CN105343335A - 一种利用响应面法优化沉香叶茶多酚的提取工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用响应面法优化沉香叶茶多酚的提取工艺，包括如下步骤：1)制备供试液；2)提取液中茶多酚含量测定；3)实验设计与统计分析：①单因素实验，②响应面法优化设计：以单因素试验结果为基础，选择浸提时间、液料比、浸提温度、乙醇浓度作为响应变量，以沉香叶茶多酚含量作为响应值，采用响应曲面法对沉香叶茶多酚提取条件进行优化；4)实验结果分析与优化：通过Design-Expert.8.05软件对回归方程进行计算，得到浸提沉香叶茶多酚最佳工艺条件。
Description
技术领域
本发明涉及一种沉香叶茶多酚的提取工艺，尤其涉及一种利用响应面法优化沉香叶茶多酚的提取工艺。
背景技术
沉香为瑞香科植物白木香Aquilariasinensis(Lour.)Gilg含有树脂的木材，是我国名贵中草药材，具有行气止痛，温中止呕，纳气平喘等功效，用于胸腹胀闷疼痛、胃寒呕吐呃逆、肾虚气逆喘急。如今对沉香的利用情况仅限在只有含树脂的沉香木材，其可作为药用，其他部位如叶、种子、树枝、不含树脂的木材均被作为废物处理，造成资源的大量浪费。沉香叶为白木香的非药用部位，其相关研究还很少。
茶多酚是茶叶中的有效成分，具有较强的生理活性和抗氧化性能。另外，茶多酚还具有抗癌治病、防衰老、降血糖等一系列特殊的药理功能，对食品的色和味有重要的作用。
响应面法是利用试验设计并通过实验得到一定量的数据，借助多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，对回归方程进行分析以得到最优工艺参数，是解决多变量问题的一种统计方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种工艺简单、易于工业化生产的利用响应面法优化沉香叶中茶多酚的提取工艺。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种利用响应面法优化沉香叶茶多酚的提取工艺，包括如下步骤：
1)供试液的制备
将沉香叶粉碎，用包装袋装好备用；准确称取粉碎的沉香叶2.0g，用体积分数为30-70％的乙醇溶液进行水浴浸提，浸提时间为10-50min，液料比为20-40mL·g-1，浸提温度为50-90℃；将粗提取液以转速3500r/min离心6min后，取上清液并加入与上清液等体积的氯仿混匀脱色，在黑暗条件中静置1h后取上层清液即茶多酚母液；移取1ml茶多酚母液于100ml容量瓶，用去离子水定容至刻度，摇匀，待测；
2)提取液中茶多酚含量测定
①沉香叶样品中干物质的含量测定
按照GB/T8302-2013的方法进行沉香叶的精准取样，称取5g(精确至0.001g)样品于烘皿中，置于120℃干燥箱中，加热1h后加盖取出，于干燥器内冷却至室温，称量(精确至0.001g)，干物质含量为：
式中：m0：试样的原始质量，单位为克(g)
m1：干燥后的试样质量，单位为克(g)
②制备测试液
a、配制10％福林酚试剂(现配)
将25ml福林酚试剂转移到250ml容量瓶中，用水定容至刻度线，摇匀。
b、配制质量分数为7.5％的碳酸钠溶液
称取37.50gNa2CO3，用适量水溶解后移至500ml容量瓶中，用水定容至刻度线，摇匀。
c、配制没食子酸标准储备液(现配)
称取0.1100g没食子酸，用适量水溶解后移至100ml容量瓶中，用水定容至刻度线，摇匀。
d、配制没食子酸工作液
分别移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0mL的没食子酸标准储备液于100mL容量瓶中，分别定容至刻度线，摇匀。得到浓度分别为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50μg/mL的没食子酸工作液。
③茶多酚含量测定及结果计算
分别移取已配制的一系列梯度没食子酸工作液、供试液、水各1.00mL于25mL比色管内，在每个比色管管内分别加入5.0mL福林酚试剂(10％)，摇匀，反应3-8分钟，加入4.0mlNa2CO3溶液(7.5％)，加水定容后摇匀。在室温下遮光放置60min，用紫外可见分光光度计进行波长扫描及吸光度的测定。
