CN104961792A - 藕节中白桦脂酸和多糖的提取方法及测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种藕节中白桦脂酸及多糖的提取方法及含量测定方法，本发明采用Box-BehnkenDesignS(BBD)中心组合设计模型的响应面分析法，用3个变化因子、3个水平及少量的实验组优化出藕节中白桦脂酸和多糖的最佳提取方法，获得最佳产率，本发明优选得到的提取方法在提高效率的同时，可降低能耗和污染物排放，具有工业化生产的实际意义。本发明通过大量实验筛选出藕节中白桦脂酸和多糖含量的测定方法，操作简单、实用性强，可为藕节白桦脂酸及多糖的高效利用提供科学依据。
Description
技术领域
本发明属于植物利用技术领域，涉及一种藕节中多糖和白桦脂酸的综合提取方法，尤其涉及一种利用响应曲面法优化藕节多糖和白桦脂酸的提取方法。
背景技术
藕节为睡莲科植物莲NelumbonuciferaGaerth.的干燥根茎节部，为莲藕的非食用部分，不仅是良好的滋补品，而且是很好的中药材，具有凉血、化瘀、止血的功效。我国浙江、江苏、湖北、山东等地莲藕资源丰富，多数藕节被当作废物处理，不仅浪费宝贵的中药资源，而且对环境造成一定的污染和破坏。
白桦脂酸是一种三萜类化合物，具有抗肿瘤细胞生长的作用，对肿瘤细胞具有广谱细胞毒性，而对正常细胞没有伤害，是极有开发前景的药物。藕节中含有白桦脂酸，已有报道从藕节中分离出白桦脂酸的构象异构体表白桦脂酸，专利号为CN101768200A的中国专利于2010年7月7日公开了藕节中表白桦脂酸的提取工艺。
现有技术中还没有实现综合对藕节中的白桦脂酸和多糖的综合提取利用的稳定可靠的方法。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺设计合理，操作方便简单，稳定可靠，提取效率高，提取得到的白桦脂酸和多糖纯度高，易于工业化生产的利用响应曲面法优化藕节多糖和白桦脂酸的提取方法。本发明另一个目的是提供藕节中多糖和白桦脂酸的测定方法。
技术方法：为解决上述问题，本发明采用的技术方案为：
一种藕节中白桦脂酸和多糖的提取方法，其包括以下步骤：
(1)白桦脂酸的提取：取藕节，粉碎过40目筛，加入藕节粗粉重量40～50倍体积量的乙醇，50Hz～100Hz的超声频率，可预浸泡0.5h，超声提取1～3次，每次100min，得到白桦脂酸；
(2)多糖的提取：取步骤(1)提取白桦脂酸后的藕节滤渣，依次用无水乙醇、乙酸乙酯洗涤，挥干乙醇和乙酸乙酯，加入藕节滤渣重量40～50倍量体积的水，然后在95℃～100℃温度加热回流提取1～3次，每次125min，提取得到多糖。
作为优选方案，以上所述的藕节中白桦脂酸和多糖的提取方法，步骤(1)中加入藕节粗粉重量49倍量体积的乙醇，乙醇体积浓度为95％。
作为优选方案，以上所述的藕节中白桦脂酸和多糖的提取方法，步骤(2)中加入藕节滤渣重量50倍量体积的水，然后在95℃温度加热回流提取1～3次，每次125min。
本发明所述的藕节中白桦脂酸和多糖的测定方法，其包括以下步骤：
(1)白桦脂酸样品与多糖的溶液制备
白桦脂酸的提取：取藕节，粉碎过40目筛，加入藕节粗粉重量40～50倍体积量的乙醇，50Hz～100Hz的超声频率，超声提取1～3次，每次100min，提取液抽滤后进行8000r/min离心10min，过0.44μm滤膜，得到白桦脂酸待测液；
多糖的提取：取步骤(1)提取白桦脂酸后的藕节滤渣，依次用无水乙醇、乙酸乙酯洗涤，挥干乙醇和乙酸乙酯，加入藕节滤渣重量40～50倍量体积的水，然后在95℃～100℃温度加热回流提取1～3次，每次125min，提取得到多糖，8000r/min离心10min，精密量取上清液进行酸性、中性多糖测定；
(2)白桦脂酸及多糖标准品的配置和标准曲线的建立
①标准品溶液制备
白桦脂酸对照品溶液的制备：精密称取白桦脂酸3.12mg，置5mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，得到624μg/mL浓度白桦脂酸的对照品溶液；
葡萄糖对照品溶液制备：精密称取12.61mg葡萄糖于100mL容量瓶内，用蒸馏水定容至100mL，得到0.1261mg/mL浓度的葡萄糖溶液；
