CN109453213A - 一种黄秋葵籽总黄酮提取工艺参数优化方法及提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄秋葵籽总黄酮提取工艺参数优化方法及提取方法,该方法综合考虑了乙醇浓度、料液比、浸提时间和温度等因素对总黄酮提取的影响,并通过响应面模型对提取条件进行优化,得到一种新的提取工艺,能够高效、准确的提取黄秋葵籽的总黄酮。与现有工艺相比,本发明的提取工艺科学合理、提取时间短、总黄酮提取率高、成本低。
Description
技术领域
本发明属于天然提取物技术领域,具体涉及一种基于响应面法优化黄秋葵籽总黄酮提取工艺参数的方法及黄秋葵黄酮提取方法。
背景技术
黄秋葵(Abelmoschus esculentus L.)属锦葵科(Malvaceae)秋葵属(Abelmoschus Medic),一年生草本,菜药兼用型植物。黄秋葵主食部位为嫩果,富含蛋白质、维生素、胡萝卜素、糖等营养成分,以及黄酮、游离氨基酸等多种生物活性成分。黄酮类物质对人体具有消除活性氧自由基、抗氧化、抗癌、抗肿瘤、抗炎、抗过敏、保肝、保护心脑血管系统等药用保健功效,因此黄秋葵黄酮类物质的含量可作为内在品质的评价指标。
黄秋葵主要以嫩果荚入菜,其黄秋葵籽没有被有效利用,对黄秋葵果实黄酮含量的测定已有许多研究报道,但鲜见有关黄秋葵籽黄酮提取的研究报道。
发明人经检索发现中国公告号为CN105560311A的专利,公开了一种从秋葵中提取秋葵黄酮类化合物的方法,该方法主要是采用聚乙二醇浸渍提取黄秋葵果实黄酮,此法浸渍时间长达0.5-3h。中国公告号为CN105125600A的专利,公开了一种高效提取黄秋葵黄酮的方法,该方法主要是应用超声辅助提取黄秋葵果实黄酮,此法提取时间21min。上述2个专利均以黄秋葵果实为原料,不能明确黄秋葵籽中黄酮含量,而且提取时间较长。此外,2个专利都采用单因数实验设计,只考虑单一变量对结果的影响,未考虑试验因素之间的相互影响,往往会产生系统性错误。除此之外现有技术中,黄秋葵总黄酮浸提时间多在30分钟以上,耗时过长,能耗较高。
发明内容
为克服上述存在之不足,本发明的发明人通过长期的探索尝试以及多次的实验和努力,不断改革与创新,提出一种基于响应面法优化黄秋葵籽总黄酮提取工艺参数的方法,该方法是以黄秋葵籽为材料,以提高黄秋葵籽中总黄酮的得率为目的,采用超声微波协同辅助提取,在单因素试验的基础上,利用响应面法优化提取工艺,为黄秋葵籽黄酮的提取提供技术支持,为黄秋葵资源的综合利用以及提高其附加值提供理论依据。
为达到上述目的,本发明所采用的技术方案是:一种基于响应面法优化黄秋葵籽总黄酮提取工艺参数的方法,其包括以下步骤:
S1:采集黄秋葵嫩果,去果荚,取籽粒,干燥,粉碎得到黄秋葵籽粉末备用;
S2:用乙醇溶液浸提黄秋葵籽粉末中的总黄酮,测定提取液中总黄酮的含量;
S3:选择乙醇浓度、料液比、浸提时间和温度进行单因数试验;
S4:在单因素试验的基础上,根据Box-Behnken设计原则,选取乙醇浓度、料液比、浸提时间和温度为自变量,以黄酮的含量为响应值,建立多元二次方程;
S5:对多元二次方程进行响应面分析,取总黄酮含量为最大值,对黄秋葵籽黄酮的提取条件进行优化,得到最优的提取工艺参数。
根据本发明所提供的基于响应面法优化黄秋葵籽总黄酮提取工艺参数的方法,其进一步地优选技术方案是,在取得最优的提取工艺参数后,再进行黄秋葵籽中总黄酮最佳提取参数的确定和实验验证。
根据本发明所提供的基于响应面法优化黄秋葵籽总黄酮提取工艺参数的方法,其进一步地优选技术方案是,S2中测定提取液中总黄酮含量是按高效液相的方法分析,再根据线性回归方程换算成样品中的黄酮含量,其黄秋葵籽中黄酮含量计算公式如下:
式中:V-高效液相检测时所取的样品进样量(μL),K-萃取液定容体积(mL),m-样品质量,W-据线性回归方程计算出的进样量V所含的黄酮量(μg)。