式中：
A：供试液吸光度；V：样品提取液体积；d：稀释因子；SLOPEstd：没食子酸标准曲线的斜率；M：样品中干物质的含量(％)；M1：样品质量(g)。
3)实验设计与统计分析
①单因素实验
准确称取粉碎的沉香叶2.0g，选用不同的浸提时间、液料比、浸提温度、乙醇浓度进行水浴浸提单因素试验，每个条件设置三个平行样，反复三次浸提，并按步骤2)所述的方法计算提取液中的茶多酚含量；
②响应面法优化设计
以单因素试验结果为基础，采用SAS软件应用Box-Behnken设计方法，选择浸提时间(A)、液料比(B)、浸提温度(C)、乙醇浓度(D)作为响应变量，编码水平为-1、0和1，且以沉香叶茶多酚含量(Y)作为响应值，采用响应曲面法对沉香叶茶多酚提取条件进行优化；对各因素进行回归拟合之后，得到回归方程:
茶多酚含量(％)＝-17.50450-0.39913A+1.29627B+0.010700C+0.59177D－0.014800AB+9.32500×10-3AC+3.85000×10-3AD+3.5000×10-4BC+2.1×10-3BD－9.00000×10-4CD+1.05917×10-3A2－0.013763B2-1.67833×10-3C2－8.90333×10-3D2；
4)实验结果分析与优化
通过Design-Expert.8.05软件对回归方程进行计算，得到浸提沉香叶茶多酚最佳工艺条件。
本发明优点如下：
1)以乙醇作为溶剂提取沉香叶中的茶多酚，工艺简单，提取率高，易于实现工业化生产；
2)通过响应面法探究和优化沉香叶中茶多酚的提取工艺，对于积极开展沉香叶的利用研究，实现沉香资源的综合利用，提高沉香的经济价值具有积极的现实意义。
附图说明
图1为浸提时间对沉香叶茶多酚含量提取的影响图。
图2为液料比对沉香叶茶多酚含量提取的影响图。
图3为浸提温度对沉香叶茶多酚含量提取的影响图。
图4为乙醇浓度对沉香叶茶多酚含量提取的影响图。
具体实施例
实施例1：一种利用响应面法优化沉香叶茶多酚的提取工艺，包括如下步骤：
1)供试液的制备
将沉香叶粉碎，用包装袋装好备用；准确称取粉碎的沉香叶2.0g，用体积分数为30-70％的乙醇溶液进行水浴浸提，浸提时间为10-50min，液料比为20-40mL·g-1，浸提温度为50-90℃；将粗提取液以转速3500r/min离心6min后，取上清液并加入与上清液等体积的氯仿混匀脱色，在黑暗条件中静置1h后取上层清液即茶多酚母液；移取1ml茶多酚母液于100ml容量瓶，用去离子水定容至刻度，摇匀，待测；
2)提取液中茶多酚含量测定
①沉香叶样品中干物质的含量测定
按照GB/T8302-2013的方法进行沉香叶的精准取样，称取5g(精确至0.001g)样品于烘皿中，置于120℃干燥箱中，加热1h后加盖取出，于干燥器内冷却至室温，称量(精确至0.001g)，干物质含量为：
式中：m0：试样的原始质量，单位为克(g)
m1：干燥后的试样质量，单位为克(g)
②制备测试液
a、配制10％福林酚试剂(现配)
将25ml福林酚试剂转移到250ml容量瓶中，用水定容至刻度线，摇匀。
b、配制质量分数为7.5％的碳酸钠溶液
称取37.50gNa2CO3，用适量水溶解后移至500ml容量瓶中，用水定容至刻度线，摇匀。
c、配制没食子酸标准储备液(现配)
称取0.1100g没食子酸，用适量水溶解后移至100ml容量瓶中，用水定容至刻度线，摇匀。
d、配制没食子酸工作液
分别移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0mL的没食子酸标准储备液于100mL容量瓶中，分别定容至刻度线，摇匀。得到浓度分别为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50μg/mL的没食子酸工作液。
③茶多酚含量测定及结果计算