葡萄糖醛酸对照品溶液制备：精密称取11.22mg葡糖糖醛酸置于100mL容量瓶内，用蒸馏水定容至100mL，得到0.1122mg/mL浓度的葡糖糖醛酸溶液；
②白桦脂酸测定色谱条件及多糖测定方法
取规格为150mm×4.6mm，5μm的Apollo C18色谱柱；流动相：A相为乙腈，B相为0.2％磷酸水溶液，A相和B相体积比为80：20等度洗脱，流速：1mL/min，检测波长：207nm，柱温：30℃，进样体积：20μL；
精密量取多糖提取液补足至1mL，加入5％的苯酚2mL摇匀，再加入浓硫酸7mL摇匀，置沸水浴20min，用紫外分光度计在490nm波长下测定；
精密量取多糖提取液补足至1mL，加入12.5mmol/L四硼酸钠硫酸溶液5mL，沸水浴加热10min，加入0.125％咔唑0.2mL，再沸水浴15min，用紫外分光光度计在512nm波长下测定；
③标准曲线建立
取系列浓度的白桦脂酸，葡萄糖对照品和葡萄糖醛酸对照品按上述②方法测定，建立白桦脂酸，葡萄糖醛酸及葡萄糖的标准曲线，如下表：
葡萄糖、葡萄糖醛酸及白桦脂酸标准曲线
(3)测定藕节白桦脂酸及多糖含量
取步骤(1)制备得到的白桦脂酸样品与多糖的溶液，按以上步骤(2)方法和白桦脂酸，葡萄糖醛酸及葡萄糖的标准曲线测定白桦脂酸样品与多糖的溶液中白桦脂酸，葡萄糖醛酸及葡萄糖的含量。
作为优选方案，以上所述的藕节中白桦脂酸和多糖的测定方法，步骤(1)中加入藕节粗粉重量49倍量体积的乙醇，乙醇体积浓度为95％。
作为优选方案，以上所述的藕节中白桦脂酸和多糖的测定方法，步骤(1)中加入藕节滤渣重量50倍量体积的水，然后在95℃温度加热回流提取1～3次，每次125min。
藕节中白桦脂酸和多糖的提取方法的优选实验：
(1)白桦脂酸实验设计与统计分析
单因素实验
提取白桦脂酸时依次改变提取溶剂乙醇浓度、提取时间、料液比、超声频率、预浸时间、提取次数进行单因素试验，用HPLC法测定所得的藕节白桦脂酸提取液中白桦脂酸的含量，并按下式计算白桦脂酸产率，每次处理重复三次。
白桦脂酸产率(％)＝(提取液中白桦脂酸质量/藕节干重总质量)×100％
响应面曲线法
根据单因素试验结果，选取白桦脂酸提取效果影响较显著的提取溶剂乙醇浓度、提取时间、料液比这3个因素，利用Design-Expert8.0软件根据Box-Behnken设计原则进行实验设计，以乙醇浓度A、料液比B、提取时间C为自变量，以白桦脂酸的产率为响应值Y，建立多元二次回归方程:Y＝0.6+0.087A+0.035B+0.034C+0.030AB-0.025AC+0.014BC-0.045A2-0.029B2-0.044C2。
(2)多糖实验设计与统计分析
单因素实验
提取藕节多糖时依次改变提取温度、提取时间、料液比、预浸时间、提取次数进行单因素试验，用苯酚-硫酸法测定中性多糖，咔唑-硫酸法测定酸性多糖得到酸性、中性多糖含量，并按下式计算多糖产率，每次处理重复三次。
中性多糖产率(％)＝(提取液中酸性多糖质量/藕节干重总质量)×100％
酸性多糖产率(％)＝(提取液中酸性多糖质量/藕节干重总质量)×100％
响应面曲线法
根据单因素试验结果，选取多糖提取效果影响较显著的提取温度、提取时间、料液比这3个因素，利用Design-Expert8.0软件根据Box-Behnken设计原则进行实验设计，以提取温度A、提取时间B、料液比C为自变量，以多糖的产率为响应值Y，建立多元二次回归方程:Y＝8.39+11.05A+1.06B+1.60C+1.44AB+2.74AC+1.24BC-6.98A2-1.22B2-2.50C2。
(3)实验结果分析与优化
利用Design-Expert8.0软件根据多元二次回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应面及其等高线图，优化出上述技术方案中最佳的白桦脂酸和多糖的提取工艺条件。
有益效果：本发明与现有技术相比具有以下优点