根据本发明所提供的基于响应面法优化黄秋葵籽总黄酮提取工艺参数的方法,其进一步地优选技术方案是,S3中进行单因数试验时,分析各因素对总黄酮得率的影响,固定微波功率100W,选取乙醇体积分数、料液比、提取温度、浸提时间4个因素依次进行单因数试验,其中选择乙醇体积分数为:50%、60%、70%、80%、90%;料液比为:1:25、1:35、1:45、1:55、1:65;提取温度为:40℃、45℃、50℃、55℃、60℃;浸提取时间:3min、5min、7min、9min、11min。
根据本发明所提供的基于响应面法优化黄秋葵籽总黄酮提取工艺参数的方法,其进一步地优选技术方案是,在S4中建立多元二次方程时,是根据实验数据进行多元回归拟合,获得黄秋葵籽中黄酮含量对编码自变量乙醇浓度、提取时间、温度、料液比的二次多项回归,根据实验结果建立的数学模型,建立数学模型后对黄秋葵籽中黄酮提取的数学模型进行显著性检验。
根据本发明所提供的基于响应面法优化黄秋葵籽总黄酮提取工艺参数的方法,其进一步地优选技术方案是,在S5中,选取最佳工艺参数时,在选取的4个因素范围内,黄酮含量选最大,据回归模型通过Design-Expert 8.0.6软件分析得出,黄秋葵籽中总黄酮最佳提取工艺参数。
本发明还提供了一种黄秋葵籽总黄酮提取方法,其包括以下步骤:
S1:采用上述的基于响应面法优化黄秋葵籽总黄酮提取工艺参数的方法确定提取过程中所需的乙醇浓度、超声-微波协同辅助提取时间、提取温度、料液比;
S2:采集黄秋葵嫩果,去果荚,取籽粒,干燥,粉碎得到黄秋葵籽粉末备用;
S3:将S2中得到的黄秋葵籽粉末加入乙醇中,并采用超声-微波辅助提取黄秋葵黄酮,得到提取液,最后抽滤得到黄秋葵黄酮;该步中乙醇浓度、加入后黄秋葵粉末后的料液比、提取温度及超声-微波辅助提取时间为S1中确认的参数。
根据本发明所提供的一种黄秋葵籽总黄酮提取方法,其进一步地技术方案是在该提取方法步骤中S3所述的乙醇浓度为50%-90%,料液比为1:25-65,提取温度为40℃-60℃,浸提时间为3min-11min。
根据本发明所提供的一种黄秋葵籽总黄酮提取方法,其进一步地技术方案是在该提取方法中所述乙醇浓度为72%,料液比为1:35,提取温度为60℃,浸提时间为338S。
根据本发明所提供的一种黄秋葵籽总黄酮提取方法,其进一步地技术方案是在该提取方法中所述黄秋葵籽粉末为80-120目,干燥温度为30℃-50℃。
本发明中所述的响应曲面法(Response surface methodology,RSM):是由英国统计学家G.Box于20世纪50年代初提出的一种优化生物过程的统计学试验设计,通过建立连续变量三维曲面模型,对影响生物过程变量及其交互作用进行评价,确定最佳变量范围,从而求出最优工艺参数。
相比现有技术,本发明的技术方案具有如下优点:
现有技术中影响黄酮提取率的因素很多,如:提取时间、温度、萃取剂浓度、料液比等,以往对黄秋葵黄酮提取条件的优化多采用单因数或者正交试验法,不能考察各变量之间的交互作用。与之相比,本发明是利用响应面法通过建立连续变量三维曲面模型,对影响过程的因子及其交互作用进行评价和优化,能解决多变量问题,因此所求出的最优工艺参数准确可靠。
现有的提取方法,耗时长、效率低,而经过本发明优化后采用超声-微波辅同提取,提取时间仅为338秒,快速高效。
本发明提供的一种黄秋葵籽中总黄酮的提取工艺参数优化方法,是在综合考虑了乙醇浓度、料液比、浸提时间和温度等因素对总黄酮提取的影响,并通过响应面模型对提取条件进行优化,得到新的提取工艺参数,能够高效、准确的提取黄秋葵籽中的总黄酮。采用本方法优化后的工艺与现有工艺相比,本发明的提取工艺科学合理、提取时间短、总黄酮得率高、成本低。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案,下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是绘制的标准曲线。
图2是芦丁标品及样品色谱图。
图3乙醇体积分数对总黄酮得率的影响曲线图。
图4料液比对总黄酮得率的影响曲线图。
图5温度对总黄酮得率的影响曲线图。
图6时间对总黄酮得率的影响曲线图。
图7是Box-Benhnken响应面分析实验因素与水平表。
