CN101935358A - 一种灵芝多糖及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种灵芝多糖及其制备方法，该灵芝多糖是通过将灵芝子实体进行水提、超滤、脱色然后冷冻干燥得到。脱色后的灵芝多糖免疫活性显著提高，可刺激巨噬细胞生成一氧化氮，且可刺激淋巴细胞增殖。
Description
技术领域
本发明涉及食用真菌领域，具体的说涉及一种灵芝多糖及其制备方法。
背景技术
灵芝又名仙草、神草，是一种扶正固本、滋补强壮的珍贵药用菌，灵芝多糖是灵芝最主要的活性成分之一。现代研究表明，灵芝多糖具有抗血栓、抗肿瘤、抗辐射、抗氧化、免疫调节、保肝、降压等作用。随着近年发现灵芝多糖有越来越多的生物活性，各种灵芝多糖产品开始也越来越多，但传统水提法工艺提取的灵芝多糖产品颜色深，杂质多，不利于作为功能性食品或药品进行进一步研究与开发。
发明内容
本发明首先提供了一种灵芝多糖，该灵芝多糖是用如下方法制备得到的：
①水提：将灵芝子实体粉碎、热煮，得到灵芝粗多糖水提液；
②超滤：灵芝粗多糖水提液通过超滤膜进行超滤，冷冻干燥后得到分子量为1-50万Da的灵芝粗多糖干品；
③脱色：分子量为1-50万 Da的灵芝粗多糖干品按照10-40%的重量比配制成水溶液，离心除去沉淀部分；然后加入阴离子交换树脂，进行脱色；
④冷冻干燥：脱色后的灵芝粗多糖水溶液，进行冷冻干燥，即可。
本发明使用的灵芝子实体由上海市农业科学院食用菌所（保藏号：食用菌所 2469）提供。
本发明使用的超滤膜为高分子聚合卷式超滤膜，滤芯材质为聚砜PS、聚醚砜PES、聚偏氟乙烯PVDF，具体是购自上海弗立特实业有限公司的UF-3530超滤膜。
本发明使用的阴离子交换树脂为：苯乙烯-二乙烯苯共聚体骨架，功能基团为-N(CH3)2，具体是购自沧州宝恩吸附材料科技有限公司的脱色1号树脂。
所述的阴离子交换树脂在进行脱色前，最好先进行下述步骤的预处理：将树脂用3-5%的HCl小流量淋洗至流出液呈酸性，浸泡2-4小时，然后放尽酸液，用去离子水漂洗至中性；再用3-5%的NaOH小流量淋洗至流出液呈碱性，浸泡4-8小时，然后放尽碱液，用去离子水漂洗至中性备用。
所述的用阴离子交换树脂进行脱色，具体为1-50万Da的灵芝粗多糖干品按10-40%的重量比配制成水溶液后，加入已预处理好的阴离子交换树脂，进行脱色。
所述的脱色可为静态脱色或动态脱色；
其中静态脱色的方法为：灵芝粗多糖水溶液加入阴离子交换树脂后(40mL灵芝粗多糖水溶液加入5mL树脂)，保持温度为25-50℃，pH为5-7，搅拌2-4h，即可；
其中动态脱色的方法为：灵芝粗多糖水溶液加入阴离子交换树脂后（40mL灵芝粗多糖水溶液加入10mL树脂），室温下，流速1-4BV/h，上样体积为6-10BV，（1BV：10mL），即可。
脱色后的灵芝粗多糖水溶液，使用冷冻干燥机进行冷冻干燥处理，最终得到颜色较浅的灵芝多糖产品。
本发明还提供了制备上述灵芝多糖的方法，该方法包括如下步骤：
①水提：将灵芝子实体粉碎、热煮，得到灵芝粗多糖水提液；
②超滤：灵芝粗多糖水提液通过超滤膜进行超滤，冷冻干燥后得到分子量为1-50万Da的灵芝粗多糖干品；
③脱色：分子量为1-50万 Da的灵芝粗多糖干品按照10-40%的重量比配制成水溶液，离心除去沉淀部分；然后加入阴离子交换树脂，进行脱色；
④冷冻干燥：脱色后的灵芝粗多糖水溶液，进行冷冻干燥，即可。
本发明提供的经过脱色的灵芝多糖，制备方法简便、适用于大规模生产。脱色率可达到80%以上，多糖保留率达到75%以上，并且该灵芝多糖的免疫活性显著提高，可刺激巨噬细胞生成一氧化氮（NO），且可刺激淋巴细胞增殖。
具体实施方式
实施例1 水提法制备灵芝粗多糖并对其进行超滤
将灵芝子实体用粉碎机粉碎成小块，按照1kg子实体加入20L水的比例加水，加热煮沸持续2h，之后用滤布（100目）过滤，滤渣重复上述步骤再提取一次后过滤，合并两次提取的滤液。滤液浓缩至10L后，将浓缩液转到UF-3530超滤膜上进行超滤（选用截留分子量为1万和50万Da的超滤膜），冷冻干燥最终得到1-50万Da的灵芝粗多糖干品。
