CN106317242A - 基于响应面法优化黄花角蒿多糖提取工艺参数的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于响应面法优化黄花角蒿多糖提取工艺参数的方法,用于甘肃地产黄花角蒿多糖的提取工艺,它包括药材除杂,水提醇沉法提取黄花角蒿多糖,计算药材中多糖的得率,本发明采用响应面法确定黄花角蒿多糖提取的变量参数,选取对黄花角蒿多糖得率有较显著影响的三个因素,在单因素实验基础上,设计三因素五水平的响应面分析实验,进而确定出黄花角蒿多糖的最佳提取工艺条件为提取时间2h,所加入水的体积与药材质量的液料比7:1ml/g,滤液中乙醇的质量浓度65%,在此条件下按照上述方法所述的步骤提取多糖,测定多糖含量计算得率为8.66012%,与理论预测值相差0.12459%,充分说明响应面分析法对黄花角蒿多糖提取条件进行的优化可靠,有实用性。
Description
技术领域
本发明涉及植物成分提取技术领域,具体的说是一种基于响应面法优化黄花角蒿多糖提取工艺参数的方法。
背景技术
黄花角蒿为紫葳科多年生草本植物,具有分枝的茎,高达80厘米到1米,根近木质而分枝。生于海拔2000-2600米山坡。高山花卉,花淡黄色,钟状漏斗形,具有较好的观赏性。甘肃地产黄花角蒿含有总黄酮、多糖、Ca、Fe、Zn、Mg、Mn、Cu、Cd等微量元素。黄花角蒿以根入药,民间用于治疗慢性咽炎,效果明显。
水提醇沉法的基本原理是,利用药材等植物中的大多数成分如生物碱盐、甙类、有机酸类、氨基酸、多糖等易溶于水和醇中的特性,用水提出,并将其提取液浓缩,加入适当的乙醇或水反复数次沉降,除去其不溶物质,最后得到澄明液体。
响应面法( Response Surface Methodology,RSM) 是试验设计、数理统计和最优化技术的一种综合应用,是数学方法与统计方法结合的产物,用于对所感兴趣的响应受多个变量影响的问题进行建模及分析,其最终目的是优化该响应值。与正交设计分析法和均匀设计分析法相比较,响应面分析法在试验设计和结果表达方面更加优良。
发明内容
本发明的目的是在单因素实验的基础上,利用响应面分析法对黄花角蒿多糖提取工艺条件进行优化,为黄花角蒿品质的综合评价和开发利用提供参考依据。
为实现上述目的,本发明所采取的技术方案为:
一种基于响应面法优化黄花角蒿多糖提取工艺参数的方法,本方法所述黄花角蒿为紫薇科角蒿属植物黄花角蒿( Incarvillea sinensis Lam.var.przewalskii)的根,主要分布于甘肃省陇南地区、定西地区,它包括以下步骤:
步骤一、药材预处理,称取适量的黄花角蒿药材粉碎,用粒度为24目的筛子筛分后,称取10.0g药材放置于容量为250ml的圆底烧瓶中,加入80mL石油醚于75℃水浴中加热回流1h,抽滤,弃去滤液,将滤渣收集到容积为250mL的圆底烧瓶中,加入质量浓度为85%的乙醇溶液60ml,回流2h,抽滤,弃滤液,收集滤渣,黄花角蒿药材中脂溶性杂质被除去;
步骤二、水提醇沉法提取黄花角蒿多糖,采用响应面法确定黄花角蒿多糖提取的变量参数,设置三因素五水平的试验方式进行重复试验获得实验结果,计算出黄花角蒿多糖得率,再采用Design Expert 7.0.0软件进行多元回归分析,得出试验因素对响应值影响的回归方程为:
方程决定系数R2=0.9913
式中响应值Y为黄花角蒿多糖得率,变量参数X1为提取时间、变量参数X2为所加入水的体积与黄花角蒿药材的质量的液料比、变量参数X3为加入乙醇后滤液中乙醇的质量浓度,最终确定X1为2h,X2为7ml/g,X3为65%。
