CN105017439A

CN105017439A - 一种基于浊点萃取的枸杞多糖除蛋白方法

Info

Publication number: CN105017439A
Application number: CN201510450388.XA
Authority: CN
Inventors: 王赟; 胡晓玮; 韩娟; 唐旭; 倪良; 陈桐; 王蕾
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2015-07-29
Filing date: 2015-07-29
Publication date: 2015-11-04

Abstract

本发明公开了一种基于浊点萃取的枸杞多糖除蛋白方法，涉及生物工程技术领域。该方法基本步骤如下：向中加入配制温敏嵌段共聚物聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷（EOPOEO）溶液，并将其与枸杞粗多糖水溶液混合，该体系在温度诱导下发生液液相分离。在聚合物相的作用下，枸杞多糖中的杂质蛋白质将被成功去除。相分离后，体系上相与乙醇混合，沉淀得到多糖成品。同时，将温敏聚合物富集的下相降温以沉淀大部分蛋白质，然后通过调节pＨ值、外加电解质以及加热等多步骤的综合操作形成二次浊点萃取体系，成功地对下相中的温敏聚合物进行了回收再利用。是一种工艺流程更为简单、成本低廉、绿色环保的枸杞纯多糖的分离纯化方法。

Description

一种基于浊点萃取的枸杞多糖除蛋白方法

技术领域

本发明涉及生物大分子分离纯化技术领域，特别涉及一种基于浊点萃取的枸杞多糖除蛋白方法。

背景技术

枸杞作为一种传统名贵中药材，具有良好的保健以及医药价值。作为枸杞中的一种主要活性成分，枸杞多糖更是以其特殊的作用而备受关注。作为分子量在80~120 kDa之间的一种大分子物质，枸杞多糖在增强免疫功能、护肝抗衰老、降血糖血脂、抗肿瘤、对放疗的增敏、化疗的增效减毒方面都显示了良好的效果。综上所述，枸杞多糖以其在食品医药上的应用前景，展现出广阔的商业价值。对于多糖的提取，现行工艺一般采用水提醇沉法，所得枸杞粗多糖含有大量的蛋白质杂质。为了进一步提高多糖纯度，除蛋白操作就势在必行。传统的多糖除蛋白方法有：①Sevage法；②三氯乙酸法；③鞣酸法。这些传统的除蛋白法大多使用有机溶剂，且工艺繁琐能耗巨大，已不符合当前绿色环保的发展要求。同时，上述除蛋白方法也极易造成多糖活性的破坏以及有机溶剂残留。

浊点萃取体系（Cloud point extraction system, CPES）是一种近年来兴起的环保液液萃取技术，它以非离子表面活性剂在水中的溶解性和浊点现象为基础，通过改变温度、溶液pH、表面活性剂浓度等实验条件引发相的分离,从而达到分离亲疏水性物质的目的。相较于传统的有机溶剂萃取，浊点萃取在富集倍数以及萃取效率上得到了大幅度的提高。同时，避免了挥发性有机溶剂的使用，这无疑大大降低了毒性并简化了整个工艺流程。更重要的是，由于浊点萃取良好的生物相容性，该方法对天然产物生物活性的副作用被降到了最低。总而言之，作为一种新型、绿色、高效的分离技术，浊点萃取具有安全无毒，流程简便，生物相容性好，并可与传统生产流程有效结合等优势，具有良好的应用前景。

本方法借助EOPOEO构建浊点萃取体系对枸杞粗多糖进行纯化，借助多糖与蛋白质等杂质在浊点体系两相间分配的不同，使得枸杞多糖与蛋白质等杂质的有效分离。并在相分离后，借助醇沉法成功回收了枸杞多糖。更为重要的是，相较于现有的浊点萃取体系，本方法中所采用新型温敏共聚物聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷（EOPOEO），其价格更低且几乎无毒，同时，还能够被有效回收，这进一步降低了生产成本，拓展了本方法在工业应用中的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于克服目前枸杞多糖纯化工艺流程长、物耗能耗高、污染大的缺陷，提供一种工艺流程更为简单、成本低廉、绿色环保的枸杞纯多糖的分离纯化方法。

本发明的技术方案概述如下：一种基于浊点萃取的枸杞多糖除蛋白方法，按照下述步骤进行：

（1）将新型温敏嵌段共聚物聚环氧乙烷聚环氧丙烷聚环氧乙烷（EOPOEO）与蒸馏水混合，制备EOPOEO水溶液；

（2）向步骤（1）所得的EOPOEO水溶液中加入枸杞粗多糖溶液，得混合体系，使用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液调节体系pH值为4-8，振荡混合，分相静置，形成双水相体系，分离得到上相和下相；

（3）将步骤（2）分离所得的上相减压浓缩，得浓缩液，再将浓缩液与95%的乙醇混合均匀，静置，得到纯化枸杞多糖；

（4）将步骤（2）分离所得的下相静置以沉淀蛋白质，离心取上层清液，然后用PBS溶液调节上层清液pH值到6以上，同时向上清液中加入柠檬酸钠，然后升温后分相，将下层相分出以回收EOPOEO。

