CN104987427B - 利用响应曲面法优化黑果枸杞多糖的复合酶微波提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用响应曲面法优化黑果枸杞多糖的复合酶微波提取方法，该方法包括以下步骤：⑴样品制备：将黑果枸杞果实制成黑果枸杞果粉；然后按不同的料液比、不同浸泡时间、不同微波功率、不同提取时间进行反应提取，得到对应于不同微波功率的黑果枸杞多糖提取物干燥粉末；⑵用苯酚‑硫酸法测定每个提取液中多糖含量；⑶实验设计与统计分析：①单因素试验；②响应面法优化设计：根据单因素试验结果，选取多糖提取效果影响较显著的微波功率、提取时间、浸泡时间、料液比这4个因素建立多元二次回归方程；⑷实验结果分析与优化：利用Design Expert 8.0软件根据多元二次回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应面及其等高线图。本发明操作简单、提取率高。

Description

利用响应曲面法优化黑果枸杞多糖的复合酶微波提取方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及利用响应曲面法优化黑果枸杞多糖的复合酶微波提取方法。

背景技术

黑果枸杞(Lycium Ruthenicum Murr.)藏药称为“旁玛”，为茄科(Solanceae)、茄族(Solanceae Reihb )、枸杞亚族(Lyciinae wettst)枸杞属(Lycium L.)。多年生灌木，具棘刺，浆果球形，成熟后为紫黑色，有很高的光合效率和较强抗逆性，是我国西北特有的抗盐抗旱野生植物种，主要分布于青海、西藏、新疆等地。黑果枸杞味甜多汁，含丰富的维生素、有机酸及糖类，民间常生食或榨汁做饮料；黑果枸杞也具有一定的医疗保健功能，其味甘、性平、清心热，藏医用于治疗心热病、心脏病、月经不调、停经等病症，并且药效显著，被收载于《四部医典》、《晶珠本草》等藏医药经典著作中；《维吾尔药志》记载，维吾尔族医生常用黑果枸杞果实及根皮治疗尿道结石、月经不调、癣疥、齿龈出血等病症；民间用作滋补强壮、明目及降压药。研究表明，黑果枸杞多糖具有良好的抗疲劳、调节免疫力及降血糖的功能。

目前，运用于黑果枸杞多糖的提取方法大致可分为：热水浸提法、超声法、微波法、超声-微波协同萃取法等4 类。但无论哪种方法，都是以破坏多糖和蛋白质的结合，通过溶媒加以分离为基本原理，并在这一前提下，尽量保证多糖不被过多水解，再经过适当干燥处理，获得粗多糖。据文献报道，所得黑果枸杞多糖含量大多集中在10%左右。目前，黑果枸杞果实多糖最佳提取工艺为：提取温度90 ℃，提取时间为 60 min，提取 3 次。在上述条件下，3次提取多糖得率分别为：3.34%，3.72%，3.95%，平均得率为3.67±0.31%，黑果枸杞果实粗多糖含量为 46.62%（江建红等，2009）。

中国专利CN103333268 公开了一种黑果枸杞多糖的制备方法。该方法在制备过程中采用超微粉碎技术，将已提取过色素的黑果枸杞残渣进行粉碎，然后进行脱脂处理得到脱脂黑果枸杞粉末，脱脂粉末先经过酶解处理，再采用低温冻融技术，反复冻融，最后经过滤、醇沉、脱蛋白处理、冻干等工序得到抗氧化活性黑果枸杞多糖成品。该方法与传统提取方法相比，具有收率高、活性强、成本低的优点。但提取过程中冻融技术需要用到超低温冰箱，而且冻融过程耗时长，所以并不适合工业化生产。此外，脱蛋白处理所涉及的Sevag由氯仿和正丁醇按照体积比 4:1组成，处理不当很容易造成有害溶剂残留，产生健康安全隐患。

因此，为了合理和高效利用黑果枸杞资源，亟需提供一种操作简单、提取率高、安全的从黑果枸杞果实中制备活性多糖的方法。有关复合酶-微波辅助提取黑果枸杞抗衰老活性多糖的专利未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、提取率高的利用响应曲面法优化黑果枸杞多糖的复合酶微波提取方法。