实施例2
1. 原料制备
实施例1的1-50万Da灵芝粗多糖干品按照15%质量比配制成溶液，离心除去沉淀部分。
2. 阴离子交换树脂预处理
用4%的HCl小流量淋洗至流出液呈酸性，浸泡3h，然后放尽酸液，用去离子水漂洗至中性；用4%的NaOH小流量淋洗至流出液呈碱性，浸泡6h，然后放尽碱液，用去离子水漂洗至中性。
1-50万Da灵芝粗多糖水溶液加入预处理后的阴离子交换树脂（加入比例为：40mL灵芝粗多糖水溶液中加入5mL树脂），于250mL三角烧瓶中，置于摇床中震荡，120rpm/min，30℃、pH5.0条件下脱色3h，然后用滤布（100目）过滤，收集脱色后的灵芝粗多糖水溶液，进行脱色的测定以及多糖保留率的测定。
灵芝粗多糖水溶液，稀释45倍后用苯酚硫酸法在490nm下测定脱色前后多糖含量，在450nm下测定脱色前后色素含量。（其中测定的实施例1的多糖含量和色素为脱色前的多糖含量和色素，实施例2的多糖含量和色素为脱色后的多糖含量和色素。）
计算公式：
结果：脱色率达到90.41%，多糖保留率达到81.01%。
3. 冷冻干燥
将脱色后的1-50万Da灵芝粗多糖水溶液部分浓缩后先放置于-20℃冷冻3h，然后置于-80摄氏度冷冻6h，之后转到冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，最后得到颜色较浅的灵芝多糖。
实施例3
1. 原料制备
实施例1的1-50万Da灵芝粗多糖干品按照40%质量比配制成溶液，离心除去沉淀部分。
2. 阴离子交换树脂处理（树脂预处理方法同实施例2）
1-50万Da灵芝粗多糖水溶液加入预处理后的阴离子交换树脂（加入比例为：40mL灵芝多糖粗提物加入10mL树脂；流速3BV/h；室温；上样体积40mL）柱中进行脱色，收集脱色后的粗多糖水溶液。
测定其多糖含量和色素，与实施例1相比，计算得到其脱色率为91.06%，多糖保留率为88.34%。
3. 冷冻干燥（同实施例2），得到灵芝多糖。
实施例4 灵芝多糖体外刺激免疫细胞活性实验
1. 体外刺激巨噬细胞生成NO实验
1.1 供试样品的配制
精确称取多糖样品（实施例1、实施例2和实施例3中得到的灵芝多糖）于灭过菌的eppendorf管中，用PBS缓冲液配置成浓度5mg/mL。充分溶解后以12000 rpm/min离心30分钟，无菌条件下转移至新的无菌eppendorf管中，将样品稀释成20、100、500μg/mL待用。空白对照为PBS缓冲液，阳性对照为10μg/mL LPS溶液。
1.2小鼠RAW264.7巨噬细胞的制备
用DMEM培养基在37℃、5%CO2条件下传代培养后，用0.05%胰蛋白酶消化，混悬液300×g离心3min后收集细胞，用无色RPMI1640培养基将细胞稀释到一定浓度备用。
1.3巨噬细胞NO产量测定
由于NO极不稳定，在体内很快生成亚硝酸基（NO2-）和硝酸基（NO3-），故采用Griess法测定样品中的NO2- /NO3-作为衡量NO水平的指标。
（1）用亚硝酸钠制标准曲线：
配成不同浓度的亚硝酸钠溶液，浓度梯度为0、5、10、15、20、25、30、35、40μM共九个；取100μL于96孔板，加入50μL Griess试剂，测定543nm吸光值，标准曲线每个浓度3个重复，绘制标准曲线。
（2）NO产量测定
吸掉培养的巨噬细胞的上清，加PBS 2 ml，震荡再吸掉。用0.05%胰酶或5%EDTA溶液使巨噬细胞悬浮起来，如不能悬浮则震荡培养瓶，或者37℃下3-5min。消化完毕，加入1mL DMEM完全培养基+胎牛血清终止反应，离心，吸掉消化液，加入1mL无色RPMI1640(10%胎牛血清+1%抗生素液体)，计数。用无色RPMI1640培养基将细胞稀释至5×105/ml，加入96孔板，每孔加入180μL，然后再加入20μL待测样品， 37℃培养48h。取100μL上清于96孔板，加入50μLGriess试剂，显色10min后，于波长543nm处测定吸光度，根据标准曲线计算相应的NO量。