步骤（1）中，所述EOPOEO水溶液中EOPOEO的质量百分数为 4%-12%。

步骤（2）中，所述枸杞粗多糖溶液的浓度为20g/L；混合体系中枸杞粗多糖的浓度为 2-6 mg/ml。

步骤（2）中，所述分相静置的温度为60-80℃，时间为1-12h。

步骤（3）中，所述乙醇的用量为浓缩液体积的5倍；所述静置的条件为：4℃下静置12h。

步骤（4）中，所述PBS溶液的pH=8；所述上清液中柠檬酸钠的浓度为100mmol/L。

步骤（4）中，所述下相静置温度为4℃，所述分相的温度为65-70℃,时间为5h。

用磷酸盐缓冲溶液调节pH值使蛋白质带负电，柠檬酸根离子更倾向于富集在下相，在两相间产生相间电位差，对带负电的蛋白质产生排斥作用，从而使蛋白质与聚合物分离，聚合物在下相，蛋白质在上相水溶液体系中。

本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：

1. 在EOPOEO浊点体系中，加入枸杞粗多糖，在体系的作用下，其中的蛋白质等小分子杂质分配到体系下相，而枸杞多糖分配在上相中。回收浊点体系中上相，醇沉得到纯化的枸杞多糖。相较于传统工艺，本方法工艺流程更短，机溶剂用量更少，物耗和能耗更低。

2. EOPOEO浊点体系应用于除蛋白过程，其条件温和生物相容性高，有机溶剂残留少，绿色环保。

3. 本方法采用的新型温敏嵌段共聚物EOPOEO，与传统温敏性聚合物相比，具有基本无毒，价格低廉，来源广泛的优点，适宜大规模运用。

4. 本方法浊点体系中所用温敏嵌段共聚物EOPOEO经过降温、加电解质、加热等综合步骤后，得到了有效的回收并被成功地再利用。与传统浊点体系相比，本方法解决了成相聚合物难以分离回收的难题，进一步减少了物耗，降低了生产成本。

5. 本发明直接将EOPOEO水溶液通过升高温度的方式进行分相，无需加入盐，不需进行透析过程。

具体实施方式

下面的实施实例是为了使本领域的技术人员理解本发明，但不以任何方式限定本发明。

下面结合具体实例对本发明作进一步的说明。

实施例1

（1）将新型温敏嵌段共聚物聚环氧乙烷聚环氧丙烷聚环氧乙烷（EOPOEO）与蒸馏水混合，制备8%的EOPOEO水溶液。

（2）向步骤（1）所得的溶液中加入枸杞粗多糖溶液，使枸杞多糖浓度达到4mg/ml。调节体系pH值为5，振荡混合，在70℃条件下分相静置，形成双水相体系， 12h后，分离上下相。

（3）将步骤（2）得到的上相减压浓缩，再与5倍体积的95%乙醇混合均匀，4℃下静置12h，得到纯化枸杞多糖。多糖的回收率为81%，蛋白质的去除率为87%

（4）将步骤（2）中得到的下相于4℃下静置过夜以沉淀蛋白质，离心取上层清液，然后与9倍体积的PBS（pH=8）混合以调节pH值。同时加入柠檬酸钠使其浓度达到100mmol/L后, 升温至70℃分相5h，将下层相分出以回收EOPOEO。EOPOEO的回收率为95％, 蛋白质残留率为0.56%。

实施例2

（1）将新型温敏嵌段共聚物聚环氧乙烷聚环氧丙烷聚环氧乙烷（EOPOEO）与蒸馏水混合，制备12%的EOPOEO水溶液。

（3）将步骤（2）得到的上相减压浓缩，再与5倍体积的95%乙醇混合均匀，4℃下静置12h，得到纯化枸杞多糖。多糖的回收率为71%，蛋白质的去除率为64%

实施例3

（1）将新型温敏嵌段共聚物聚环氧乙烷聚环氧丙烷聚环氧乙烷（EOPOEO）与蒸馏水混合，制备4%的EOPOEO水溶液。

（3）将步骤（2）得到的上相减压浓缩，再与5倍体积的95%乙醇混合均匀，4℃下静置12h，得到纯化枸杞多糖。多糖的回收率为65%，蛋白质的去除率为72%

实施例４

（2）向步骤（1）所得的溶液中加入枸杞粗多糖溶液，使枸杞多糖浓度达到2mg/ml。调节体系pH值为5，振荡混合，在70℃条件下分相静置，形成双水相体系， 12h后，分离上下相。

（3）将步骤（2）得到的上相减压浓缩，再与5倍体积的95%乙醇混合均匀，4℃下静置12h，得到纯化枸杞多糖。多糖的回收率为82%，蛋白质的去除率为89%

实施例５

（2）向步骤（1）所得的溶液中加入枸杞粗多糖溶液，使枸杞多糖浓度达到6mg/ml。调节体系pH值为5，振荡混合，在70℃条件下分相静置，形成双水相体系， 12h后，分离上下相。