为解决上述问题，本发明所述的利用响应曲面法优化黑果枸杞多糖的复合酶微波提取方法，包括以下步骤：

⑴样品制备：

将黑果枸杞果实洗净，在25~30℃温度下烘干48~72h后粉碎至40~80目，按20~40mL/g料液比加入体积浓度为80%的乙醇溶液，在25℃~35℃浸泡2~4h后过滤，得到滤渣，该滤渣于40~60℃下干燥12~24h，即得脱除脂类、色素和小分子糖的黑果枸杞果粉；然后在微波反应器中，按15~25mL/g不同的料液比加入复合酶溶液，40~50℃静置浸泡1.5~2.5h的不同时间，在300~400W的不同微波功率下按20~30min的不同时间进行反应提取，提取后的溶液分别以4000~5000转/min进行离心，15~20min后收集上清液A，该上清液A经50~60℃真空旋转蒸发浓缩至原体积的1/6~1/8后，得到浓缩产物；所述浓缩产物中加入其体积3~4倍的无水乙醇溶液混匀，当其溶液中乙醇浓度为80%时，于2~6℃下静置12~24h，再分别以4000~5000转/min进行离心，15~20min后收集沉淀；沉淀加水复溶后，以4000~5000转/min进行离心，15~20min后收集上清液B，该上清液B于-70℃~ -85℃预冻4~6 h，最后在大气压力为10~100Pa、温度为-55℃~ -70℃的条件下冷冻干燥24~72h，得到对应于不同微波功率的黑果枸杞多糖提取物干燥粉末；

所述复合酶溶液是指蛋白酶、纤维素酶和果胶酶等质量混合后加去离子水配制而成的pH为4~5的溶液；

⑵用苯酚-硫酸法测定每个提取液中多糖含量：

①标准曲线制作：

准确称取10 mg葡萄糖，配制成浓度为0.1 mg/mL的溶液，分别取0 mL、0.1 mL、0.2mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL，依次补加蒸馏水至1 mL；以蒸馏水作对照，分别向其中加入0.5 mL 6%的苯酚，振荡摇匀，垂直快速加入2.5 mL浓H₂SO₄，振荡摇匀后，静止30 min，冷却至室温，然后在490 nm波长下测吸光值，以糖溶液浓度μg/mL为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线；

②样品中多糖含量的测定：

将样品配置成60 μg/mL的溶液，取样品1 mL，不加蒸馏水，其余操作均与所述步骤①制作标准曲线相同；在490 nm波长下比色，所得数值在标准曲线上查出相应的总糖含量；

⑶实验设计与统计分析：

①单因素试验：

依次改变微波功率、提取时间、浸泡时间、料液比进行单因素试验，用苯酚-硫酸法测定所得的黑果枸杞多糖提取物中多糖的含量，并按下式计算多糖产率，每次处理重复三次：

多糖产率（%）=[(多糖含量×提取物重量)/ 果粉重量]×100%；

②响应面法优化设计：

根据单因素试验结果，选取多糖提取效果影响较显著的微波功率、提取时间、浸泡时间、料液比这4个因素，利用Design Expert 8.0软件根据Box-Behnken设计原则进行实验设计，以微波功率X₁、提取时间X₂、浸泡时间X₃和料液比X₄为自变量，以多糖的产率为响应值y，建立多元二次回归方程：

y=-17.47108+0.12776X₁+0.45350X₂-1.29400X₃-0.14273X₄-0.00080X₁X₂+0.00320X₁X₃+0.00029X₁X₄-0.00200X₂X₃+0.00120X₂X₄+0.018000X₃X₄-1.60067×10^-3X₁ ²-2.45667×10^-3X₂ ²+4.33333×10^-3X₃ ²-1.06667×10^-3X₄ ²；

