CN103033578B - 一种基于内含成分的快速初筛茶树优异资源的方法 - Google Patents

Abstract

一种基于内含成分的快速初筛茶树优异资源的方法，是取生长条件与生长势基本一致的茶树芽头第一片展开叶，用液氮冷冻处理后，将叶片捣碎，直接以甲醇快速提取，离心，取上清液，利用高效液相色谱检测茶叶中内含成分，比较各内含成分含量，从中初步筛选优异茶树种质资源，在此基础之上，采用已知方法对初筛的优异种质资源进一步进行复筛。该方法简便，设备要求低，简化了实验材料前处理工序，大幅度减少了劳动强度，且使用试剂用量少，降低了测定成本与时间，可用于高通量分析。

Description

一种基于内含成分的快速初筛茶树优异资源的方法

技术领域

本发明属于经济作物种质创新技术领域，具体涉及一种基于内含成分的快速初筛茶树优异资源的方法。

背景技术

茶叶是中国重要的经济作物和传统的出口产品，中国茶叶种植面积和年产量均居世界第一位。中国作为茶树原产地，茶区地跨暖温带、亚热带和边缘热带，生态资源和茶树种质资源丰富，是茶树遗传变异的巨大宝藏。据不完全统计，全国各产茶省/区收集入圃保存的各类茶树种质资源已达3000余份，而尚未入圃茶树资源数目更多。这些 茶树优异种质资源是茶树种质创新、品种选育、生产利用的物质基础。然而如何高效快速地筛选优异资源是茶业界尚未解决的重要问题。

虽然分子标记技术的发展使早期鉴定技术从形态、生化水平发展到分子水平，对缩短育种年限和提高育种效率具有重要、现实的意义。其不仅可以定位目标基因，也可利用与目标基因紧密连锁标记追踪目标基因，在育种过程早期对目标性状进行分子标记辅助选择。但是由于茶树遗传背景复杂，茶树分子生物学研究进展缓慢，目前分子标记手段尚未能应用于茶树优异种资源的筛选。因此，化学筛选法仍然是目前茶树优异资源尤其是特异品质化学成分资源筛选的主流手段。

茶叶中富含茶多酚、咖啡碱、氨基酸等内含成分。茶叶的色、香、味和茶叶中含有的多酚类化合物有很大的关系，尤其是色泽和滋味。茶多酚中最主要的是儿茶素类化合物，影响着茶叶的品质，与人体的保健功能有重要的关系。儿茶素类化合物包括很多种儿茶素，最重要的有表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（ECGG）和没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）等几种，EGCG 的含量占儿茶素总量的50%以上，而EGCG和ECG对人体健康的作用引起特别的关注。茶叶中咖啡碱具有提神、兴奋和降脂减肥的功效，但咖啡碱在茶叶中也存在多种不利影响，因此低咖啡碱茶叶往往深受消费者喜爱。茶叶中的氨基酸与茶叶品质密切相关，茶叶中的氨基酸总量可达2～4%，尤其是绿茶中茶氨酸的含量更高，占氨基酸总量的50%以上。茶氨酸具有解除疲劳、降低血压、增效抗癌药物药效和预防人体肝脏损伤的作用。由此可见，茶叶中各种活性成分各自具有其独特的生理活性，同时也发挥综合的协调功能和生理调节作用。不同品种的茶叶中内含成分组成和水平差异较大，这些内含成分是茶树育种者考察的主要指标。而对这些指标的分析，目前采用的方法是将茶叶经干燥，以大量的容积回流提取，过滤获得检测样品，再经色谱方法检测。该方法步骤繁琐，不仅花费大量时间，而且有机溶剂用量大，提取效率低，且需要的材料量大，样品需烘干处理。由此可见，经典的化学筛选法方法无法胜任从大量的茶树资源中筛选出优异种质。因此，建立快速高通量的茶叶内含成分分析方法，快速获取茶树新种质，是突破当前茶树育种和种质创新困境的重要突破口。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种简便、快速且适用于高通量分析的基于内含成分的快速初筛茶树优异资源的方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种基于内含成分的快速初筛茶树优异资源的方法，该方法步骤如下：

1）取各茶树最上端芽头第一片展开叶，无破损地装入2mL塑料离心管，盖上盖子，对各样品进行标记；取样时，要求取样时的茶树为茶树资源生长条件及生长势基本一致、且取样时间点一致的茶树；采集的样品小心放在离心管中，不能破损，可防止因细胞受损导致茶叶内含成分发生化学或物理变化；且离心管的盖子要求盖好，以防样品失水或风干，导致结果误差过大；

2）室温下，对各个样品进行准确称重；

3）盖紧各样品的离心管盖子，于液氮中冷冻30-60s后取出，迅速将叶片捣碎；要求注意液氮不能进入离心管内，捣碎叶片时可用玻璃棒捣碎，也可以加入不锈钢小珠采用振荡器振碎。