按照所述的变量参数,在步骤一所制备的滤渣中加入200ml蒸馏水于80℃水浴中加热回流提取2次,每次提取时间为1h,得到滤液,在滤液中加入质量浓度为80%的乙醇,测量滤液中乙醇的质量浓度达到65%后沉淀12-24小时后,滤除上清液,将滤渣进行离心分离后,在滤渣中加入水进行溶解,所加入水的体积与黄花角蒿药材的质量比为7ml/g,在溶液中再加入氯仿与正丁醇的混合液除去溶液中的蛋白,得到黄花角蒿粗多糖。
步骤三、将步骤二所制得的黄花角蒿粗多糖用蒸馏水定容至100mL容量瓶中制得粗多糖溶液,再取1.6mL粗多糖溶液定容到100mL容量瓶中,用作标准曲线的方法测吸光度,计算出黄花角蒿药材中多糖得率,黄花角蒿多糖得率为8.66012%。
其中多糖得率的计算公式为:
多糖得率(%)=(粗多糖质量/药材质量)×100
优选的,所述步骤二中氯仿与正丁醇的混合液中氯仿与正丁醇的体积比为4:1。
优选的,所述步骤二中滤渣进行离心分离时,离心机的转速为4000-5000转/min。
优选的,所述多糖含量测定标准曲线的制定,包括以下步骤:
(1)称取100.00mg蒽酮用质量百分比浓度为76%的稀硫酸定容到容积为100ml容量瓶中备用;
(2)称取105℃干燥至质量恒定的葡萄糖50.00mg,加蒸馏水定容于容积为50mL的容量瓶中,配成质量体积浓度为1mg/ml的标准葡萄糖溶液备用;
(3)分别吸取标准葡萄糖溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL置于容积为50mL的容量瓶中,加蒸馏水定容摇匀,再分别吸取各不同质量浓度的葡萄糖溶液1mL,均加入配制好的5mL蒽酮试液,立即放入冰水浴中摇匀后,置沸水浴中煮12min,取出用水冲洗2.5min冷却,静置10min后放置于波长624nm 处测定吸光度,以蒸馏水1.0mL 作空白对照;
(4)以葡萄糖质量浓度为横坐标x、吸光度为纵坐标y做回归处理,得回归方程y=8.2286x-0.0133,R2=0.9983,线性范围20~120μg/ml,绘制成多糖含量测定标准曲线。
本发明的有益效果为:
本发明根据水沉醇提法的原理,采用响应面法确定黄花角蒿多糖提取的变量参数,选取对黄花角蒿多糖得率有较显著影响的三个因素,即提取时间、所加入水的体积与黄花角蒿药材质量的液料比、滤液中乙醇的质量浓度,在单因素实验基础上,设计三因素五水平的响应面分析实验,进而确定出黄花角蒿多糖的最佳提取工艺条件,即:提取时间为2h、所加入水的体积与黄花角蒿药材的质量的液料比为7ml/g、滤液中乙醇的质量浓度65%,黄花角蒿多糖得率为8.66012%。
本发明利用中心组合试验设计和效应面分析法,借助统计软件DesignExpert7.0.0简便、可靠地进行优化试验和数据分析,对黄花角蒿中多糖提取的工艺参数进行优化,取得了较好的效果。本发明为黄花角蒿内在质量的评价提供参考,为黄花角蒿新品种的推广应用奠定基础。
附图说明
图1是不同滤液中乙醇的质量浓度与多糖得率关系示意图;
图2是不同所加入水的体积与黄花角蒿药材质量的液料比与多糖得率关系示意图;
图3是不同提取时间与多糖得率关系示意图;
图4是提取时间和所加入水的体积与黄花角蒿药材质量的液料比对多糖得率影响的多糖得率影响的三维曲面图;
图5是提取时间和所加入水的体积与黄花角蒿药材质量的液料比对多糖得率影响的多糖得率影响的等高线图;
图6是提取时间和滤液中乙醇的质量浓度对多糖得率影响的三维曲面图;