1、本发明利用响应曲面法优选出最佳的藕节中白桦脂酸和多糖的最佳提取方法，与正交法相比，本发明采用Box-BehnkenDesignS(BBD)中心组合设计模型的响应面分析法，用3个变化因子、3个水平及少量的实验组(仅17组实验)优化出藕节中白桦脂酸和多糖的最佳提取方法，获得最佳产率，本发明优选得到的提取方法在提高提取效率的同时，可降低能耗和污染物排放，具有工业化生产的实际意义。
2、本发明利用响应曲面法优选出最佳的藕节中白桦脂酸和多糖的最佳提取方法，然后通过大量实验筛选出藕节中白桦脂酸和多糖含量的测定方法，操作简单、实用性强，为藕节白桦脂酸及多糖的高效利用提供科学依据。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1白桦脂酸对照品HPLC色谱图
图2藕节样品HPLC色谱图
图3醇浓度和料液比交互作用影响白桦脂酸提取率的响应面和等高线图
图4醇浓度和提取时间交互作用影响白桦脂酸提取率的响应面和等高线图
图5料液比和提取时间交互作用影响白桦脂酸提取率的响应面和等高线图
图6提取温度和提取时间交互作用影响多糖提取率的响应面和等高线图
图7提取温度和料液比交互作用影响多糖提取率的响应面和等高线图
图8提取时间和料液比交互作用影响多糖提取率的响应面和等高线图
图9各提取单因素对藕节白桦脂酸提取率的影响曲线
图10各提取单因素对藕节多糖提取率的影响曲线图
具体实施方式
实施例1 响应面曲线法实验设计与统计分析
①白桦脂酸实验设计与统计分析
单因素实验
提取白桦脂酸时依次改变提取溶剂乙醇浓度、提取时间、料液比、超声频率、预浸时间、提取次数进行单因素试验，用HPLC法测定所得的藕节白桦脂酸提取液中白桦脂酸的含量，并按下式计算白桦脂酸产率，每次处理重复三次。
白桦脂酸产率(％)＝(提取液中白桦脂酸质量/藕节干重总质量)×100％
响应面曲线法
根据单因素试验结果，选取白桦脂酸提取效果影响较显著的提取溶剂乙醇浓度、提取时间、料液比这3个因素，利用DesignExpert8.0软件根据Box-Behnken设计原则进行实验设计(设定结果见表1)，以乙醇浓度A、料液比B、提取时间C为自变量，以白桦脂酸的产率为响应值Y(实验方案及结果见表2)，建立多元二次回归方程:Y＝0.6+0.087A+0.035B+0.034C+0.030AB-0.025AC+0.014BC-0.045A2-0.029B2-0.044C2。
各因子与响应值之间线性关系显著性，由F值检验来判定，P值越小，则说明变量的显著性越高。由方差分析表(表3)可知，其因变量和全体自变量之间的线性关系显著(R2＝0.9309)，模型显著水平小于0.05，所以该回归方程模型是高度显著的。
表1 藕节白桦脂酸提取响应面分析因素及与水平
表2 三因素三水平响应面曲线分析藕节白桦脂酸试验设计与结果
表3 二次回归模型方差分析
②多糖实验设计与统计分析
单因素实验
提取藕节多糖时依次改变提取温度、提取时间、料液比、预浸时间、提取次数进行单因素试验，用苯酚-硫酸法测定中性多糖，咔唑-硫酸法测定酸性多糖得到酸性、中性多糖含量，并按下式计算多糖产率，每次处理重复三次。
中性多糖产率(％)＝(提取液中酸性多糖质量/藕节干重总质量)×100％
酸性多糖产率(％)＝(提取液中酸性多糖质量/藕节干重总质量)×100％
响应面曲线法
根据单因素试验结果，选取多糖提取效果影响较显著的提取温度、提取时间、料液比这3个因素，利用Design-Expert8.0软件根据Box-Behnken设计原则进行实验设计(设定结果见表4)，以提取温度A、提取时间B、料液比C为自变量，以多糖的产率为响应值Y(实验方案及结果见表5)，建立多元二次回归方程:Y＝8.39+11.05A+1.06B+1.60C+1.44AB+2.74AC+1.24BC-6.98A2-1.22B2-2.50C2。
各因子与响应值之间线性关系显著性，由F值检验来判定，P值越小，则说明变量的显著性越高。由方差分析表(表6)可知，其因变量和全体自变量之间的线性关系显著(R2＝0.9684)，模型显著水平小于0.0001，所以该回归方程模型是极显著的。
表4 藕节多糖提取响应面分析因素及与水平
表5 三因素三水平响应面曲线分析藕节白桦脂酸试验设计与结果
表6 二次回归模型方差分析
③实验结果分析与优化