分别移取已配制的一系列梯度没食子酸工作液、供试液、水各1.00mL于25mL比色管内，在每个比色管管内分别加入5.0mL福林酚试剂(10％)，摇匀，反应3-8分钟，加入4.0mlNa2CO3溶液(7.5％)，加水定容后摇匀。在室温下遮光放置60min，用紫外可见分光光度计进行波长扫描及吸光度的测定。
式中：
A：供试液吸光度；V：样品提取液体积；d：稀释因子；SLOPEstd：没食子酸标准曲线的斜率；M：样品中干物质的含量(％)；M1：样品质量(g)。
3)实验设计与统计分析
①单因素实验
准确称取粉碎的沉香叶2.0g，选用不同的浸提时间、液料比、浸提温度、乙醇浓度进行水浴浸提单因素试验，每个条件设置三个平行样，反复三次浸提，并按步骤2)所述的方法计算提取液中的茶多酚含量；结果见图1至图4。
由图1可知，随着时间增加，提取的茶多酚含量先逐渐增加后减少，这是由于随着时间增加茶多酚在水中逐渐溶出，提取液的茶多酚含量增加；当时间过长，茶多酚长时间暴露在空气中并处于高温之下，部分被氧化或发生降解反应，浸出率下降。因此，茶多酚最佳浸提时间为30min。
由图2可知，随着液料比增加，提取的茶多酚含量逐渐增加，当液料比为35mL·g-1时，达到最大值。当液料比大于35mL·g-1，茶多酚含量减少，最后趋于稳定。因此，茶多酚提取的最佳液料比为35mL·g-1。
由图3可知，随着温度升高，提取的茶多酚含量逐渐增加后减少。可能是随着温度上升，有效成分溶解度增大；当温度过高，较高温度使得茶多酚类化合物分解，提取率下降。因此，茶多酚提取的最佳温度为80℃。
由图4可知，当乙醇浓度增大，茶多酚含量先略有上升后逐渐下降。可能是高浓度乙醇容易引起茶叶中蛋白质等物质变性，茶叶颗粒渗透性降低，从而导致茶多酚的浸提率下降。因此，茶多酚提取的最佳乙醇浓度为40％。
②响应面法优化设计
以单因素试验结果为基础，采用SAS软件应用Box-Behnken设计方法，选择浸提时间(A)、液料比(B)、浸提温度(C)、乙醇浓度(D)作为响应变量，编码水平为-1、0和1，且以沉香叶茶多酚含量(Y)作为响应值，采用响应曲面法对沉香叶茶多酚提取条件进行优化。响应面试验因素编码及水平设计见表1。
表1响应曲面试验因素水平设计
模型建立与显著性检验：选取浸提时间(A)、液料比(B)、浸提温度(C)、乙醇浓度(D)4个因素作为自变量，以沉香叶茶多酚含量为响应值。Box-Benhnken实验设计与结果如表2所示。
表2Box-Benhnken试验设计与结果
方差分析及显著性检验：用软件Design-Expert.8.05对所得数据进行回归分析，分析结果如表3所示。对各因素进行回归拟合之后，得到回归方程:
茶多酚含量(％)＝-17.50450-0.39913A+1.29627B+0.010700C+0.59177D－0.014800AB+9.32500×10-3AC+3.85000×10-3AD+3.5000×10-4BC+2.1×10-3BD－9.00000×10-4CD+1.05917×10-3A2－0.013763B2-1.67833×10-3C2－8.90333×10-3D2
表3回归模型方差分析
注：模型的确定系数R2＝0.9865；模型的调整确定系数RAdj 2＝0.9729；**差异极显著(p＜0.01)；*差异显著(p＜0.05)
由表3可知，回归方差分析显著性检验表明，该模型回归显著(p＜0.0001)，失拟项不显著(p＝0.2488＞0.05),该模型具有统计学意义。模型的确定系数R2＝0.9865，调整确定系数RAdj 2＝0.9729，说明模型拟合度较好。模型的失拟项差异不显著，说明回归方程拟合程度高，可用来对浸提沉香叶茶多酚的工艺参数进行初步分析和预测。分析结果还表明，方程的一次项中A对响应值的影响极显著，二次项B2、C2、D2，交互项AB、AC、AD对响应值的影响极显著。
从各因素影响程度分析，各因素的F值可以反映出各因素的影响大小，F值越大，对响应值影响越大。从表3可知，FA＝176.67，FB＝0.014，FC＝0.28，FD＝1.00，各因素对沉香叶茶多酚含量影响大小顺序为：浸提时间＞乙醇浓度＞浸提温度＞液料比。
4)实验结果分析与优化