图7是提取时间和滤液中乙醇的质量浓度对多糖得率影响的多糖得率影响的等高线图;
图8是所加入水的体积与黄花角蒿药材质量的液料比和滤液中乙醇的质量浓度对多糖得率影响的三维曲面图。
图9是所加入水的体积与黄花角蒿药材质量的液料比和滤液中乙醇的质量浓度对多糖得率影响的等高线图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细的说明。
一种基于响应面法优化黄花角蒿多糖提取工艺参数的方法,本方法所述黄花角蒿为为紫薇科角蒿属植物黄花角蒿( Incarvillea sinensis Lam.var.przewalskii)的根,主要分布于甘肃省陇南地区、定西地区,它包括以下步骤:
步骤一、药材预处理,称取适量的黄花角蒿药材粉碎,用粒度为24目的筛子筛分后,称取10.0g药材放置于容量为250ml的圆底烧瓶中,加入80mL石油醚于75℃水浴中加热回流1h,抽滤,弃去滤液,将滤渣收集到容积为250mL的圆底烧瓶中,加入质量浓度为85%的乙醇溶液60ml,回流2h,抽滤,弃滤液,收集滤渣,黄花角蒿药材中脂溶性杂质被除去;
步骤二、水提醇沉法提取黄花角蒿多糖,采用响应面法确定黄花角蒿多糖提取的变量参数,设置三因素五水平的试验方式进行重复试验获得实验结果,计算出黄花角蒿多糖得率,再采用Design Expert 7.0.0软件进行多元回归分析,得出试验因素对响应值影响的回归方程为:
方程决定系数R2=0.9913
式中响应值Y为黄花角蒿多糖得率,变量参数X1为提取时间、变量参数X2为所加入水的体积与黄花角蒿药材质量的液料比、变量参数X3为加入乙醇后滤液中乙醇的质量浓度,最终确定X1为2h,X2为7ml/g,X3为65%。
按照所述的变量参数,在步骤一所制备的滤渣中加入200ml蒸馏水于80℃水浴中加热回流提取2次,每次提取时间为1h,得到滤液,在滤液中加入质量浓度为80%的乙醇,测量滤液中乙醇的质量浓度达到65%后沉淀12-24小时后,滤除上清液,将滤渣进行离心分离后,在滤渣中加入水进行溶解,所加入水的体积与黄花角蒿药材的质量比为7ml/g,在溶液中再加入氯仿与正丁醇的混合液除去溶液中的蛋白,得到黄花角蒿粗多糖。
步骤三、将步骤二所制得的黄花角蒿粗多糖用蒸馏水定容至100mL容量瓶中制得粗多糖溶液,再取1.6mL粗多糖溶液定容到100mL容量瓶中,用作标准曲线的方法测吸光度,计算出黄花角蒿药材中多糖得率,黄花角蒿多糖得率为8.66012%。
其中多糖得率的计算公式为:
多糖得率(%)=(粗多糖质量/药材质量)×100
步骤二中氯仿与正丁醇的混合液中氯仿与正丁醇的体积比为4:1。
优选的,所述步骤二中滤渣进行离心分离时,离心机的转速为4000-5000转/min。
多糖含量测定标准曲线的制定,包括以下步骤:
(1)称取100.00mg蒽酮用质量百分比浓度为76%的稀硫酸定容到容积为100ml容量瓶中备用;
(2)称取105℃干燥至质量恒定的葡萄糖50.00mg,加蒸馏水定容于容积为50mL的容量瓶中,配成质量体积浓度为1mg/ml的标准葡萄糖溶液备用;
(3)分别吸取标准葡萄糖溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL置于容积为50mL的容量瓶中,加蒸馏水定容摇匀,再分别吸取各不同质量浓度的葡萄糖溶液1mL,均加入配制好的5mL蒽酮试液,立即放入冰水浴中摇匀后,置沸水浴中煮12min,取出用水冲洗2.5min冷却,静置10min后放置于波长624nm 处测定吸光度,以蒸馏水1.0mL 作空白对照;