⑷实验结果分析与优化：

利用Design Expert 8.0软件根据多元二次回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应面及其等高线图。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明不仅利用复合酶酶解技术破坏植物细胞壁促进细胞内活性多糖成分的充分溶出、水解果实中蛋白质成分提高多糖含量、避免氯仿等有害溶剂造成的安全隐患，而且利用低功率微波穿透式内外加热，在降低活性多糖结构破坏风险的同时促进多糖溶出、节省提取时间。

2、与正交法相比，本发明采用Box-Behnken Designs (BBD)中心组合设计模型的响应面分析法，用4个变化因子、3个水平及少量的实验组（仅29组实验）就可以得出优化结果，获得最佳产率，在提高了提取效率的同时降低了能耗和污染物排放，具有工业化生产的实际意义；并且所得的最佳提取条件不是设定的值，而是在设定条件的范围之内。

3、本发明获得的黑果枸杞多糖最终产品为棕色粉末，易溶于水，经测试其糖含量为60%~66%，糖醛酸含量为2.8%~3.4%，不含蛋白质，主要由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、半乳糖组成，不仅能够有效阻止自由基的产生，而且能够显著清除已产生的自由基。

⑴糖醛酸含量检测采用间羟基联苯法，具体如下：

①标准曲线制备：分别量取0.1 g/L D-GalA标准溶液0 μL、50 μL、100 μL、200 μL、300 μL、400 μL转于玻璃试管（1.8 × 18 cm）中，加蒸馏水补至400 μL，每个浓度重复三个样品。向每支试管中加入氨基磺酸试剂40 μL，摇匀，再向各管加入浓硫酸2.5 mL，振荡均匀，沸水浴煮沸20 min。冷却至室温后，向各管中加入间羟基联苯试剂40 μL，摇匀，室温放置15 min。在λ525 nm处测定吸光度A。以吸收度A为纵坐标，D-半乳糖醛含量（μg）为横坐标，得标准曲线。

②样品中糖醛酸含量测定：取浓度0.1 g/L左右的样品溶液400 μL，按标准曲线制备方法之操作，测定吸收度，根据标准曲线和样品浓度计算其中的糖醛酸含量。重复3次，结果取平均数。

⑵蛋白质含量检测采用考马斯亮蓝法，具体如下：

①考马斯亮蓝试剂的配置：

称取10 mg考马斯亮蓝G-250，溶解于5 mL的95%乙醇中，加入10 mL的85%磷酸，用蒸馏水定容至100 mL，过滤备用。最终试剂中考马斯亮蓝的浓度为0.01%（w/v），乙醇浓度为4.7%（w/v）。

②标准曲线的制作：

分别取50 μg/mL蛋白质标准溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，加蒸馏水补至1.0 mL，分别向每支试管中加入考马斯亮蓝试剂4 mL，迅速振荡混匀，静置5min后在595 nm处测定光吸收值A595 nm。以吸收度A595 nm为纵坐标，牛血清白蛋白质量C（μg）为横坐标，制作标准曲线。

③样品中蛋白质含量的测定：

取0.1 mg/mL的样品溶液l mL，按以上操作，测定其595 nm处测定光吸收值A595nm，根据标准曲线计算样品中的蛋白质含量。重复3次，结果取平均数。

4、对本发明获得的黑果枸杞多糖采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生化法进行组成单糖分析，经检测如图17所示，按峰面积定量，黑果枸杞多糖由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖组成，其摩尔比为1:0.76:50.82:1.80:0.46:3.85。具体方法如下：

⑴完全酸水解：

称取多糖样品2 mg，加入含有2 M HCl的无水甲醇溶液0.5 mL，充N2封管，80℃水解16 h，空气吹干后，加入2 M三氟乙酸0.5 mL，120℃水解1 h，然后移入蒸发皿，45℃水浴，反复加无水乙醇赶除三氟乙酸后干燥。

⑵1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生化：

向水解后得到的单糖样品中加入PMP试剂和0.3 M的NaOH溶液各0.5 mL，充分溶解后取0.1mL于1.5 mL离心管中，水浴70℃反应30 min。离心（5000 rpm，5 min）后，加入0.3 MHCl 0.05 mL，充分混匀。加入1 mL氯仿，萃取多余的PMP试剂，离心（5000 rpm，5 min）去除氯仿层，水层用0.22 μm滤膜过滤后，待HPLC检测。