利用Design-Expert8.0软件根据多元二次回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应面及其等高线图(图3～10)。
通过以上响应曲面法优化得到的藕节中白桦脂酸和多糖的最佳提取方法包括以下步骤：
(1)白桦脂酸的提取：取藕节，粉碎过40目筛，加入藕节粗粉重量49倍体积量的乙醇，乙醇为体积浓度为95％的乙醇，50Hz～100Hz的超声频率，超声提取1～3次，每次100min，得到白桦脂酸；白桦脂酸提取率最高，为0.665％；
(2)多糖的提取：取步骤(1)提取白桦脂酸后的藕节滤渣，依次用无水乙醇、乙酸乙酯洗涤，挥干乙醇和乙酸乙酯，加入藕节滤渣重量50倍量体积的水，然后在95℃温度加热回流提取1～3次，每次125min，提取得到多糖，多糖提取率为15.64％。
实施例2藕节中白桦脂酸和多糖的测定方法，其包括以下步骤：
(1)白桦脂酸样品与多糖的溶液制备
白桦脂酸的提取：取藕节500g，粉碎过40目筛，加入藕节粗粉重量49倍体积量的乙醇，乙醇为体积浓度为95％的乙醇，超声提取1～3次，每次100min，提取液抽滤后进行8000r/min离心10min，过0.45μm滤膜，得到白桦脂酸待测液；
多糖的提取：取步骤(1)提取白桦脂酸后的藕节滤渣，依次用无水乙醇、乙酸乙酯洗涤，挥干乙醇和乙酸乙酯，加入藕节滤渣重量50倍量体积的水，然后在95℃温度加热回流提取1～3次，每次125min，提取得到多糖，8000r/min离心10min，精密量取上清液进行酸性、中性多糖测定；
(2)白桦脂酸及多糖标准品的配置和标准曲线的建立
①标准品溶液制备
白桦脂酸对照品溶液的制备：精密称取白桦脂酸3.12mg，置5mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，得到624μg/mL浓度白桦脂酸的对照品溶液；
葡萄糖对照品溶液制备：精密称取12.61mg葡萄糖于100mL容量瓶内，用蒸馏水定容至100mL，得到0.1261mg/mL浓度的葡萄糖溶液；
葡萄糖醛酸对照品溶液制备：精密称取11.22mg葡糖糖醛酸置于100mL容量瓶内，用蒸馏水定容至100mL，得到0.1122mg/mL浓度的葡糖糖醛酸溶液；
②白桦脂酸测定色谱条件及多糖测定方法
取规格为150mm×4.6mm，5μm的Apollo C18色谱柱；流动相：A相为乙腈，B相为0.2％磷酸水溶液，A相和B相体积比为80：20等度洗脱，流速：1mL/min，检测波长：207nm，柱温：30℃，进样体积：20μL；
精密量取多糖提取液补足至1mL，加入5％的苯酚2mL摇匀，再加入浓硫酸7mL摇匀，置沸水浴20min，用紫外分光度计在490nm波长下测定；
精密量取多糖提取液补足至1mL，加入12.5mmol/L四硼酸钠硫酸溶液5mL，沸水浴加热10min，加入0.125％咔唑0.2mL，再沸水浴15min，用紫外分光光度计在512nm波长下测定；
③标准曲线建立
取系列浓度的白桦脂酸，葡萄糖对照品和葡萄糖醛酸对照品按上述②方法测定，建立白桦脂酸，葡萄糖醛酸及葡萄糖的标准曲线，如下表：
葡糖糖、葡萄糖醛酸及白桦脂酸标准曲线
(3)测定藕节白桦脂酸及多糖含量
取步骤(1)制备得到的白桦脂酸样品与多糖的溶液，按以上步骤(2)方法和白桦脂酸，葡萄糖醛酸及葡萄糖的标准曲线测定白桦脂酸样品与多糖的溶液中白桦脂酸3.5g，酸性多糖10g及中性多糖68g的含量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明思路的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种藕节中白桦脂酸和多糖的提取方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)白桦脂酸的提取：取藕节，粉碎过40目筛，加入藕节粗粉重量40～50倍体积量的乙醇，50Hz～100Hz的超声频率，超声提取1～3次，每次100min，得到白桦脂酸；
(2)多糖的提取：取步骤(1)提取白桦脂酸后的藕节滤渣，依次用无水乙醇、乙酸乙酯洗涤，挥干乙醇和乙酸乙酯，加入藕节滤渣重量40～50倍量体积的水，然后在95℃～100℃温度加热回流提取1～3次，每次125min，提取得到多糖。