（3）将步骤（2）得到的上相减压浓缩，再与5倍体积的95%乙醇混合均匀，4℃下静置12h，得到纯化枸杞多糖。多糖的回收率为80%，蛋白质的去除率为52%

实施例６

（2）向步骤（1）所得的溶液中加入枸杞粗多糖溶液，使枸杞多糖浓度达到4mg/ml。调节体系pH值为5，振荡混合，在70℃条件下分相静置，形成双水相体系， 1h后，分离上下相。

（3）将步骤（2）得到的上相减压浓缩，再与5倍体积的95%乙醇混合均匀，4℃下静置12h，得到纯化枸杞多糖。多糖的回收率为56%，蛋白质的去除率为39%

实施例7

（2）向步骤（1）所得的溶液中加入枸杞粗多糖溶液，使枸杞多糖浓度达到4mg/ml。调节体系pH值为4，振荡混合，在70℃条件下分相静置，形成双水相体系， 12h后，分离上下相。

（3）将步骤（2）得到的上相减压浓缩，再与5倍体积的95%乙醇混合均匀，4℃下静置12h，得到纯化枸杞多糖。多糖的回收率为79%，蛋白质的去除率为81%

实施例8

（2）向步骤（1）所得的溶液中加入枸杞粗多糖溶液，使枸杞多糖浓度达到4mg/ml。调节体系pH值为8，振荡混合，在70℃条件下分相静置，形成双水相体系， 12h后，分离上下相。

（3）将步骤（2）得到的上相减压浓缩，再与5倍体积的95%乙醇混合均匀，4℃下静置12h，得到纯化枸杞多糖。多糖的回收率为75%，蛋白质的去除率为58%

实施例9

（2）向步骤（1）所得的溶液中加入枸杞粗多糖溶液，使枸杞多糖浓度达到4mg/ml。调节体系pH值为5，振荡混合，在60℃条件下分相静置，形成双水相体系， 12h后，分离上下相。

（3）将步骤（2）得到的上相减压浓缩，再与5倍体积的95%乙醇混合均匀，4℃下静置12h，得到纯化枸杞多糖。多糖的回收率为78%，蛋白质的去除率为75%

实施例10

（2）向步骤（1）所得的溶液中加入枸杞粗多糖溶液，使枸杞多糖浓度达到4mg/ml。调节体系pH值为5，振荡混合，在80℃条件下分相静置，形成双水相体系， 12h后，分离上下相。

（3）将步骤（2）得到的上相减压浓缩，再与5倍体积的95%乙醇混合均匀，4℃下静置12h，得到纯化枸杞多糖。多糖的回收率为64%，蛋白质的去除率为72%

实施例11

（4）将步骤（2）中得到的下相于4℃下静置过夜以沉淀蛋白质，离心取上层清液，然后与9倍体积的PBS（pH=8）混合以调节pH值。同时加入柠檬酸钠使其浓度达到100mmol/L后, 升温至65℃分相5h，将下层相分出以回收EOPOEO。EOPOEO的回收率为91％, 蛋白质残留率为0.87%。

实施例12

（4）将步骤（2）中得到的下相于4℃下静置过夜以沉淀蛋白质，离心取上层清液，然后与9倍体积的PBS（pH=8）混合以调节pH值。同时加入柠檬酸钠使其浓度达到100mmol/L后, 升温至75℃分相5h，将下层相分出以回收EOPOEO。EOPOEO的回收率为93％, 蛋白质残留率为0.74%。

所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种基于浊点萃取的枸杞多糖除蛋白方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）将新型温敏嵌段共聚物聚环氧乙烷聚环氧丙烷聚环氧乙烷EOPOEO与蒸馏水混合，制备EOPOEO水溶液；

2.如权利要求1所述的一种基于浊点萃取的枸杞多糖除蛋白方法，其特征在于：步骤（1）中，所述EOPOEO水溶液中EOPOEO的质量百分数为 4%-12%。

3.如权利要求1所述的一种基于浊点萃取的枸杞多糖除蛋白方法，其特征在于：步骤（2）中，所述枸杞粗多糖溶液的浓度为20g/L；混合体系中枸杞粗多糖的浓度为 2-6 mg/ml。

4.如权利要求1所述的一种基于浊点萃取的枸杞多糖除蛋白方法，其特征在于：步骤（2）中，所述分相静置的温度为60-80℃，时间为1-12h。

5.如权利要求1所述的一种基于浊点萃取的枸杞多糖除蛋白方法，其特征在于：步骤（3）中，所述乙醇的用量为浓缩液体积的5倍；所述静置的条件为：4℃下静置12h。

6.如权利要求1所述的一种基于浊点萃取的枸杞多糖除蛋白方法，其特征在于：步骤（4）中，所述PBS溶液的pH=8；所述上清液中柠檬酸钠的浓度为100mmol/L。

7.如权利要求1所述的一种基于浊点萃取的枸杞多糖除蛋白方法，其特征在于：步骤（4）中，所述下相静置温度为4℃，所述分相的温度为65-70℃，时间为5h。