1.4 实验结果
实施例1、实施例2和实施例3的灵芝多糖测定的巨噬细胞中NO的含量（单位：μmoL/2.5×105cells）分别为：0.90、7.41、3.30（样品浓度20μg/mL）；0.82、23.18、19.60（100μg/mL）；1.23、33.02、33.46（500μg/mL）。可以看出，实施例2和实施例3中的灵芝多糖与实施例1中的相比，具有更显著的刺激巨噬细胞产生NO的活性。
2. 体外刺激淋巴细胞增殖实验
2.1 供试样品的配制
精确称取多糖样品（实施例1、实施例2和实施例3中得到的灵芝多糖）于灭过菌的eppendorf管中，用PBS缓冲液配置成浓度10 mg/mL。充分溶解后以12000 rpm/min离心30分钟，无菌条件下转移至新的无菌eppendorf管中，将样品稀释成200、500、1000μg/mL待用。空白对照为PBS缓冲液，阳性对照为60μg/mL PHA溶液。
2.2 小鼠脾淋巴细胞的制备
小鼠颈椎脱臼处死，取脾脏，用PBS冲洗3~4次。用100目筛在培养皿中将脾脏磨碎，磨碎后的混悬液以400×g离心6 min，吸去上清液，加入浓度为0.83％氯化氨溶液裂解红细胞，反复冲打，静置10 min后400×g离心6 min，收集的细胞用PBS缓冲液冲洗数遍后，台朌蓝检查活力在95%以上。用RPMI1640将细胞稀释成2×106个/mL，加入96孔细胞培养板中，在37℃、含5%的CO2条件下培养。
2.3 淋巴细胞增殖率的测定
将180 μL每mL含2×106个淋巴细胞的悬浮液加至96孔板中，同时加入20 μL样品，于37℃、含5%的CO2条件下培养3 d，用酶标仪测定其570 nm和600 nm处的吸光度，然后加入20 μL Alamar Blue试剂，再培养，变色后再测定570 nm和600 nm处的吸光度，然后根据Alamar Blue试剂的公式计算各种样品对细胞增殖的影响。
计算公式：
淋巴细胞增殖率(%)=[117216×Al570(sample)-80586×Al600(sample)]
/[117216×Al570(control)-80586×Al600(control)]×100%
2.4 实验结果
实施例1、实施例2和实施例3的灵芝多糖测定的淋巴细胞增值率（%）分别为：52.31、161.53、174.08（样品浓度200μg/mL）；60.98、164.03、194.45（500μg/mL）；62.22、189.01、221.99（1000μg/mL）。实施例2和实施例3中的灵芝多糖与实施例1中的相比，具有更显著的刺激淋巴细胞增殖的活性。
Claims (4)
1.一种灵芝多糖，其特征在于其是用如下方法制备得到的：
①水提：将灵芝子实体粉碎、热煮，得到灵芝粗多糖水提液；
②超滤：灵芝粗多糖水提液通过超滤膜进行超滤，冷冻干燥后得到分子量为1-50万Da的灵芝粗多糖干品；
③脱色：分子量为1-50万 Da的灵芝粗多糖干品按照10-40%的重量比配制成水溶液，离心除去沉淀部分；然后加入阴离子交换树脂，进行脱色；
④冷冻干燥：脱色后的灵芝粗多糖水溶液，进行冷冻干燥，即可。
2.根据权利要求1所述的灵芝多糖，其特征在于所述的脱色为静态脱色或动态脱色。
3.根据权利要求2所述的灵芝多糖，其特征在于所述的静态脱色的方法为：
灵芝粗多糖水溶液加入阴离子交换树脂，其中40mL灵芝粗多糖水溶液加入5mL树脂，保持温度为25-50℃，pH为5-7，搅拌2-4h，即可。
4.根据权利要求2所述的灵芝多糖，其特征在于所述的动态脱色的方法为：
灵芝粗多糖水溶液加入阴离子交换树脂，其中40mL灵芝粗多糖水溶液加入10mL树脂，室温下，流速1-4BV/h，上样体积为6-10BV，即可。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20110105 |