CN108503719B - 一种提取铁皮石斛多糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提取铁皮石斛多糖的方法，具体包括以下步骤：将铁皮石斛粉按1g：30～50mL的料液比与深度共熔溶剂(氢键受体：氢键供体＝3：1～18，mol/mol)混合均匀，再按4～8mg/mL的比例加入纤维素酶和果胶酶中的至少一种，在30～60℃下提取90～120min，将所得提取液分离纯化后得到铁皮石斛多糖；与传统的酶法水提取相比，本发明使用的酶辅助深度共熔溶剂提取具有低挥发性、高稳定性和反应体系温和的特点，能够减少提取液杂质、减少溶剂损耗、降低纯化负担，使多糖提取率提高10％以上，多糖含量增加10％以上。

Description

一种提取铁皮石斛多糖的方法
技术领域
本发明属于植物提取技术领域，具体涉及一种提取铁皮石斛多糖的方法。
背景技术
根据《神农本草经》和《中华人民共和国药典》记载铁皮石斛为多年附生草本植物，具有延年益寿，益胃生津，滋阴清热，用于口干烦渴，食少干呕，病后虚热不退，骨蒸劳热，目暗不明，筋骨痿软。在《中国植物红皮书》和《中国濒危珍稀植物》中列为濒危物种，加上市场需求量大和不合理开采野生铁皮石斛，导致珍贵稀缺、生长条件苛刻的铁皮石斛野生资源日渐枯竭，现被列为国家二级保护植物。铁皮石斛成分主要包含多糖、生物碱、氨基酸、微量元素、菲类化合物等，其主要成分多糖具有很强的生物活性如抗肿瘤、抗氧化、增强免疫力、降低血糖血脂和缓解疲劳等，加上多糖的含量作为衡量铁皮石斛药效的标准之一，因而从铁皮石斛中提取多糖成分进行开发成为当今一个研究热点。
传统提取多糖的方法包括热水提取、酸法提取、碱法提取、酶辅助提取、超声波辅助提取等，其中，酶辅助提取法提取效果更佳，条件更温和，有利于实现工厂化生产。然而，普遍使用的热水提取法，提取温度较高，耗时长，水溶性杂质多，分离纯化困难。唐政等在“混合酶提法提取铁皮石斛中石斛多糖的优化工艺研究”中提供了一种纤维素酶和果胶酶混合提取石斛多糖的方法，成功地在较低温度(50℃左右)下达到40％以上的多糖提取率。但是，在水溶剂中需要加缓冲剂调节pH以保证复合酶的活性，酶的活性随pH变化的波动性很大，使得提取率不够稳定；pH值在水溶剂中的变化还会导致多糖的水解损失。
深度共熔溶剂(Deep Eutectic Solvents)具有低毒性、熔点低、比例可调节、易于生物降解、化学性质稳定可回收利用等优点，在分离天然产物等领域迅速成为热点，如中国专利申请CN201711009235.7提供了一种低共熔溶剂/盐双水相萃取分离锁阳多糖的方法，但其使用的是超声提取法，多糖的提取率依然不高；且其指出酶辅助方法存在得率较低等缺陷，并未进行相关研究。
由此可见，目前还缺乏将深度共熔溶剂和酶提取法相结合以进一步高效提取多糖的技术。
发明内容
为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种提取铁皮石斛多糖的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种提取铁皮石斛多糖的方法，包括以下步骤：
将铁皮石斛粉按1g：30～50mL的料液比与深度共熔溶剂混合均匀，再按4～8mg/mL的比例加入酶，在30～60℃下提取90～120min获得提取液，将所得提取液分离纯化后得到铁皮石斛多糖；
所述深度共熔溶剂中氢键受体和氢键供体的摩尔比为3：1～18；
所述酶是指纤维素酶和果胶酶中的至少一种。
优选的，所述酶为等量混合的纤维素酶和果胶酶。
