CN113354754A - 一种利用低共熔溶剂提取银耳多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用低共熔溶剂提取银耳多糖的方法。本发明的提取方法包括:将冻干银耳孢子发酵液与上述低共熔溶剂混合;然后将混合物水浴提取,经离心,得到银耳多糖浸提液;向银耳多糖浸提液中加入溶剂,经混匀、静置、离心,取沉淀物经洗涤、离心、冻干,得到银耳多糖。所述低共熔溶剂包括氢键供体、氢键受体及去离子水,所述氢键供体为甘油,所述氢键受体为氯化胆碱。本发明利用低共熔溶剂法提取银耳多糖,低共熔溶剂合成方法是氯化胆碱和甘油经过加热后,以氢键结合到一起形成低共熔溶剂,作为一种溶剂用于萃取银耳孢子发酵液中的银耳多糖,具有可操作性强,工艺简便,成本低的优点,同时原料易获取、可再生、可降解、可回收。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用低共熔溶剂提取银耳多糖的方法,属于生物工程技术领域。
背景技术
多糖是一种高分子的聚合物,由成千上万个单糖通过糖普键连接而成。多糖广泛分布于自然界,植物、动物、微生物体内均有存在。天然多糖可用于临床试验,如抗糖尿病、抗肿瘤、降血脂等病症的治疗或者作为抗炎、抗病毒的药物,多糖对于维持人体正常运行具有重要的作用。
银耳(Tremella fuciformis),又称“银耳菇”,它属于银耳目和银耳科,是一种可食用菌。银耳多糖是主要活性成分,主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和鼠李糖组成,具有抗氧化、抗肿瘤、抑制炎症等多种生理活性。发酵方法可以通过培养基组成和其他因素来丰富多糖的成分和分子量。发酵银耳多糖相比于传统子实体提取银耳多糖分子量更小,活性更强。银耳多糖无毒无害,具有很高的应用价值。
低共熔溶剂(DESs)通常是由氢键受体(通常是氯化胆碱)和氢键供体(通常是天然植物基有机离子,如氨基酸、有机酸、糖等)组成的共晶混合物。DESs的成分不仅能够通过氢键相互结合,而且能够提供或接受外部电子或质子以形成氢键。氢键受体通常采用季铵盐,如便宜可得、易降解、无毒的氯化胆碱,而氢键受体则可选择尿素、乙二醇、丙三醇、草酸、乳酸、葡萄糖、甘油等。在将两种化合物混合过程中由于阴离子和氢键供体之间形成的氢键引发电荷的离域,导致低共熔溶剂的熔点低于各组分化合物的熔点。低共熔溶剂相较于其他离子液体具有价格低廉,容易获取等优点。
目前,采用低共熔溶剂从银耳孢子发酵液中提取银耳多糖的研究尚未见报道。
发明内容
本发明解决的技术问题是:如何通过一种简单、高效、绿色环保的方法提取得到高纯度的银耳多糖。
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种利用低共熔溶剂提取银耳多糖的方法,包括以下步骤:
步骤1:以甘油为氢键供体,氯化胆碱为氢键受体,加入去离子水配制低共熔溶剂;
步骤2:将冻干银耳孢子发酵液与步骤1配制得到的低共熔溶剂混合,然后在80℃水浴中提取,经离心,得到银耳多糖浸提液;
步骤3:向银耳多糖浸提液中加入溶剂,经混匀、静置、离心,取沉淀物经洗涤、离心后,将沉淀加入蒸馏水中,水浴提取后采用透析袋透析,然后再次离心,收集上清液,将上清液冻干后获得银耳多糖。
优选地,其特征在于,所述步骤1中的氢键受体、氢键供体与去离子水的摩尔比为1:1~3:40~80。
优选地,所述步骤1中低共熔溶剂的配制方法为:将氢键受体、氢键供体与水混合,于80℃水浴下搅拌至澄清透明,放置一段时间后,溶液无晶体析出,得到低共熔溶剂。
优选地,所述步骤2中银耳孢子发酵液与低共熔溶剂的比例为1~5g:10~50mL。
优选地,所述步骤3中的溶剂为乙醇,所述乙醇的体积浓度为95%。
优选地,所述步骤3中银耳多糖浸提液与溶剂的体积比为1:4。
优选地,所述步骤3中蒸馏水的体积与步骤2中的冻干银耳孢子发酵液的质量之比为100mL:1g。
优选地,所述步骤3中水浴提取的条件为:温度50~70℃,时间1~3h。
优选地,所述步骤3中透析的条件为:透析袋孔径14000Da,时间3天。
优选地,所述步骤3中的上清液冻干之前先进行旋蒸浓缩,通过旋蒸浓缩将所述的低共熔溶剂和溶剂回收后循环利用。
本发明与现有技术相比,具有如下有益效果:
本发明首次提出了一种用低共熔溶剂从冻干银耳孢子发酵液中提取银耳多糖的方法,其中,低共熔溶剂包括氢键供体、氢键受体及去离子水,氢键供体为甘油,氢键受体为氯化胆碱,是一种绿色环保溶剂,本发明的提取银耳多糖的方法不仅操作简单、目标产物提取率高、产品纯度高,而且避免了在提取分离过程中使用一些有毒性溶剂,很大程度上降低了有毒溶剂所带来的环境污染。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂,兹以优选实施例,作详细说明如下。
以下实施例中,冻干银耳孢子发酵液的制备步骤如下:
(1)在超净工作台上使用洁净的接种环挑取一环粘稠的银耳芽孢菌(银耳芽孢菌购自广东省微生物菌种保藏中心GDMCC,拉丁文学名Tremella fuciformis,保藏编号GDMCC5.39),接种于液体种子培养基中,25℃,150r/min,振荡培养1天,获得银耳孢子种子液。种子液稀释20倍后,孢子光密度达到0.2,则种子液制备完成。
液体种子培养基(1L):葡萄糖15g、酵母膏2g、蛋白胨2g、MgSO4·7H2O 0.5g、KH2PO40.46g、K2HPO4 1g。
(2)将获得的种子液以2%的接种量接种于液体发酵培养基,25℃,250r/min,振荡培养培养3天,获得银耳孢子发酵液。
液体发酵培养基(1L):葡萄糖15g、酵母膏2g、蛋白胨2g、MgSO4·7H2O 0.5g、KH2PO40.46g、K2HPO4 1g
(3)发酵完成后,发酵液在10000r/min条件下离心15min获得上清液。将上清液进行冷冻干燥得到冻干银耳孢子发酵液。
以下实施例中,银耳多糖含量测定采用苯酚-硫酸法,步骤如下:
a、标准曲线的制作:准确称取标准葡萄糖(AR)20mg于500mL容量瓶中,加水溶解并定容至刻度,配置0.04mg/ml葡萄糖标液,分别吸取0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4ml,蒸馏水定容到0.4ml,然后加入5wt%苯酚0.4ml,浓硫酸(浓度98wt%)2ml,摇匀冷却,20min后490nm下测吸光度,蒸馏水做对照。以葡萄糖浓度(C)为横坐标,吸光度(A)为纵坐标,制作标准曲线。葡萄糖标准曲线A=1.1135C+0.0735,R2=0.9917,其中:A为吸光度值,C为葡萄糖浓度(mg/mL),R2为相关系数;
b、银耳多糖含量测定:将复融溶液透析(截留分子量为14000Da)后,取0.5mL稀释液加入0.5ml蒸馏水,再依次加入5wt%苯酚1ml,浓硫酸(浓度98wt%)5mL,摇匀冷却,20min后测定490nm的吸光度值A,根据标准曲线计算发酵液中多糖含量;
其中,银耳多糖提取率按照以下公式计算:
银耳多糖提取率(%)=100×C1/C2,
式中,C1为提取前1g冻干发酵液溶于100mL蒸馏水中的多糖含量,C2为提取后等体积发酵液中的银耳多糖含量。
以下实施例中,银耳蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝G250,步骤如下:
a、用牛血清白蛋白绘制标准曲线:准确称取100mg考马斯亮蓝G250,将其溶解于50mL体积浓度为95%的乙醇中,之后加入100mL体积浓度为85%的磷酸溶液,最后用蒸馏水定容在1000mL容量瓶中,得到考马斯亮蓝G-250溶液。将牛血清白蛋白用浓度为0.15mol·L-1的氯化钠溶液配制成0.1mg·mL-1的牛血清白蛋白标准溶液。取6支试管,分别加入牛血清白蛋白标准溶液0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml,用0.15mol·L-1氯化钠溶液补齐至1mL。分别加入考马斯亮蓝G250溶液1mL,充分混合,1h内使用紫外可见分光光度计在波长为595nm处,测定相应的吸光度值,并绘制牛血清白蛋白标准曲线。标准曲线方程为:A=7.8857+0.661,R2=0.9941,牛血清白蛋白的含量C(mg/mL)为横坐标,吸光度值A为纵坐标,R2为相关系数;
b、蛋白质含量测定,取银耳多糖溶液1mL,加入上述的考马斯亮蓝G-250溶液1mL,混匀,1h内用紫外可见分光光度计测定595nm处的吸光度值,利用牛血清白蛋白标准曲线,计算出多糖样品中蛋白质的含量;
其中,蛋白质清除率采用如下公式进行计算:
蛋白质清除率(%)=100×(C1-C2)/C1;
