段共聚物聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷（EOPOEO）与硫酸铵混合，制备EOPOEO-硫酸铵双水相体系。双水相体系中硫酸铵的质量分数为20%，EOPOEO质量分数为20%；
（2）将枸杞粗多糖溶液加入步骤（1）所述的EOPOEO-硫酸铵双水相体系中，振荡混合，使体系中枸杞多糖的浓度为6mg/g，然后于15℃条件下静置分相12h，将上下层相分离；
（3）将步骤（2）得到的下相装入透析袋（8000-14000Da)中，于蒸馏水中透析以除去盐及其它小分子杂质。后将所得的透析产物与5倍体积的95%乙醇混合均匀，4℃下静置12h，得到纯化枸杞多糖。多糖的回收率为90.3%，蛋白质的残留率为29.0%；
（4）将步骤（2）中得到的上相4℃下静置过夜以沉淀蛋白质，离心取上层清液，然后与0.11M的氢氧化钠混合（质量比为1:9），升温至70℃分相4h，将下层相分出以回收EOPOEO，EOPOEO的回收率为94.5％。
实施例11
（1）将新型温敏嵌段共聚物聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷（EOPOEO）与硫酸铵混合，制备EOPOEO-硫酸铵双水相体系。双水相体系中硫酸铵的质量分数为28%，EOPOEO质量分数为20%；
（2）将枸杞粗多糖溶液加入步骤（1）所述的EOPOEO-硫酸铵双水相体系中，振荡混合，使体系中枸杞多糖的浓度为6mg/g，然后于15℃条件下静置分相12h，将上下层相分离；
（3）将步骤（2）得到的下相装入透析袋（8000-14000Da)中，于蒸馏水中透析以除去盐及其它小分子杂质。后将所得的透析产物与5倍体积的95%乙醇混合均匀，4℃下静置12h，得到纯化枸杞多糖。多糖的回收率为77.9%，蛋白质的残留率为4.9%；
（4）将步骤（2）中得到的上相4℃下静置过夜以沉淀蛋白质，离心取上层清液，然后与0.11M的氢氧化钠混合（质量比为1:9），升温至70℃分相4h，将下层相分出以回收EOPOEO，EOPOEO的回收率为94.5％。
实施例12
（1）将新型温敏嵌段共聚物聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷（EOPOEO）与柠檬酸钠混合，制备EOPOEO-柠檬酸钠双水相体系。双水相体系中柠檬酸钠的质量分数为20%，EOPOEO质量分数为20%；
（2）将枸杞粗多糖溶液加入步骤（1）所述的EOPOEO-柠檬酸钠双水相体系中，振荡混合，使体系中枸杞多糖的浓度为6mg/g，然后于15℃条件下静置分相12h，将上下层相分离；
（3）将步骤（2）得到的下相装入透析袋（8000-14000Da)中，于蒸馏水中透析以除去盐及其它小分子杂质。后将所得的透析产物与5倍体积的95%乙醇混合均匀，4℃下静置12h，得到纯化枸杞多糖。多糖的回收率为83.0%，蛋白质的残留率为51.04%；
（4）将步骤（2）中得到的上相4℃下静置过夜以沉淀蛋白质，离心取上层清液，然后与0.11M的氢氧化钠混合（质量比为1:9），升温至70℃分相4h，将下层相分出以回收EOPOEO，EOPOEO的回收率为94.5％。
实施例13
（1）将新型温敏嵌段共聚物聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷（EOPOEO）与磷酸氢二钾混合，制备EOPOEO-磷酸氢二钾双水相体系。双水相体系中磷酸氢二钾的质量分数为20%，EOPOEO质量分数为20%；
（2）将枸杞粗多糖溶液加入步骤（1）所述的EOPOEO-磷酸氢二钾双水相体系中，振荡混合，使体系中枸杞多糖的浓度为6mg/g，然后于15℃条件下静置分相12h，将上下层相分离；
（3）将步骤（2）得到的下相装入透析袋（8000-14000Da)中，于蒸馏水中透析以除去盐及其它小分子杂质。后将所得的透析产物与5倍体积的95%乙醇混合均匀，4℃下静置12h，得到纯化枸杞多糖。多糖的回收率为88.1%，蛋白质的残留率为68.8%；
（4）将步骤（2）中得到的上相4℃下静置过夜以沉淀蛋白质，离心取上层清液，然后与0.11M的氢氧化钠混合（质量比为1:9），升温至70℃分相4h，将下层相分出以回收EOPOEO，EOPOEO的回收率为94.5％。
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种枸杞多糖的分离纯化方法，其特征在于，按照下述步骤进行：
(1)将温敏嵌段共聚物聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷EOPOEO与无机盐混合，制备EOPOEO-盐双水相体系；
(2)将枸杞粗多糖溶液加入步骤(1)所得的双水相体系中，振荡得混合体系，然后静置分相，将上下相分离；
(3)将步骤(2)得到的下相装入8000-14000Da的透析袋中，于蒸馏水中透析24h以除去盐及其它小分子杂质；所得的透析液减压浓缩，再与95％的乙醇混合均匀，4℃下静置12h，得到纯化枸杞多糖；
(4)将步骤(2)中得到的上相于4℃下静置过夜以沉淀蛋白质，离心取上层清液，然后与0.11M的氢氧化钠混合，所述0.11M的氢氧化钠与上层清液的质量比为1:10-10:1；升温至70℃分相4h，将下层相分出以回收EOPOEO。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述无机盐为磷酸二氢钠，硫酸铵，磷酸氢二钾。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，双水相体系中无机盐的质量分数为12％-28％，温敏嵌段共聚物聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷EOPOEO质量分数为12％-28％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述混合体系中枸杞多糖的浓度为4-8mg/g。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述静置分相的温度为5-35℃，时间为12h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述乙醇的用量为透析液浓缩后浓缩液体积的5倍。
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