4）于各离心管中分别加入1.5 mL分析纯甲醇，盖紧离心管盖子，涡旋30s，60-70℃孵育5-10min，再涡旋1-2min，冷却至室温，高速离心，得上清液；在加入甲醇时，要先用甲醇将玻璃棒或振荡钢珠淋洗，以保证样品无损失。如当天不进行高效液相色谱分析，可将孵育再涡旋、冷却后的甲醇溶液保存于-20℃直到下次分析，但采集的样品要求在当天提取完毕，也就是需得到本步骤中的孵育再涡旋、冷却后的甲醇溶液。

所述高速离心时的转速为12000-14000rpm，时间为2-5min。如果没有高速离心机，也可以使用低速离心机，但离心时间要适当延长。低速离心时，根据仪器的最大转速来确定时间，以使提取液中的不溶物全部沉积到底部为宜。

5）取该上清液作高效液相色谱分析，对比液相色谱数据，根据茶叶内含成分（主要指儿茶素、茶氨酸和咖啡碱）初步确定优异茶树种质资源。在比较分析内含成分水平时，可以单片叶中的总量计算，也可以根据茶叶单位鲜重的量来计算，具体采用什么方式，需根据茶叶实际生产追求的目标来定。色谱分析时可以用紫外检测器、质谱检测器和蒸发光散射检测器等。

采用本发明方法对茶树优异资源进行初步筛选后，根据国标方法（GB/T 8313-2008）进行采样与样品制备，采用高效液相色谱分析，可对初步筛选的结果进一步复筛，此过程为现有技术，在此不再赘述。

上述初筛和复筛中提及的高效液相色谱分析过程的条件如下：

儿茶素、咖啡因液相色谱分析条件：Kromasil^TM C18色谱柱( 5μm,200mm×4.6mm )，柱温为40℃，流速为1mL/min，进样量为10μL，检测波长为278nm，流动相为水(含0.15%醋酸)-乙腈（含0.15%醋酸），体积比为9:1。

茶氨酸液相色谱条件：Kromasil^TM C18色谱柱( 5μm,200mm×4.6mm)，流动相为乙腈-10 mol/L十二烷基磺酸钠(含0.1%的磷酸)水(体积比为3:7)，流速1 mL/min，柱温40℃，检测波长为200nm，进样量10μL。

与现有技术相比，本发明的优点：本发明方法简便，不需进行样品干燥、回流提取及过滤等步骤；取材少，不影响植株的正常生长，适用于珍贵资源的分析；设备要求低，占地面积小；样品制备可在15分钟内完成，大幅度缩短了制备时间；使用试剂用量少，绿色环保，大幅度降低了检测成本；采用本方法制备的样品溶液可用于分析茶叶中茶氨酸、咖啡碱、各种儿茶素、黄酮类化合物、花青素和原花青素等茶叶主要活性物质；本方法可同时完成成千上百个样品的制备，适用于高通量分析。

具体实施方式

下面，本发明将以实施例进行进一步地说明，但是本发明并不限于这些实施例的任一个或类似实例。

实施例1：

以湖南省湘西保靖县葫芦镇黄金村野生茶树资源为考察对象，于2010年4月6号取样，总共采集1000个样品。取样方法是，每一株野生茶树取一个样品，剪切离地面最远的芽头上第一片展开叶，无破损地装入2mL塑料离心管，盖好盖子，标记样品来源。取样完毕，将所采集样品带回实验室。准确称重后，于液氮中冷冻处理30s，取出离心管，打开盖子，迅速用玻璃棒将叶片捣碎，向离心管中加入1.5mL 分析纯甲醇，盖紧离心管盖子，涡旋30 s，60℃孵育10 min，再涡旋1min，冷却至室温，12000 rpm/min高速离心5min，取上清液，利用高效液相色谱分析儿茶素、茶氨酸和咖啡碱的含量（分析条件见前面叙述），以根据茶叶内含成分确定优异茶树种质资源。结果表明，1000株野生茶树中，茶氨酸含量大于0.75%（湿重）的有5株，EGCG含量大于3%（湿重）的有6株。根据高通量检测结果，初步确定上述11株为特异资源。根据国标方法（GB/T 8313-2008），复筛结果表明：茶氨酸含量大于4%（干重）的有1株，EGCG含量大于17%的有2株。高茶氨酸茶叶适合制作高档绿茶，高EGCG茶叶适用于制作高档红茶或EGCG提制。筛选到的3株茶树被认为新的特异种质，可通过无性扩繁获得优良茶树品种。