式中,C1为提取前1g冻干发酵液溶于100mL蒸馏水中的蛋白质含量,C2为提取后等体积发酵液中的蛋白质含量。
实施例1
一种利用低共熔溶剂提取银耳多糖的方法,包括以下步骤:
步骤1:将氢键受体甘油、氢键供体氯化胆碱与去离子水以1:1:40的质量比混合,于80℃水浴搅拌至澄清透明,放置一段时间后,溶液无晶体析出,得到低共熔溶剂;
步骤2:将冻干银耳孢子发酵液与步骤1配置的低共熔溶剂以1g:10mL的比例混合;然后将混合物在80℃水浴中提取,经离心,得到银耳多糖浸提液;
步骤3:向银耳多糖浸提液中加入体积浓度为95%的乙醇,银耳多糖浸提液与乙醇的体积比为1:4,经混匀、静置、离心,取沉淀物经洗涤、离心后,将沉淀加入100mL蒸馏水中,在60℃水浴下提取2h,采用14000Da孔径的透析袋透析三天后再次离心,上清液冻干获得银耳多糖;
步骤4:对步骤3制得的银耳多糖采用苯酚—硫酸法测定总多糖含量,测得银耳多糖提取率为56.88%。
步骤5:再对步骤3的银耳多糖采用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量,测得蛋白清除率为80.53%。
其中,步骤3中离心后得到的上清液,可先将其旋蒸浓缩后再进行冻干。通过旋蒸可将低共熔溶剂和乙醇溶剂回收后进行循环利用。
实施例2
一种利用低共熔溶剂提取银耳多糖的方法,包括以下步骤:
步骤1:将氢键受体甘油、氢键供体氯化胆碱与去离子水以1:2:80的质量比混合,于80℃水浴搅拌至澄清透明,放置一段时间后,溶液无晶体析出,得到低共熔溶剂;
步骤2:将冻干银耳孢子发酵液与步骤1配制的低共熔溶剂以1g:30mL的比例混合;然后将混合物在80℃水浴中提取,经离心,得到银耳多糖浸提液;
步骤3:向银耳多糖浸提液中加入体积浓度为95%的乙醇,银耳多糖浸提液与乙醇的体积比为1:4,经混匀、静置、离心,取沉淀物经洗涤、离心后,将沉淀加入100mL蒸馏水中,在60℃水浴下提取2h,采用14000Da孔径的透析袋透析三天后再次离心,上清液冻干获得银耳多糖;
步骤4:对步骤3制得的银耳多糖采用苯酚—硫酸法测定总多糖含量,测得银耳多糖提取率为57.95%。
步骤5:再对步骤3的银耳多糖采用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量,测得蛋白清除率为79.89%。
其中,步骤3中离心后得到的上清液,可先将其旋蒸浓缩后再进行冻干。通过旋蒸可将低共熔溶剂和乙醇溶剂回收后进行循环利用。
实施例3
一种利用低共熔溶剂提取银耳多糖的方法,包括以下步骤:
步骤1:将氢键受体甘油、氢键供体氯化胆碱与去离子水以1:3:80的质量比混合,于80℃水浴搅拌至澄清透明,放置一段时间后,溶液无晶体析出,得到低共熔溶剂;
步骤2:将冻干银耳孢子发酵液与步骤1配制的低共熔溶剂以1g:50mL的比例混合;然后将混合物在80℃水浴中提取,经离心,得到银耳多糖浸提液;
步骤3:向银耳多糖浸提液中加入体积浓度为95%的乙醇,银耳多糖浸提液与乙醇的体积比为1:4,经混匀、静置、离心,取沉淀物经洗涤、离心后,将沉淀加入100mL蒸馏水中,在60℃水浴下提取2h,采用14000Da孔径的透析袋透析三天后再次离心,上清液冻干获得银耳多糖;
步骤4:对步骤3制得的银耳多糖采用苯酚—硫酸法测定总多糖含量,测得银耳多糖提取率为58.22%。
步骤5:再对步骤3的银耳多糖采用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量,测得蛋白清除率为81.31%。
其中,步骤3中离心后得到的上清液,可先将其旋蒸浓缩后再进行冻干。通过旋蒸可将低共熔溶剂和乙醇溶剂回收后进行循环利用。
实施例4
一种利用低共熔溶剂提取银耳多糖的方法,包括以下步骤:
步骤1:将氢键受体甘油、氢键供体氯化胆碱与去离子水以1:2:80的质量比混合,于80℃水浴搅拌至澄清透明,放置一段时间后,溶液无晶体析出,得到低共熔溶剂;
步骤2:将冻干银耳孢子发酵液与步骤1配制的低共熔溶剂以2g:10mL的比例混合;然后将混合物在80℃水浴中提取,经离心,得到银耳多糖浸提液;
步骤3:向银耳多糖浸提液中加入体积浓度为95%的乙醇,银耳多糖浸提液与乙醇的体积比为1:4,经混匀、静置、离心,取沉淀物经洗涤、离心后,将沉淀加入200mL蒸馏水中,在60℃水浴下提取2h,采用14000Da孔径的透析袋透析三天后再次离心,上清液冻干获得银耳多糖;