2.根据权利要求1所述的利用响应曲面法优化的藕节中白桦脂酸和多糖的提取方法，其特征在于，步骤(1)中加入藕节粗粉重量49倍量体积的乙醇，乙醇体积浓度为95％。
3.根据权利要求1所述的利用响应曲面法优化的藕节中白桦脂酸和多糖的提取方法，其特征在于，步骤(2)中加入藕节滤渣重量50倍量体积的水，然后在95℃温度加热回流提取1～3次，每次125min。
4.藕节中白桦脂酸和多糖的测定方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)白桦脂酸样品与多糖的溶液制备
白桦脂酸的提取：取藕节，粉碎过40目筛，加入藕节粗粉重量40～50倍体积量的乙醇，50Hz～100Hz的超声频率，超声提取1～3次，每次100min，提取液抽滤后进行8000r/min离心10min，过0.44μm滤膜，得到白桦脂酸待测液；
多糖的提取：取步骤(1)提取白桦脂酸后的藕节滤渣，依次用无水乙醇、乙酸乙酯洗涤，挥干乙醇和乙酸乙酯，加入藕节滤渣重量40～50倍量体积的水，然后在95℃～100℃温度加热回流提取1～3次，每次125min，提取得到多糖，8000r/min离心10min，精密量取上清液进行酸性、中性多糖测定；
(2)白桦脂酸及多糖标准品的配置和标准曲线的建立
①标准品溶液制备
白桦脂酸对照品溶液的制备：精密称取白桦脂酸3.12mg，置5mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，得到624μg/mL浓度白桦脂酸的对照品溶液；
葡萄糖对照品溶液制备：精密称取12.61mg葡萄糖于100mL容量瓶内，用蒸馏水定容至100mL，得到0.1261mg/mL浓度的葡萄糖溶液；
葡萄糖醛酸对照品溶液制备：精密称取11.22mg葡糖糖醛酸置于100mL容量瓶内，用蒸馏水定容至100mL，得到0.1122mg/mL浓度的葡糖糖醛酸溶液；
②白桦脂酸测定色谱条件及多糖测定方法
取规格为150mm×4.6mm，5μm的Apollo C18色谱柱；流动相：A相为乙腈，B相为0.2％磷酸水溶液，A相和B相体积比为80：20等度洗脱，流速：1mL/min，检测波长：207nm，柱温：30℃，进样体积：20μL；
精密量取多糖提取液补足至1mL，加入5％的苯酚2mL摇匀，再加入浓硫酸7mL摇匀，置沸水浴20min，用紫外分光度计在490nm波长下测定；
精密量取多糖提取液补足至1mL，加入12.5mmol/L四硼酸钠硫酸溶液5mL，沸水浴加热10min，加入0.125％咔唑0.2mL，再沸水浴15min，用紫外分光光度计在512nm波长下测定；
③标准曲线建立
取系列浓度的白桦脂酸，葡萄糖对照品和葡萄糖醛酸对照品按上述②方法测定，建立白桦脂酸，葡萄糖醛酸及葡萄糖的标准曲线，如下表：
葡糖糖、葡萄糖醛酸及白桦脂酸标准曲线
(3)测定藕节白桦脂酸及多糖含量
取步骤(1)制备得到的白桦脂酸样品与多糖的溶液，按以上步骤(2)方法和白桦脂酸，葡萄糖醛酸及葡萄糖的标准曲线测定白桦脂酸样品与多糖的溶液中白桦脂酸，葡萄糖醛酸及葡糖糖的含量。
5.根据权利要求4所述的藕节中白桦脂酸和多糖的测定方法，其特征在于步骤(1)中加入藕节粗粉重量49倍量体积的乙醇，乙醇体积浓度为95％。
6.根据权利要求4所述的藕节中白桦脂酸和多糖的测定方法，其特征在于步骤(1)中加入藕节滤渣重量50倍量体积的水，然后在95℃温度加热回流提取1～3次，每次125min。
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| CN109879927A (zh) * | 2019-03-29 | 2019-06-14 | 上海欧润化妆品有限公司 | 一种白睡莲根茎部提取物的提取工艺 |
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- 2015-06-16 CN CN201510332255.2A patent/CN104961792A/zh active Pending
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