⑶单糖-PMP衍生物的HPLC分析：

采用Shimadzu HPLC系统（LC-10ATvp泵和SPD-10Avp紫外检测器），Shim-pack VP-ODS色谱柱（4.6 mm × 150 mm），流动相为0.1 M pH 7.0磷酸盐缓冲液:乙腈为82:18（v/v），流速为1.0 mL/min，进样量为10 μL，检测波长为245 nm。

5、对本发明获得的黑果枸杞多糖进行体外抗衰老活性实验，其自由基产生必需中间体O^2-•清除效果的IC₅₀值为0.72 mg/mL，H₂O₂清除效果的IC₅₀值为1.57 mg/mL，DPPH自由基清除效果的IC₅₀值为0.14 mg/mL，羟基自由基（•OH）清除效果的IC₅₀值为0.21 mg/mL。

⑴超氧负离子（O^2-•）清除实验：

活性氧指的是一系列由氧产生的化学活性分子，大量研究表明其与人体的衰老以及多种疾病（肿瘤、心脑血管等）密切相关。O^2-•作为活性氧的一种，由氧分子在自然条件下得到一个电子而产生，其活性并不很强。但是，它能够在自然条件或过氧化物歧化酶的作用下得到一个电子成为H₂O₂，继而产生活性极强的•OH。本实验采用PMS-NADH-NBT体系测定黑果枸杞多糖的O^2-•清除能力。

具体操作：取1 mL不同浓度样品溶液（0.25-4 mg/mL），加入1 mL氯化硝基四氮唑NBT（300 μM），1 mL还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH（936 μM），加入1 mL吩嗪硫酸二甲酯PMS（120 μM）启动反应，25 ℃水浴反应5 min后，测定其560 nm处的吸光值（A560 nm）。0.1M pH 7.4的磷酸盐缓冲液作为空白对照，抗坏血酸为阳性对照。按下面公式计算超氧负离子（O^2-•）清除率：

超氧负离子（O^2-•）清除率=(1–A_sample/A_control)×100%，其中A_sample为测试样品的A_{560 nm}，A_control为空白对照的A_{560 nm}。

⑵H₂O₂清除实验：

H₂O₂也是活性氧的一种，虽属中等活性，但却是许多活性较强的自由基产生过程的中间体，如H₂O₂在髓过氧化物酶的作用下，参与产生次氯酸（HClO），在金属离子存在下，参与产生羟自由基。因此，清除_H2O2就阻止了自由基产生的链式反应。本实验采用辣根过氧化物酶法测定黑果枸杞多糖对H₂O₂的清除作用。

具体操作：取1 mL不同浓度样品溶液（0.25-4 mg/mL），加入0.4 mL H₂O₂（5 mM），在室温下放置20 min，再加入0.6 mL辣根过氧化物酶（HRpase 300 μg/mL，苯酚红4.5 mM在100 mM pH7.4磷酸缓冲液中），静置10 min后，测定其610 nm处的吸光值A_{610 nm}。按下面公式计算H₂O₂清除率：

H₂O₂清除率=(1–A_sample/A_control)×100%，其中A_sample为测试样品的A_{610 nm}，A_control为空白对照的A_{610 nm}。

⑶DPPH自由基清除实验：

DPPH是一种稳定的有机自由基，其乙醇溶液呈紫红色，在可见光区最大吸收峰为517 nm。当存在自由基清除剂时，由于与其单电子配对而使其逐渐消失，其褪色程度与所接受的电子数成定量关系，因而可用分光光度法进行定量分析。利用DPPH的以上特性，用分光光度法测定加入胶陀螺多糖后混合溶液517 nm波长处的吸光值（A517 nm）的变化程度可以反映其对有机自由基的消除能力。

具体操作：取4 mL不同浓度的多糖溶液（0.5-4 mg/mL），与0.1 M DPPH甲醇溶液1mL混合，剧烈振荡，于暗处静置15 min，再于室温下静置20 min。蒸馏水作为空白对照，抗坏血酸为阳性对照。用分光光度计测定反应溶液的A517 nm。按照下面的公式计算DPPH的清除率：