图8是响应面分析方案及实验结果表。
图9是回归方差分析表。
图10是乙醇浓度和时间交互作用响应面图。
图11是乙醇浓度和温度交互作用响应面图。
图12是温度和时间交互作用响应面图。
图13是乙醇浓度和料液比交互作用响应面图。
图14是时间与料液比交互作用响应面图
图15是温度与料液比交互作用响应面图
具体实施方式
本发明实施方式中对附图进行详细说明,对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施方式是本发明一部分实施方式,而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式都属于本发明保护的范围。因此,以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围,而是仅仅表示本发明的选定实施方式。
实施例
一种基于响应面法优化黄秋葵籽总黄酮提取工艺参数的方法包括以下过程:
(1)采集黄秋葵嫩果,去果荚,收集籽粒,置40℃烘箱烘干至恒重,粉碎后过100目备用。
(2)芦丁标准溶液的配制及标准曲线的制定
准确称取芦丁标准品15.00mg,用甲醇(色谱纯)溶解并定容至100mL容量瓶中,得浓度为0.15mg/mL的芦丁标准溶液。采用高效液相法,安捷伦G1329B自动进样器吸取0.2μL、0.4μL、1.0μL、3.0μL、5.0μL,按高效液相的方法分析。
绘制的标准曲线如图1,芦丁标品及样品色谱图如图2。由图1可知,芦丁标品质量在0.03-0.75μg范围内与峰面积呈极好线性关系,其回归方程为Y=2388X﹣8.137(R2=0.9999)。图2可知,样品色谱图中的被检物色谱峰与其它色谱峰完全分离。
(3)黄秋葵籽中黄酮含量分析
黄秋葵籽中黄酮含量
色谱柱:ZORBAX SB-C18 4.6mm×150mm 5μm;
流动相:D为0.05‰(V/V)磷酸水65%,C为甲醇33%,B为2%乙腈,临用前分别用0.45μm水相、有机相滤膜过滤,超声脱气;流速0.9mL/min;柱温25℃;检测波长360nm;进样量据样品的黄酮响应信号在芦丁标准曲线的响应信号范围内。分析周期为28min。
用1mL蓝芯注射器及针头取待分析的黄秋葵籽提取液润洗3次,取约1.0ml用0.45μm混合相滤头过滤,进样2μL,按高效液相的方法分析,根据线性回归方程换算成样品中的黄酮含量,其黄秋葵籽中黄酮含量计算公式如下:
式中:V-样品进样量(本实施例为2μL),K-萃取液定容体积(本实施例为50mL),m-样品质量(本实施例为0.500g),W-据线性回归方程计算出的样品进样量V(本实施例为2μL)所含的黄酮量(μg)。
(4)黄秋葵籽中黄酮提取单因素试验
研究各因素对黄酮得率的影响,固定微波功率100W,超声自动开。选取乙醇体积分数、料液比、提取温度、浸提时间4个因素依次进行单因数试验。分别考察乙醇体积分数:50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液;料液比:1:25、1:35、1:45、1:55、1:65(g/mL);提取温度:40℃、45℃、50℃、55℃、60℃;浸提取时间:3min、5min、7min、9min、11min,对黄秋葵籽总黄酮得率的影响。结果如图3-图6所示。
(5)响应面试验
在单因素试验的基础上,根据Box-Behnken设计原则,采用Design-Expert8.0.6分析软件,以芦丁的含量为响应值,选取乙醇浓度(A)、提取时间(B)、温度(C)、料液比(D)4个因素为自变量,设计四因素三水平的响应面实验,对黄秋葵籽黄酮的提取条件进行优化,实验因素及水平设计见附图7,响应面试验设计与结果见附图8,数据的方差分析结果见附图9。
模型方程的建立与显著性检验
利用Design-Expert 8.0.6统计软件,对附图9中实验数据进行多元回归拟合,获得黄秋葵籽中黄酮含量对编码自变量乙醇浓度、提取时间、温度、料液比的二次多项回归。根据实验结果建立的数学模型为:
Y=0.49+4.525×10-3A-2.858×10-3B+6.508×10-3C+5.258×10-3D-0.012AB-8.750×10-4AC-6.350×10-3AD-0.010BC+8.825×10-3BD-0.031CD-0.043A2-0.016B2-9.337×10-3C2-3.875×10-4D2。
根据附图9中的方差分析表明,回归方程具有极高度的显著性(p≤0.01),R2=0.9754,调整R2=0.9507,表明响应值黄秋葵籽中总黄酮含量实际值与预测值之间具有较好的拟合度。
对黄秋葵籽中黄酮提取的数学模型进行显著性检验,结果见附图9。由附图9中显示可知,一次项C和D极显著(p≤0.01),说明提取温度和液料比对黄秋葵籽中黄酮得率有极显著影响,一次项A显著(p≤0.05),说明乙醇浓度对黄秋葵籽中黄酮得率有显著影响。
交互作用响应面图见图10-15,由图可知;
交互项AB、BC、BD、CD极显著(p≤0.01),说明乙醇浓度和时间、时间和温度、提取时间和料液比、温度和料液比交互项对黄秋葵籽中总黄酮得率有极显著影响。
交互项AD显著(p≤0.05),说明乙醇浓度和料液比交互项对黄秋葵籽中总黄酮得率有显著影响。
交互项AC不显著(p≥0.05),说明乙醇浓度和温度交互项对黄秋葵籽中总黄酮得率无显著影响。
二次项A、B、C对黄秋葵籽中总黄酮提取率也有极显著影响(p≤0.01),二次项D对黄秋葵籽中总黄酮得率无显著影响(p≥0.05)。
黄秋葵籽中总黄酮最佳提取条件的确定和实验验证
在选取A、B、C、D因素的范围内,黄酮含量选最大,预测Alpha:0.05,据回归模型通过Design-Expert 8.0.6软件分析得出,黄秋葵籽中总黄酮最佳提取工艺参数为:乙醇浓度72.04%、超声-微波协同辅助提取时间338.21S、提取温度60℃、料液比1:35(g/mL),黄秋葵籽中总黄酮得率预测值为0.52%。考虑到实际操作的便利,将提取条件修正为:超声-微波协同提取时间338S、提取温度60℃、乙醇浓度72%、料液比1:35(g/mL)。为了验证预测结果的可靠性,采用上述最优条件进行实验验证,测得黄秋葵籽中总黄酮得率为0.51%,与预测值0.52%非常接近,说明基于响应曲面法优化所得的提取工艺参数可靠,适用于对黄秋葵籽中总黄酮的超声-微波协同提取。
综上所述:在单因素实验基础上,利用实验设计软件Design-Expert 8.0.6,采用响应面法建立了黄秋葵籽中总黄酮提取工艺条件的二次多项式数学模型,各因子对响应值的影响进行了分析。结果表明模型拟合程度较高,实验误差较小。优化得到的黄秋葵籽中总黄酮提取工艺条件为超声-微波协同提取时间为338S、温度为60℃、乙醇浓度为72%、料液比为1:35(g/mL)。
本实施例利用上述最佳工艺进行黄秋葵黄酮的提取,具体操作如下:
首先采集黄秋葵嫩果,去果荚,取籽粒,干燥,粉碎得到黄秋葵籽粉末备用;干燥温度可以选择30℃-50℃,本实施例采用在40℃进行干燥,黄秋葵粉末可以是80-120目,本实施例粉碎为100目。
然后取上述得到的黄秋葵籽粉末0.5g加入乙醇中,并采用超声-微波辅助提取黄秋葵黄酮,得到提取液,其中乙醇浓度、料液比、提取温度及超声-微波辅助提取时间为上述优化过程中所确定的最优参数;即是乙醇浓度为72%,料液比为1:35,提取温度为60℃,浸提时间为338S。
将得到的黄酮的萃取液真空抽滤,得到黄秋葵黄酮。然后再用浸提所用浓度的乙醇溶液定容至50ml,按如下公式计算黄秋葵籽中总黄酮含量,公式为:
式中:V-高效液相检测样品进样量(μL),K-萃取液定容体积(mL),m-样品质量,W-据线性回归方程计算出的进样量V中所含的黄酮量(μg)。本实施例中V为2,K为50,m为0.5g,从而得出本实施例中黄酮得率为0.51%。