(4)以葡萄糖质量浓度为横坐标x、吸光度为纵坐标y做回归处理,得回归方程y=8.2286x-0.0133,R2=0.9983,线性范围20~120μg/ml,绘制成多糖含量测定标准曲线。
1、三因素的确定
根据水沉醇提法提取药材中多糖的方法,采用响应面法确定黄花角蒿多糖提取的变量参数,分别以不同的提取时间(1、1.5、2、2.5、3h)、所加入水的体积与黄花角蒿药材质量的液料比(6:1、7:1、8:1、9:1、10:1ml/g)、滤液中乙醇的质量浓度(65%、70%、75%、80%、85%)为单因素各设置3个重复试验,按照步骤二所述的水提醇沉法提取黄花角蒿多糖,分别计算出不同变量参数时黄花角蒿多糖得率。
根据中心复合设计原理,综合单因素试验结果,选取对黄花角蒿多糖得率有较显著影响的3个因素,即提取时间、所加入水的体积与黄花角蒿药材质量的液料比、滤液中乙醇的质量浓度,在单因素试验基础上,设计三因素五水平的响应面分析试验,因素及水平见表1。
表1
2、单因素试验
(1)不同滤液中乙醇的质量浓度与多糖得率的影响
准确称取经步骤一处理后的药材粉末10.0g,固定所加入水的体积与黄花角蒿药材质量的液料比为6:1ml/g,提取时间为1h,滤液中乙醇的质量浓度分别为65%、70%、75%、80%、85%,按照本发明所述的步骤提取黄花角蒿多糖,并计算其得率;绘制出药材中多糖得率跟随不同滤液中乙醇的质量浓度变化的曲线,结果如图1所示。
图1表明,沉淀多糖时,随着滤液中乙醇的质量浓度的改变,其多糖得率也有明显变化。当滤液中乙醇的质量浓度为70%时,多糖得率达到最大,浓度偏高后多糖得率反而降低,是因为滤液中乙醇的质量浓度太高时,其杂质也会增加。因此将最佳滤液中乙醇的质量浓度定为70%。
(2)不同所加入水的体积与黄花角蒿药材的质量的液料比对黄花角蒿多糖得率的影响:
准确称取药材粉末10.0g,固定提取时间为1h,滤液中乙醇的质量浓度分别为70%,所加入水的体积与黄花角蒿药材的质量的液料比分别为6:1、7:1、8:1、9:1、10:1ml/g,按照上述方法所述的步骤提取黄花角蒿多糖,并计算其得率;绘制出药材中多糖得率跟随液料比变化的曲线,结果如图2所示。
图2表明,随着加水量的增加,多糖得率逐渐增大,在液料比为7:1ml/g时多糖的得率达到最大,随后多糖得率逐渐降低,因此最佳的所加入水的体积与黄花角蒿药材的质量的液料比为7:1ml/g。
(3)不同提取时间对黄花角蒿多糖得率的影响:
准确称取药材粉末10.0g,固定所加入水的体积与黄花角蒿药材的质量的液料比为7:1ml/g,滤液中乙醇的质量浓度分别为70%,不同的提取时间分别为1、1.5、2、2.5、3h,按照上述方法所述的步骤提取黄花角蒿多糖,并计算其得率;绘制出药材中多糖得率跟随提取时间变化的曲线,结果如图3所示。
图3表明,随着提取时间的增加,多糖得率逐渐增大,在提取时间达到2h时多糖的得率达到最大,随后多糖得率逐渐降低,因此最佳的提取时间为2h。
3、响应面优化试验
采用表1设置的三因素五水平,根据测得的正交试验和验证试验数据,进行20组试验,其中有析因实验、中心试验,来估计试验误差。结果见表2。
表2
试验数据采用Design Expert 7.0.0软件进行多元回归分析,得出试验因素对响应值影响的回归方程为:
方程决定系数R2=0.9913
式中响应值Y为黄花角蒿多糖得率,变量参数X1为提取时间、变量参数X2为所加入水的体积与黄花角蒿药材质量的液料比、变量参数X3为加入乙醇后滤液中乙醇的质量浓度。