DPPH清除率=(1–A_sample/A_control)×100%，其中A_sample为测试样品的A_{517 nm}，A_control为空白对照的A_{517 nm}。

⑷羟基自由基（•OH）清除实验：

羟基自由基（•OH）是代谢过程中产生的非常活泼的自由基，毒性很大，能够造成蛋白质、核酸、脂类等生物大分子的损伤，从而导致体内代谢紊乱，引起许多病理变化。本研究采用脱氧核糖-铁体系法对黑果枸杞多糖的羟基自由基（•OH）清除能力进行测定。

具体操作：依次向试管中加入50 mM pH 7.5的磷酸盐缓冲液0.4 mL，0.5-10 mg/mL的样品溶液0.1 mL（对照用蒸馏水），1 mM的EDTA溶液0.1 mL，10 mmol/L的H₂O₂ 0.1 mL，2mM的抗坏血酸溶液0.1 mL，60 mM的脱氧核糖溶液0.1 mL（样品空白不加），1 mM的FeCl₃溶液0.1 mL，各管最终体积为1.0 mL，37 ℃水浴1 h，取出后迅速加入10%的三氯乙酸1.0 mL终止反应，再加入1%硫代巴比妥酸1.0 mL，沸水浴反应15 min后立即冷却，于532 nm波长处测定吸光值（A_{532 nm}），按下式计算清除率：

羟基自由基（•OH）清除率=(1–A_sample/A_control)×100%，其中A_sample为测试样品的A_{532 nm}，Acontrol为空白对照的A_{532 nm}。

⑸统计方法：

所获得数值型实验数据以SPSS13.0软件进行统计分析，半数抑制浓度（IC₅₀，mg/mL）采用概率单位回归计算得出，多组样本之间的两两比较采用方差分析q检验。检验水准α=0.01。

黑果枸杞多糖的抗衰老效果如表1所示。IC₅₀值可以体现天然产物的抗衰老能力，是抗衰老功能评价的一个常用指标，该值没有一个界限值，通常数值越小表明抗衰老能力越强。从上述结果可以看出，黑果枸杞多糖的抗衰老能力显著优于阳性对照物香菇多糖的抗衰老能力。因此，可以看出本方法提取得到的多糖具有良好的抗衰老活性。

表1 黑果枸杞多糖抗衰老活性评价结果

注：与阳性对照组市售香菇多糖相比，^a P < 0.01。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明提取时间与微波功率对多糖提取率影响的响应面三维图。