步骤4:对步骤3制得的银耳多糖采用苯酚—硫酸法测定总多糖含量,测得银耳多糖提取率为54.8%。
步骤5:再对步骤3的银耳多糖采用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量,测得蛋白清除率为84.18%。
其中,步骤3中离心后得到的上清液,可先将其旋蒸浓缩后再进行冻干。通过旋蒸可将低共熔溶剂和乙醇溶剂回收后进行循环利用。
实施例5
一种利用低共熔溶剂提取银耳多糖的方法,包括以下步骤:
步骤1:将氢键受体甘油、氢键供体氯化胆碱与去离子水以1:3:80的质量比混合,于80℃水浴搅拌至澄清透明,放置一段时间后,溶液无晶体析出,得到低共熔溶剂;
步骤2:将冻干银耳孢子发酵液与步骤1配制的低共熔溶剂以5g:10mL的比例混合;然后将混合物在80℃水浴中提取,经离心,得到银耳多糖浸提液;
步骤3:向银耳多糖浸提液中加入体积浓度为95%的乙醇,银耳多糖浸提液与乙醇的体积比为1:4,经混匀、静置、离心,取沉淀物经洗涤、离心后,将沉淀加入500mL蒸馏水中,在60℃水浴提取2h,采用14000Da孔径的透析袋透析三天后再次离心,上清液冻干获得银耳多糖;
步骤4:对步骤3制得的银耳多糖采用苯酚—硫酸法测定总多糖含量,测得银耳多糖提取率为63.43%。
步骤5:再对步骤3的银耳多糖采用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量,测得蛋白清除率为86.73%。
其中,步骤3中离心后得到的上清液,可先将其旋蒸浓缩后再进行冻干。通过旋蒸可将低共熔溶剂和乙醇溶剂回收后进行循环利用。
以上所述,仅为本发明的较佳实施例,并非对本发明任何形式上和实质上的限制,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明的前提下,还将可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种利用低共熔溶剂提取银耳多糖的方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1:以甘油为氢键供体,氯化胆碱为氢键受体,加入去离子水配制低共熔溶剂;
步骤2:将冻干银耳孢子发酵液与步骤1配制得到的低共熔溶剂混合,然后在80℃水浴中提取,经离心,得到银耳多糖浸提液;
步骤3:向银耳多糖浸提液中加入溶剂,经混匀、静置、离心,取沉淀物经洗涤、离心后,将沉淀加入蒸馏水中,水浴提取后采用透析袋透析,然后再次离心,收集上清液,将上清液冻干后获得银耳多糖。
2.如权利要求1所述的利用低共熔溶剂提取银耳多糖的方法,其特征在于,所述步骤1中的氢键受体、氢键供体与去离子水的摩尔比为1:1~3:40~80。
3.如权利要求1所述的利用低共熔溶剂提取银耳多糖的方法,其特征在于,所述步骤1中低共熔溶剂的配制方法为:将氢键受体、氢键供体与去离子水水混合,于80℃水浴下搅拌至澄清透明,放置一段时间后,溶液无晶体析出,得到低共熔溶剂。
4.如权利要求1所述的利用低共熔溶剂提取银耳多糖的方法,其特征在于,所述步骤2中银耳孢子发酵液与低共熔溶剂的比例为1~5g:10~50mL。
5.如权利要求1所述的利用低共熔溶剂提取银耳多糖的方法,其特征在于,所述步骤3中的溶剂为乙醇,所述乙醇的体积浓度为95%。
6.如权利要求1所述的利用低共熔溶剂提取银耳多糖的方法,其特征在于,所述步骤3中银耳多糖浸提液与溶剂的体积比为1:4。
7.如权利要求1所述的利用低共熔溶剂提取银耳多糖的方法,其特征在于,所述步骤3中蒸馏水的体积与步骤2中的冻干银耳孢子发酵液的质量之比为100mL:1g。
8.如权利要求1所述的利用低共熔溶剂提取银耳多糖的方法,其特征在于,所述步骤3中水浴提取的条件为:温度50~70℃,时间1~3h。
9.如权利要求1所述的利用低共熔溶剂提取银耳多糖的方法,其特征在于,所述步骤3中透析的条件为:透析袋孔径14000Da,时间3天。
10.如权利要求1所述的利用低共熔溶剂提取银耳多糖的方法,其特征在于,所述步骤3中的上清液冻干之前先进行旋蒸浓缩,通过旋蒸浓缩将所述的低共熔溶剂和溶剂回收后循环利用。
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