通过软件Design-Expert8.0.5求解方程，得出最优提取工艺条件得到浸提沉香叶茶多酚最佳工艺条件为：浸提时间40min，液料比30.05mL·g-1，浸提温度90℃，乙醇浓度40.75％。出于对条件可操作性考虑，将最佳提取工艺条件修正为：浸提时间40min，液料比30mL·g-1，浸提温度90℃，乙醇浓度40％，采用此浸提条件提取茶多酚进行验证试验，重复三次，茶多酚含量为13.72％，与预测值13.46％相近。说明通过响应面优化后的提取条件参数可靠，具有实践指导意义。
Claims (1)
1.一种利用响应面法优化沉香叶茶多酚的提取工艺，其特征在于：包括如下步骤：
1)供试液的制备
将沉香叶粉碎，用包装袋装好备用；准确称取粉碎的沉香叶2.0g，用体积分数为30-70％的乙醇溶液进行水浴浸提，浸提时间为10-50min，液料比为20-40mL·g-1，浸提温度为50-90℃；将粗提取液以转速3500r/min离心6min后，取上清液并加入与上清液等体积的氯仿混匀脱色，在黑暗条件中静置1h后取上层清液即茶多酚母液；移取1ml茶多酚母液于100ml容量瓶，用去离子水定容至刻度，摇匀，待测；
2)提取液中茶多酚含量测定
①沉香叶样品中干物质的含量测定
按照GB/T8302-2013的方法进行沉香叶的精准取样，称取5g样品于烘皿中，置于120℃干燥箱中，加热1h后加盖取出，于干燥器内冷却至室温，称量，干物质含量为：
式中：m0：试样的原始质量，单位为克
m1：干燥后的试样质量，单位为克
②制备测试液
a、配制10％福林酚试剂
将25ml福林酚试剂转移到250ml容量瓶中，用水定容至刻度线，摇匀；
b、配制质量分数为7.5％的碳酸钠溶液
称取37.50gNa2CO3，用适量水溶解后移至500ml容量瓶中，用水定容至刻度线，摇匀；
c、配制没食子酸标准储备液
称取0.1100g没食子酸，用适量水溶解后移至100ml容量瓶中，用水定容至刻度线，摇匀；
d、配制没食子酸工作液
分别移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0mL的没食子酸标准储备液于100mL容量瓶中，分别定容至刻度线，摇匀，得到浓度分别为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50μg/mL的没食子酸工作液；
③茶多酚含量测定及结果计算
分别移取已配制的一系列梯度没食子酸工作液、供试液、水各1.00mL于25mL比色管内，在每个比色管管内分别加入5.0mL福林酚试剂，摇匀，反应3-8分钟，加入4.0mlNa2CO3溶液，加水定容后摇匀，在室温下遮光放置60min，用紫外可见分光光度计进行波长扫描及吸光度的测定；
比较试样和标准工作液的吸光度,
式中：
A：供试液吸光度；V：样品提取液体积；d：稀释因子；SLOPEstd：没食子酸标准曲线的斜率；M：样品中干物质的含量(％)；M1：样品质量(g)；
3)实验设计与统计分析
①单因素实验
准确称取粉碎的沉香叶2.0g，选用不同的浸提时间、液料比、浸提温度、乙醇浓度进行水浴浸提单因素试验，每个条件设置三个平行样，反复三次浸提，并按步骤2)所述的方法计算提取液中的茶多酚含量；
②响应面法优化设计
以单因素试验结果为基础，采用SAS软件应用Box-Behnken设计方法，选择浸提时间(A)、液料比(B)、浸提温度(C)、乙醇浓度(D)作为响应变量，编码水平为-1、0和1，且以沉香叶茶多酚含量(Y)作为响应值，采用响应曲面法对沉香叶茶多酚提取条件进行优化；对各因素进行回归拟合之后，得到回归方程:
茶多酚含量(％)＝-17.50450-0.39913A+1.29627B+0.010700C+0.59177D－0.014800AB+9.32500×10-3AC+3.85000×10-3AD+3.5000×10-4BC+2.1×10-3BD－9.00000×10-4CD+1.05917×10-3A2－0.013763B2-1.67833×10-3C2－8.90333×10-3D2；
4)实验结果分析与优化
通过Design-Expert.8.05软件对回归方程进行计算，得到浸提沉香叶茶多酚最佳工艺条件。
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