由此可见该优化的提取工艺,采用优化后的参数提取黄酮时,黄酮得率保持与预测值基本一致的情况下,即与采用现有技术最终提取黄酮量相同,但是浸提时间仅为338S,相对现有技术中的0.5-3h大幅缩短,提升了提取效率,降低能耗。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出的是,上述优选实施方式不应视为对本发明的限制,本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明的精神和范围内,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于响应面法优化黄秋葵籽总黄酮提取工艺参数的方法,其特征在于包括以下步骤:
S1:采集黄秋葵嫩果,去果荚,取籽粒,干燥,粉碎得到黄秋葵籽粉末备用;
S2:用乙醇溶液浸提黄秋葵籽粉末中的总黄酮,测定提取液中总黄酮的含量;
S3:选择乙醇浓度、料液比、浸提时间和温度进行单因数试验;
S4:在单因素试验的基础上,根据Box-Behnken设计原则,选取乙醇浓度、料液比、浸提时间和温度为自变量,以黄酮的含量为响应值,建立多元二次方程;
S5:对多元二次方程进行响应面分析,取总黄酮含量为最大值,对黄秋葵籽黄酮的提取条件进行优化,得到最优的提取工艺参数。
2.根据权利要求1所述基于响应面法优化黄秋葵籽总黄酮提取工艺参数的方法,其特征在于,在取得最优的提取工艺参数后,再进行黄秋葵籽中总黄酮最佳提取参数的确定和实验验证。
3.根据权利要求1所述的基于响应面法优化黄秋葵籽总黄酮提取工艺参数的方法,其特征在于,S2中测定提取液中总黄酮含量是按高效液相的方法分析,再根据线性回归方程换算成样品中的黄酮含量,其黄秋葵籽中总黄酮得率计算公式如下:
式中:V-高效液相检测样品进样量(μL),K-萃取液定容体积(mL),m-样品质量,W-据线性回归方程计算出的进样量V所含的黄酮量。
4.根据权利要求1所述的基于响应面法优化黄秋葵籽总黄酮提取工艺参数的方法,其特征在于,S3中进行单因数试验时,分析各因素对总黄酮得率的影响,固定微波功率100W,选取乙醇体积分数、料液比、提取温度、浸提时间4个因素依次进行单因数试验,其中选择乙醇体积分数为:50%、60%、70%、80%、90%;料液比为:1:25、1:35、1:45、1:55、1:65;提取温度为:40℃、45℃、50℃、55℃、60℃;浸提取时间:3min、5min、7min、9min、11min。
5.根据权利要求1所述的基于响应面法优化黄秋葵籽总黄酮提取工艺参数的方法,其特征在于,在S4中建立多元二次方程时,是根据实验数据进行多元回归拟合,获得黄秋葵籽中黄酮含量对编码自变量乙醇浓度、提取时间、温度、料液比的二次多项回归,根据实验结果建立的数学模型,建立数学模型后对黄秋葵籽中黄酮提取的数学模型进行显著性检验。
6.根据权利要求1所述的基于响应面法优化黄秋葵籽总黄酮提取工艺参数的方法,其特征在于,在S5中,选取最佳工艺参数时,在选取的4个因素范围内,黄酮含量选最大,据回归模型通过Design-Expert 8.0.6软件分析得出,黄秋葵籽中总黄酮最佳提取工艺参数。
7.一种黄秋葵籽总黄酮提取方法,其特征在于该提取过程如下:
S1:采用权利要求1-6任一项所述的基于响应面法优化黄秋葵籽总黄酮提取工艺参数的方法确定提取过程中所需的乙醇浓度、超声-微波协同辅助提取时间、提取温度、料液比;
S2:采集黄秋葵嫩果,去果荚,取籽粒,干燥,粉碎得到黄秋葵籽粉末备用;
S3:将S2中得到的黄秋葵籽粉末加入乙醇中,并采用超声-微波辅助提取黄秋葵黄酮,得到提取液,最后抽滤得到黄秋葵黄酮;该步中乙醇浓度、料液比、提取温度及超声-微波辅助提取时间为S1中的确认值。
8.根据权利要求7所述的一种黄秋葵籽总黄酮提取方法,其特征在于S3中所述的乙醇浓度为50%-90%,料液比为1:25-65,提取温度为40℃-60℃,浸提时间为3min-11min。
9.根据权利要求8所述的一种黄秋葵籽总黄酮提取方法,其特征在于所述乙醇浓度为72%,料液比为1:35,提取温度为60℃,浸提时间为338S。
10.根据权利要求7所述的一种黄秋葵籽总黄酮提取方法,其特征在于所述黄秋葵籽粉末为80-120目,干燥温度为30℃-50℃。
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