优选的，所述氢键受体为氯化胆碱、氯化锌、乳酸中的至少一种，所述氢键供体为甘油、乙二醇、山梨醇、三甘醇、1，4-丁二醇、木糖醇、乙酰丙酸、对甲苯磺酸、酒石酸、草酸、丙二酸、苹果酸、柠檬酸、乳酸、尿素、乙酰胺、乙酰钠中的至少一种。
优选的，所述分离纯化是指将所得提取液固液分离后，取上清液用弱极性大孔树脂纯化得到粗糖液；随后依次进行透析、真空浓缩、醇沉、分级分离、真空浓缩、真空冷冻干燥后得到铁皮石斛多糖。
更优选的，所述透析具体为将粗糖液在流水中透析24～36h后，再在蒸馏水中透析12～24h，每隔4～8h换一次蒸馏水。
更优选的，所述真空浓缩具体为将粗糖液在45～55℃下真空浓缩到原体积的1/10～1/3。
更优选的，所述醇沉具体为将粗糖液加入相当于真空浓缩后得到的浓缩液1～4倍体积的乙醇溶液进行沉淀。
更优选的，所述分级分离具体为将乙醇沉淀后的多糖重新溶解，进一步用分子量范围10000～2000000Da的葡聚糖凝胶进行分级分离得到多糖液。
更优选的，所述真空冷冻干燥具体为在-70～-78℃下真空冷冻干燥12～24h。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1.与传统的酶法水提取相比，复合酶辅助深度共熔溶剂提取具有低挥发性、高稳定性和反应体系温和的特点，还能够减少提取液杂质、减少溶剂损耗、降低纯化负担。
2.本发明采用酶浓度为4～8mg/mL，相比现有技术能大量节约酶用量，而且酶在深度共熔溶剂中可以忽略pH值的影响，使得本发明在实际应用中能够更稳定地保证高提取率。
3.各种不同组成的深度共熔溶剂提取得到的多糖其产率和活性有所不同，但相比水溶剂，酶在深度共熔溶剂中催化效果总体上更理想稳定，在非水系催化中减少了多糖的损失，在本发明优选的提取条件可以得到较高的多糖产率，达42％以上。经过检测所提取的铁皮石斛多糖粉中多糖纯度为98％以上，非多糖成分比较少，纯度较高。和传统的水提取方法相比，提取率提高了10％以上，铁皮石斛多糖中的多糖含量增加10％以上。
4.深度共熔溶剂多糖提取液经弱极性大孔树脂初步纯化得到的洗脱曲线判断为单一峰，多糖组分比较均匀，多糖回收率为96％以上，损失量较少。脱色率和脱蛋白率分别为95％和98％以上。
5.本发明的提取方法科学合理，操作简单，流程简单，反应条件温和，效率高，提取率稳定，易于大规模化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)将铁皮石斛粉按1g：30mL的料液比与深度共熔溶剂(氯化胆碱：甘油＝1：2，mol/mol)混合均匀，再按6mg/mL的比例加入复合酶(纤维素酶：果胶酶＝1:1，mg/mg)，在50℃下提取90min；
(2)得到的提取液进行固液分离，取上清液用大孔树脂AB-8纯化得到粗糖液；
(3)然后将粗糖液用透析袋(3500Da)在流水中透析24h，再在蒸馏水中透析24h，每隔8h换一次蒸馏水，然后在50℃下将其真空浓缩到原体积的1/4，加入相当于浓缩液4倍体积的95％乙醇溶液将多糖沉淀，具体为在沉淀过程一边缓慢加入一边搅拌，先加入与浓缩液等量的乙醇溶液沉淀多糖离心分离；取上清液继续添加与上清液等量的乙醇溶液，沉淀离心分离，再取上清液重复同样步骤，直到没有多糖沉淀分离出来为止。
(4)重新溶解步骤(3)得到的多糖，进一步用葡聚糖凝胶SephadexG75，SephadexG200先后进行分级分离得到多糖液，将其在50℃下真空浓缩到原体积的1/4，最后在-75℃下真空冷冻干燥12h得到絮状白色粉末状多糖。
经测定多糖的提取率为44％，经AB-8大孔树脂分离纯化多糖回收率为96％，脱色率和蛋白去除率分别为96％，98％，最终纯化多糖的纯度为98％。
多糖纯度的测定方法如下：