方程中各项系数绝对值的大小反映了各因素对响应值的影响程度。使用DesignExpert7.0.0软件对实验数据进行全模型响应面方差分析,结果见表3。
表3
注:*显著(P<0.05)**极显著(P<0.01)
由表3可知,X3、X2X3、X1 2、X2 2、X3 2对黄花角蒿多糖得率影响极显著,X1、X2、X1X2对多糖得率影响显著,表明各因素及其一次项和二次项对多糖得率的影响是显著的。
4、最佳提取工艺条件确定
使用DesignExpert7.0.0软件,对影响黄花角蒿多糖得率的不同的两个因素进行分析,得出响应面的三维曲面图和等高线图,见图4-图9。通过三维曲面图和等高线图,能直观地体现出不同的两个因素对多糖得率响应值的交互作用,从图中可看出所加入水的体积与黄花角蒿药材质量的液料比与滤液中乙醇的质量浓度的交互作用最为显著,表现为重合面积最小。3个因素对黄花角蒿多糖得率的影响顺序为X3> X2> X1,即滤液中乙醇的质量浓度影响最大,所加入水的体积与黄花角蒿药材质量的液料比次之,提取时间最小。
5、验证实验
根据所得的回归模型,由Design Expert7.0.0软件对实验参数进一步优化,得到黄花角蒿中提取多糖的最佳条件:提取时间126.94min,所加入水的体积与黄花角蒿药材的质量的液料比7.10:1ml/g,滤液中乙醇的质量浓度66.15%,在此最佳工艺条件下黄花角蒿中多糖得率为8.66012%,为了其实际操作性,将其条件改为提取时间2h,所加入水的体积与黄花角蒿药材的质量的液料比7∶1ml/g,滤液中乙醇的质量浓度65%,在此条件下按照本发明所述的方法提取黄花角蒿药材中的多糖,测定多糖含量计算得率为8.67091%,与理论预测值相差0.12459%,充分说明响应面分析法对黄花角蒿多糖提取条件进行的优化可靠,有实用性。
6、结论
本实验考察提取时间、所加入水的体积与黄花角蒿药材质量的液料比、滤液中乙醇的质量浓度3个因素对黄花角蒿多糖得率的影响,在单因素试验的基础上进行响应面优化试验设计,以多糖得率为指标考察黄花角蒿多糖的最佳提取工艺,各因素对多糖得率的影响为:滤液中乙醇的质量浓度>液料比>提取时间,其中滤液中乙醇的质量浓度是影响黄花角蒿多糖提取的关键因素,且各因素的二次项对多糖得率影响极显著。通过实验,得出黄花角蒿最佳工艺条件为:滤液中乙醇的质量浓度65%、提取时间2h、液料比7:1ml/g,此时提出率可达8.66012%。
本试验中所用仪器:
UV-2600型紫外-可见分光光度计(岛津);800型离心沉淀器(上海手术器械十厂);MH-500可调式电热套(北京科伟永兴仪器有限公司);HHS-11S电子恒温不锈钢水浴锅(上海宜昌仪器纱筛厂);KQ-250TDB型高频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);DHG-9123A电子恒温鼓风干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)。
所用试剂:
葡萄糖标准品、无水乙醇、石油醚、85%乙醇、三氯甲烷、正丁醇、浓硫酸(质量浓度为95%~98%)、蒽酮均为分析纯;蒸馏水。
所用药材:
采集于甘肃省陇南地区礼县的野生样品,由甘肃中医学院李成义教授鉴定为紫薇科角蒿属植物黄花角蒿( Incarvillea sinensis Lam.var.przewalskii)的根。
Claims (4)
1.一种基于响应面法优化黄花角蒿多糖提取工艺参数的方法,本方法所述黄花角蒿为为紫薇科角蒿属植物黄花角蒿( Incarvillea sinensis Lam.var.przewalskii)的根,主要分布于甘肃省陇南地区、定西地区,其特征在于:它包括以下步骤:
步骤一、药材预处理,称取适量的黄花角蒿药材粉碎,用粒度为24目的筛子筛分后,称取10.0g药材放置于容量为250ml的圆底烧瓶中,加入80mL石油醚于75℃水浴中加热回流1h,抽滤,弃去滤液,将滤渣收集到容积为250mL的圆底烧瓶中,加入质量浓度为85%的乙醇溶液60ml,回流2h,抽滤,弃滤液,收集滤渣,黄花角蒿药材中脂溶性杂质被除去;
步骤二、水提醇沉法提取黄花角蒿多糖,采用响应面法确定黄花角蒿多糖提取的变量参数,设置三因素五水平的试验方式进行重复试验获得实验结果,计算出黄花角蒿多糖得率,再采用Design Expert 7.0.0软件进行多元回归分析,得出试验因素对响应值影响的回归方程为:
方程决定系数R2=0.9913
式中响应值Y为黄花角蒿的多糖得率,变量参数X1为提取时间、变量参数X2为所加入水的体积与黄花角蒿药材质量的液料比、变量参数X3为加入乙醇后滤液中乙醇的质量浓度,最终确定X1为2h,X2为7ml/g,X3为65%;
按照所述的变量参数,在步骤一所制备的滤渣中加入200ml蒸馏水于80℃水浴中加热回流提取2次,每次提取时间为1h,得到滤液,在滤液中加入质量浓度为80%的乙醇,测量滤液中乙醇的质量浓度达到65%后沉淀12-24小时后,滤除上清液,将滤渣进行离心分离后,在滤渣中加入水进行溶解,所加入水的体积与黄花角蒿药材的质量比为7ml/g,在溶液中再加入氯仿与正丁醇的混合液除去溶液中的蛋白,得到黄花角蒿粗多糖;
步骤三、将步骤二所制得的黄花角蒿粗多糖用蒸馏水定容至100mL容量瓶中制得粗多糖溶液,再取1.6mL粗多糖溶液定容到100mL容量瓶中,用作标准曲线的方法测吸光度,计算出黄花角蒿药材中多糖得率,黄花角蒿多糖得率为8.66012%。
2.根据权利要求1所述的基于响应面法优化黄花角蒿多糖提取工艺参数的方法,其特征在于:所述步骤二中氯仿与正丁醇的混合液中氯仿与正丁醇的体积比为4:1。
3.根据权利要求1所述的基于响应面法优化黄花角蒿多糖提取工艺参数的方法,其特征在于:所述步骤二中滤渣进行离心分离时,离心机的转速为4000-5000转/min。
4.根据权利要求1所述的基于响应面法优化黄花角蒿多糖提取工艺参数的方法,其特征在于:所述多糖含量测定标准曲线的制定,包括以下步骤:
(1)称取100.00mg蒽酮用质量百分比浓度为76%的稀硫酸定容到容积为100ml容量瓶中备用;
(2)称取105℃干燥至质量恒定的葡萄糖50.00mg,加蒸馏水定容于容积为50mL的容量瓶中,配成质量体积浓度为1mg/ml的标准葡萄糖溶液备用;
(3)分别吸取标准葡萄糖溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL置于容积为50mL的容量瓶中,加蒸馏水定容摇匀,再分别吸取各不同质量浓度的葡萄糖溶液1mL,均加入配制好的5mL蒽酮试液,立即放入冰水浴中摇匀后,置沸水浴中煮12min,取出用水冲洗2.5min冷却,静置10min后放置于波长624nm 处测定吸光度,以蒸馏水1.0mL 作空白对照;
(4)以葡萄糖质量浓度为横坐标x、吸光度为纵坐标y做回归处理,得回归方程y=8.2286x-0.0133,R2=0.9983,线性范围20~120μg/ml,绘制成多糖含量测定标准曲线。
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