图2为本发明提取时间与微波功率对多糖提取率影响的响应面二维图。

图3为本发明浸泡时间与微波功率对多糖提取率影响的响应面三维图。

图4为本发明浸泡时间与微波功率对多糖提取率影响的响应面二维图。

图5为本发明料液比与微波功率对多糖提取率影响的响应面三维图。

图6为本发明料液比与微波功率对多糖提取率影响的响应面二维图。

图7为本发明浸泡时间与提取时间对多糖提取率影响的响应面三维图。

图8为本发明浸泡时间与提取时间对多糖提取率影响的响应面二维图。

图9为本发明料液比与提取时间对多糖提取率影响的响应面三维图。

图10为本发明料液比与提取时间对多糖提取率影响的响应面二维图。

图11为本发明料液比与浸泡时间对多糖提取率影响的响应面三维图。

图12为本发明料液比与浸泡时间对多糖提取率影响的响应面二维图。

图13为本发明微波功率变化对多糖产率影响图。

图14为本发明提取时间变化对多糖产率影响图。

图15为本发明浸泡时间变化对多糖产率影响图。

图16为本发明料液比变化对多糖产率影响图。

图17为本发明抗衰老黑果枸杞多糖的组成单糖分析图。

具体实施方式

利用响应曲面法优化黑果枸杞多糖的复合酶微波提取方法，包括以下步骤：

⑴样品制备：

将黑果枸杞果实洗净，在25~30℃温度下烘干48~72h后粉碎至40~80目，按20~40mL/g料液比加入体积浓度为80%的乙醇溶液，在25℃~35℃浸泡2~4h后过滤，得到滤渣，该滤渣于40~60℃下干燥12~24h，即得脱除脂类、色素和小分子糖的黑果枸杞果粉；然后在微波反应器中，按15~25mL/g不同的料液比加入复合酶溶液，40~50℃静置浸泡1.5~2.5h的不同时间，在300~400W的不同微波功率下按20~30min的不同时间进行反应提取，提取后的溶液分别以4000~5000转/min进行离心，15~20min后收集上清液A，该上清液A经50~60℃真空旋转蒸发浓缩至原体积的1/6~1/8后，得到浓缩产物；浓缩产物中加入其体积3~4倍的无水乙醇溶液混匀，当其溶液中乙醇浓度为80%时，于2~6℃下静置12~24h，再分别以4000~5000转/min进行离心，15~20min后收集沉淀；沉淀加水复溶后，以4000~5000转/min进行离心，15~20min后收集上清液B，该上清液B于-70℃~ -85℃预冻4~6 h，最后在大气压力为10~100Pa、温度为-55℃~ -70℃的条件下冷冻干燥24~72h，得到对应于不同微波功率的黑果枸杞多糖提取物干燥粉末。

其中：复合酶溶液是指蛋白酶、纤维素酶和果胶酶等质量混合后加去离子水配制而成的pH为4~5的溶液。

⑵用苯酚-硫酸法测定每个提取液中多糖含量：

①标准曲线制作：

准确称取10 mg葡萄糖，配制成浓度为0.1 mg/mL的溶液，分别取0 mL、0.1 mL、0.2mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL，依次补加蒸馏水至1 mL。以蒸馏水作对照，分别向其中加入0.5 mL 6%的苯酚，振荡摇匀，垂直快速加入2.5 mL浓H₂SO₄，振荡摇匀后，静止30 min，冷却至室温，然后在490 nm波长下测吸光值，以糖溶液浓度μg/mL为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

②样品中多糖含量的测定：

将样品配置成60 μg/mL的溶液，取样品1 mL，不加蒸馏水，其余操作均与步骤①制作标准曲线相同；在490 nm波长下比色，所得数值在标准曲线上查出相应的总糖含量。

⑶实验设计与统计分析：

①单因素试验：

依次改变微波功率、提取时间、浸泡时间、料液比进行单因素试验，用苯酚-硫酸法测定所得的黑果枸杞多糖提取物中多糖的含量，并按下式计算多糖产率，每次处理重复三次：

多糖产率（%）=[(多糖含量×提取物重量)/ 果粉重量]×100%；

②响应面法优化设计：

根据单因素试验结果，选取多糖提取效果影响较显著的微波功率、提取时间、浸泡时间、料液比这4个因素，利用Design Expert 8.0软件根据Box-Behnken设计原则进行实验设计（设定结果见表2），以微波功率X₁、提取时间X₂、浸泡时间X₃和料液比X₄为自变量，以多糖的产率为响应值y（实验方案及结果见表3），建立多元二次回归方程：

y=-17.47108+0.12776X₁+0.45350X₂-1.29400X₃-0.14273X₄-0.00080X₁X₂+0.00320X₁X₃+0.00029X₁X₄-0.00200X₂X₃+0.00120X₂X₄+0.018000X₃X₄-1.60067×10^-3X₁ ²-2.45667×10^-3X₂ ²+4.33333×10^-3X₃ ²-1.06667×10^-3X₄ ²。

各因子与响应值之间线性关系显著性，由F值检验来判定，P值越小，则说明变量的显著性越高。由方差分析表（表4）可知，其因变量和全体自变量之间的线性关系显著（R²=0.9720），模型显著水平小于0.0001，所以该回归方程模型是极显著的。

表2 实验因素与水平设定

表3 Box-Behnken实验设计与结果

表4实验数据的方差分析结果

⑷实验结果分析与优化：

利用Design Expert 8.0软件根据多元二次回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应面及其等高线图（如图1~16）。