准确称取干燥恒重的纯化多糖2mg,60℃水浴条件下充分溶解到2mL水中，制备成多糖样品，按照苯酚-浓硫酸法(中国药典2015)测定多糖含量，计算纯度的公式如下所示：
Figure BDA0001588042970000041
实施例2
(1)将铁皮石斛粉按1g：50mL的料液比与深度共熔溶剂(氯化胆碱：甘油＝1：6，mol/mol)混合均匀，再按8mg/mL的比例加入复合酶(纤维素酶：果胶酶＝1:1，mg/mg)，在55℃下提取100min；
步骤(2)～(4)参考实施例1。
经测定多糖的提取率为45％，经AB-8大孔树脂分离纯化多糖回收率为96％，脱色率和蛋白去除率分别为98％，98％，最终纯化多糖的纯度为98％。
实施例3
(1)将铁皮石斛粉按1g：30mL的料液比与深度共熔溶剂(氯化胆碱：甘油＝1：2，mol/mol)混合均匀，再按6mg/mL的比例加入复合酶(纤维素酶：果胶酶＝1:1，mg/mg)，在30℃下提取120min；
步骤(2)～(4)参考实施例1。
经测定多糖的提取率为45％，经AB-8大孔树脂分离纯化多糖回收率为97％，脱色率和蛋白去除率分别为97％，98％，最终纯化多糖的纯度为98％。
实施例4
(1)将铁皮石斛粉按1g：30mL的料液比与深度共熔溶剂(氯化胆碱：乙酰丙酸＝1：2，mol/mol)混合均匀，再按6mg/mL的比例加入复合酶(纤维素酶：果胶酶＝1:1，mg/mg)，在50℃下提取90min；
步骤(2)～(4)参考实施例1。
经测定多糖的提取率为44％，经AB-8大孔树脂分离纯化多糖回收率为97％，脱色率和蛋白去除率分别为97％，98％，最终纯化多糖的纯度为97％。
实施例5
(1)将铁皮石斛粉按1g：30mL的料液比与深度共熔溶剂(乳酸：乙酸钠＝3：1，mol/mol)混合均匀，再按6mg/mL的比例加入复合酶(纤维素酶：果胶酶＝1:1，mg/mg)，在50℃下提取90min；
步骤(2)～(4)参考实施例1。
经测定多糖的提取率为43％，经AB-8大孔树脂分离纯化多糖回收率为96％，脱色率和蛋白去除率分别为98％，98％，最终纯化多糖的纯度为98％。
实施例6
(1)将铁皮石斛粉按1g：30mL的料液比与深度共熔溶剂(氯化胆碱：苹果酸＝1：1，mol/mol)混合均匀，再按6mg/mL的比例加入复合酶(纤维素酶：果胶酶＝1:1，mg/mg)，在50℃下提取90min；
步骤(2)～(4)参考实施例1。
经测定多糖的提取率为42％，经AB-8大孔树脂分离纯化多糖回收率为96％，脱色率和蛋白去除率分别为98％，98％，最终纯化多糖的纯度为98％。
实施例7
(1)将铁皮石斛粉按1g：30mL的料液比与深度共熔溶剂(氯化胆碱：柠檬酸＝1：1，mol/mol)混合均匀，再按6mg/mL的比例加入复合酶(纤维素酶：果胶酶＝1:1，mg/mg)，在50℃下提取90min；
步骤(2)～(4)参考实施例1。
经测定多糖的提取率为43％，经AB-8大孔树脂分离纯化多糖回收率为96％，脱色率和蛋白去除率分别为98％，98％，最终纯化多糖的纯度为98％。
实施例8
(1)将铁皮石斛粉按1g：30mL的料液比与深度共熔溶剂(氯化胆碱：乳酸＝1：2，mol/mol)混合均匀，再按6mg/mL的比例加入复合酶(纤维素酶：果胶酶＝1:1，mg/mg)，在50℃下提取90min；
步骤(2)～(4)参考实施例1。
经测定多糖的提取率为43％，经AB-8大孔树脂分离纯化多糖回收率为96％，脱色率和蛋白去除率分别为98％，98％，最终纯化多糖的纯度为98％。
实施例9