实施例2：

以湖南省湘西保靖县葫芦镇葫芦村野生茶树资源为考察对象，于2011年4月10号取样，总共采集600个样品。取样方法是，每一株野生茶树取一个样品，剪切离地面最远的芽头上第一片展开叶，无破损地装入2mL塑料离心管，盖好盖子，标记样品来源。取样完毕，将所采集样品带回实验室。准确称重后，于液氮中冷冻处理60s，取出离心管，打开盖子，迅速用玻璃棒将叶片捣碎，向离心管中加入1.5 mL甲醇（分析纯），盖紧离心管盖子，涡旋30s，70℃孵育5min，再涡旋2min，冷却至室温，14000rpm/min高速离心2min，取上清液，利用高效液相色谱分析儿茶素、茶氨酸和咖啡碱的含量（分析条件如前），以根据茶叶内含成分确定优异茶树种质资源。结果表明，600株野生茶树中，茶氨酸含量大于0.75%（湿重）的有3株，EGCG含量大于3%（湿重）的有3株。根据高通量检测结果，初步确定上述6株为特异资源。根据国标方法（GB/T 8313-2008），复筛结果表明：茶氨酸含量大于4%（干重）的有1株，EGCG含量大于17%的有1株。筛选到的2株茶树被认为新的特异种质。

实施例3：

以湖南省邵阳市洞口县高沙镇野生茶树资源资源为考察对象，于2012年4月18号取样，总共采集500个样品。取样方法是，每一株野生茶树取一个样品，剪切离地面最远的芽头上第一片展开叶，无破损地装入2mL塑料离心管，盖好盖子，标记样品来源。取样完毕，将所采集样品带回实验室。准确称重后，于液氮中冷冻处理45s，取出离心管，打开盖子，迅速用玻璃棒将叶片捣碎，向离心管中加入1.5 mL 分析纯甲醇，盖紧离心管盖子，涡旋30s，65℃孵育8 min，再涡旋90s，冷却至室温，13000rpm/min高速离心3min，取上清液，利用高效液相色谱分析儿茶素、茶氨酸和咖啡碱的含量（分析条件见前述），根据茶叶内含成分确定优异茶树种质资源。结果表明，500株野生茶树中，咖啡因含量小于0.2%（湿重）的有3株。根据高通量检测结果，初步确定上述3株为特异资源。根据国标方法（GB/T 8313-2008），复筛结果表明：咖啡因含量小于1%（干重）的有1株，这株茶树被认为新的特异种质，通过无性扩繁可获得新的茶树优良品种，适用于制作低咖啡因茶或提制低咖啡因茶叶提取物。

Claims (5)

1.一种基于内含成分的快速初筛茶树优异资源的方法，其特征在于：该方法步骤如下：

1）取各茶树最上端芽头第一片展开叶，无破损地装入2mL塑料离心管，盖紧盖子，对各样品进行标记；

2）室温下，对各个样品进行准确称重；

3）将各样品于液氮中冷冻30-60s后取出，迅速将叶片捣碎；

4）于各离心管中分别加入1.5mL分析纯甲醇，盖紧离心管盖子，涡旋30s，60-70℃孵育5-10min，再涡旋1-2min，冷却至室温，离心，得上清液；

5）取上述上清液作高效液相色谱分析，对比液相色谱数据，根据茶叶内含成分初步确定优异茶树种质资源；

其中，上述内含成分指儿茶素、咖啡因和茶氨酸，儿茶素、咖啡因的高效液相色谱分析条件：Kromasil^TMC18色谱柱，柱温为40℃，流速为1mL/min，进样量为10μL，检测波长为278nm，流动相为含0.15%醋酸的水-含0.15%醋酸的乙腈，体积比为9:1；

茶氨酸高效液相色谱分析条件：Kromasil^TMC18色谱柱，流动相为乙腈-10mol/L含0.1%磷酸的十二烷基磺酸钠水，体积比为3:7，流速1mL/min，柱温40℃，检测波长为200nm，进样量10μL。

2.如权利要求1所述的一种基于内含成分的快速初筛茶树优异资源的方法，其特征在于：所述步骤1）中取样时的茶树为茶树资源生长条件及生长势基本一致、且取样时间点一致的茶树。

3.如权利要求1所述的一种基于内含成分的快速初筛茶树优异资源的方法，其特征在于：所述步骤3）中的捣碎叶片采用玻璃棒捣碎或加入不锈钢小珠采用振荡器振碎。

4.如权利要求3所述的一种基于内含成分的快速初筛茶树优异资源的方法，其特征在于：所述步骤4）中加入甲醇时，先用甲醇将玻璃棒或振荡钢珠淋洗，离心管内加入的甲醇总量为1.5mL。

5.如权利要求1所述的一种基于内含成分的快速初筛茶树优异资源的方法，其特征在于：所述步骤4）中的离心转速为12000-14000rpm，时间为2-5min。