上述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

上述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

新鲜黑果枸杞果实购自青海省海西蒙古族藏族自治州都兰县黑果枸杞加工企业；微波提取装置为XH-300B微波超声波合成/萃取仪（北京祥鹄科技发展有限公司），冷冻干燥机为FD-2型冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）。

Claims (1)

1.利用响应曲面法优化黑果枸杞多糖的复合酶微波提取方法，包括以下步骤：

⑴样品制备：

将黑果枸杞果实洗净，在25~30℃温度下烘干48~72h后粉碎至40~80目，按20~40 mL/g料液比加入体积浓度为80%的乙醇溶液，在25℃~35℃浸泡2~4h后过滤，得到滤渣，该滤渣于40~60℃下干燥12~24h，即得脱除脂类、色素和小分子糖的黑果枸杞果粉；然后在微波反应器中，按15~25mL/g不同的料液比加入复合酶溶液，40~50℃静置浸泡1.5~2.5h的不同时间，在300~400W的不同微波功率下按20~30min的不同时间进行反应提取，提取后的溶液分别以4000~5000转/min进行离心，15~20min后收集上清液A，该上清液A经50~60℃真空旋转蒸发浓缩至原体积的1/6~1/8后，得到浓缩产物；所述浓缩产物中加入其体积3~4倍的无水乙醇溶液混匀，当其溶液中乙醇浓度为80%时，于2~6℃下静置12~24h，再分别以4000~5000转/min进行离心，15~20min后收集沉淀；沉淀加水复溶后，以4000~5000转/min进行离心，15~20min后收集上清液B，该上清液B于-70℃~ -85℃预冻4~6 h，最后在大气压力为10~100Pa、温度为-55℃~ -70℃的条件下冷冻干燥24~72h，得到对应于不同微波功率的黑果枸杞多糖提取物干燥粉末；

所述复合酶溶液是指蛋白酶、纤维素酶和果胶酶等质量混合后加去离子水配制而成的pH为4~5的溶液；

⑵用苯酚-硫酸法测定每个提取液中多糖含量：

①标准曲线制作：

准确称取10 mg葡萄糖，配制成浓度为0.1 mg/mL的溶液，分别取0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL，依次补加蒸馏水至1 mL；

以蒸馏水作对照，分别向其中加入0.5 mL 6%的苯酚，振荡摇匀，垂直快速加入2.5 mL浓H₂SO₄，振荡摇匀后，静止30 min，冷却至室温，然后在490 nm波长下测吸光值，以糖溶液浓度μg/mL为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线；

②样品中多糖含量的测定：

将样品配置成60 μg/mL的溶液，取样品1 mL，不加蒸馏水，其余操作均与所述步骤①制作标准曲线相同；在490 nm波长下比色，所得数值在标准曲线上查出相应的总糖含量；

⑶实验设计与统计分析：

①单因素试验：

依次改变微波功率、提取时间、浸泡时间、料液比进行单因素试验，用苯酚-硫酸法测定所得的黑果枸杞多糖提取物中多糖的含量，并按下式计算多糖产率，每次处理重复三次：

多糖产率（%）=[(多糖含量×提取物重量)/ 果粉重量]×100%；

②响应面法优化设计：

根据单因素试验结果，选取多糖提取效果影响较显著的微波功率、提取时间、浸泡时间、料液比这4个因素，利用Design Expert 8.0软件根据Box-Behnken设计原则进行实验设计，以微波功率X₁、提取时间X₂、浸泡时间X₃和料液比X₄为自变量，以多糖的产率为响应值y，建立多元二次回归方程：

y=-17.47108+0.12776X₁+0.45350X₂-1.29400X₃-0.14273X₄-0.00080X₁X₂+ 0.00320X₁X₃+0.00029X₁X₄-0.00200X₂X₃+0.00120X₂X₄+0.018000X₃X₄-1.60067×10^-3X₁ ²-2.45667×10^{- 3}X₂ ²+4.33333×10^-3X₃ ²-1.06667×10^-3X₄ ²；

⑷实验结果分析与优化：

利用Design Expert 8.0软件根据多元二次回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应面及其等高线图。