(1)将铁皮石斛粉按1g：30mL的料液比与深度共熔溶剂(氯化胆碱：酒石酸＝2：1，mol/mol)混合均匀，再按6mg/mL的比例加入复合酶(纤维素酶：果胶酶＝1:1，mg/mg)，在50℃下提取90min；
步骤(2)～(4)参考实施例1。
经测定多糖的提取率为42％，经AB-8大孔树脂分离纯化多糖回收率为96％，脱色率和蛋白去除率分别为98％，98％，最终纯化多糖的纯度为98％。
对比例1
(1)将铁皮石斛粉按1g：30mL的料液比与水混合均匀，再按6mg/mL的比例加入复合酶(纤维素酶：果胶酶＝1:1，mg/mg)，在90℃下提取120min；
步骤(2)～(4)参考实施例1。
经测定多糖的提取率为28％，经AB-8大孔树脂分离纯化多糖回收率为88％，脱色率和蛋白去除率分别为79％，92％，最终纯化多糖纯度为87％。可以看到其提取率和最终多糖纯度均明显低于实施例1～9，证明深度共熔溶剂能够有效改善复合酶的催化效果，以及能够有效减少杂质比例。
下表对上述对比例1和实施例1～9所采用的各参数条件及取得的技术效果进行了总结。
表1对比例1和实施例1～9的实验参数条件及技术效果
Figure BDA0001588042970000071
Figure BDA0001588042970000081
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种提取铁皮石斛多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将铁皮石斛粉按1 g：30~50 mL的料液比与深度共熔溶剂混合均匀，再按4~8 mg/mL的比例加入酶，在30~60℃下提取90~120 min获得提取液，将所得提取液分离纯化后得到铁皮石斛多糖；
所述深度共熔溶剂由氢键受体和氢键供体组成，所述氢键受体和氢键供体的摩尔比为3：1~18；
所述酶是指纤维素酶和果胶酶中的至少一种；
其中所述氢键受体为氯化胆碱、氯化锌中的至少一种，所述氢键供体为甘油、乙二醇、山梨醇、三甘醇、1，4-丁二醇、木糖醇、对甲苯磺酸、酒石酸、草酸、丙二酸、苹果酸、柠檬酸、乳酸、尿素中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的一种提取铁皮石斛多糖的方法，其特征在于，所述酶为等量混合的纤维素酶和果胶酶。
3.根据权利要求1所述的一种提取铁皮石斛多糖的方法，其特征在于，所述分离纯化是指将所得提取液固液分离后，取上清液用弱极性大孔树脂纯化得到粗糖液；随后依次进行透析、真空浓缩、醇沉、分级分离、真空浓缩、真空冷冻干燥后得到铁皮石斛多糖。
4. 根据权利要求3所述的一种提取铁皮石斛多糖的方法，其特征在于，所述透析具体为将粗糖液在流水中透析24~36 h后，再在蒸馏水中透析12~24 h，每隔4~8 h换一次蒸馏水。
5.根据权利要求3所述的一种提取铁皮石斛多糖的方法，其特征在于，所述真空浓缩具体为将粗糖液在45~55℃下真空浓缩到原体积的1/10~1/3。
6.根据权利要求3所述的一种提取铁皮石斛多糖的方法，其特征在于，所述醇沉具体为将粗糖液加入相当于真空浓缩后得到的浓缩液1~4倍体积的乙醇溶液进行沉淀。
7. 根据权利要求3所述的一种提取铁皮石斛多糖的方法，其特征在于，所述分级分离具体为将乙醇沉淀后的多糖重新溶解，进一步用分子量范围10000 ~2000000 Da的葡聚糖凝胶进行分级分离得到多糖液。
8. 根据权利要求3所述的一种提取铁皮石斛多糖的方法，其特征在于，所述真空冷冻干燥具体为在-70~-78℃下真空冷冻干燥12~24 h。
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