CN103432196A - 金钱草总黄酮及金钱草总黄酮和总多糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了金钱草总黄酮，所述总黄酮中，黄酮含量以芦丁计为50%～60%w/w，槲皮素和山奈素总含量为4%～5%w/w。本发明还提供了从金钱草中同时提取总黄酮和总多糖的方法。本发明还提供了金钱草总黄酮和总多糖的用途。本发明通过对提取、纯化方法的考察，成功地从同一批药材中同时提取分离得到金钱草总黄酮和总多糖，有效利用了药材资源，节省了生产成本，更适于工业化生产。同时，本发明还发现，金钱草总黄酮和总多糖具有良好的利尿、排石、利胆作用，为临床用药提供了指导。

Description

金钱草总黄酮及金钱草总黄酮和总多糖的制备方法

技术领域

本发明涉及金钱草总黄酮；还涉及金钱草总黄酮和总多糖的制备方法和用途，属于医药领域。

背景技术

金钱草来源于报春花科珍珠菜属植物过路黄lysimachia christinae Hance.全草，又名四川金钱草，为野生品种，主产于四川，江西、湖北、浙江、江苏、上海、广东等省亦有分布，其鉴别要点为：草本，叶对生，且为肾圆形，全缘，花放射状，黄色，蒴果，叶在茎顶端莲座状着生，花通常2-8对着生于茎端，叶及花瓣具黑色腺条；茎横切面轮廓圆形，根茎叶组织中有多数色素细胞，维管束成环状，无非腺毛，有小腺毛，茎皮层中有分泌道。金钱草能够治疗泌尿结石、胆结石，具有抗炎、镇痛、抑菌等作用。

研究发现，金钱草中含有黄酮、挥发油、多糖、三萜皂苷等多种化学成分。其有效部位还有待进一步研究。同时，目前对黄酮、多糖的提取、纯化工艺有报道，但多是将两种成分分开提取，不利于药材的利用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种金钱草总黄酮。本发明的另一目的在于提供同时从金钱草中分离制备总黄酮和总多糖的方法，以及金钱草总黄酮和总多糖的新用途。

本发明提供了金钱草总黄酮，所述总黄酮中，黄酮含量以芦丁计为50%～60%w/w，槲皮素和山奈素总含量为4%～5%w/w。

本发明还提供了同时制备金钱草总黄酮和总多糖的方法，它包括如下操作步骤：

（1）取金钱草，粉碎，加入70%-90%v/v乙醇提取，过滤，药渣和醇提液备用；

（2）取步骤（1）所得醇提液，浓缩后，上极性大孔吸附树脂柱，依次用0-70%v/v乙醇洗脱，收集70%v/v乙醇洗脱液，减压回收溶剂，干燥即得金钱草总黄酮；

（3）取步骤（1）所得药渣，加水提取，合并水提液，浓缩后，加入乙醇至含醇量为70-90%v/v，醇沉，取沉淀，干燥，即得金钱草总多糖。

进一步地，步骤（1）中所述乙醇浓度为80%v/v；步骤（2）中，所述极性大孔吸附树脂为NKA-9，径高比为1：（3-15），依次用水、10%v/v乙醇、70%v/v乙醇洗脱；步骤（3）中，所述含醇量为80%-90%v/v。

更进一步地，步骤（2）中，洗脱的具体操作如下：

先用水洗至不发生Molish反应，再依次用4倍柱体积的10%v/v乙醇和4倍柱体积的70v/v乙醇洗脱，收集70v/v乙醇洗脱液。

更进一步地，所述极性大孔吸附树脂柱的径高比为1：（9-15）；优选为1：（9-12）。

更进一步地，步骤（1）中，加入80%v/v乙醇提取2次，每次1.5h，每次乙醇体积用量为金钱草重量的12倍；

步骤（3）中，加水煎煮提取2次，每次2h，每次加水量为金钱草重量的10倍。

更进一步地，步骤（2）中，醇提液浓缩至浓度为0.5～0.7g原药材/ml；步骤（3）中，水提液浓缩至浓度为0.5～1g原药材/ml。

本发明还提供了上述方法制备的金钱草总黄酮或总多糖。

本发明还提供了金钱草总黄酮或总多糖在制备治疗利尿排石、利胆的药物中的用途。

进一步地，所述药物是治疗肾结石的药物。

本发明通过对提取、纯化方法的考察，成功地从同一批药材中同时提取分离得到金钱草总黄酮和总多糖，有效利用了药材资源，节省了生产成本，更适于工业化生产。同时，本发明还发现，金钱草总黄酮和总多糖具有良好的利尿、排石、利胆作用，为临床用药提供了指导。

附图说明

图1对照品溶液谱图

图2供试品溶液谱图

图3空白溶液谱图

图4大孔树脂型号考察结果

图5槲皮素、山奈素动态吸附曲线

图6总黄酮动态吸附曲线

具体实施方式

实施例1金钱草总黄酮和总多糖的制备

（1）取金钱草，粉碎，加入金钱草重量12倍体积的80%v/v乙醇回流提取2次，每次1.5h，过滤，药渣和醇提液备用；

（2）取步骤（1）所得醇提液，浓缩至0.5g原药材/ml后，上NKA-9大孔吸附树脂，依次用3-4BV水（Molish反应阴性）、4BV10%乙醇、4BV70%乙醇，洗脱，收集70%v/v乙醇洗脱液，减压回收溶剂，干燥即得金钱草总黄酮；其中，槲皮素、山奈素总含量为4.61%，黄酮含量以芦丁计为51.39%，出膏率为1.94%.

（3）取步骤（1）所得药渣，加10倍量水煎煮2次，每次2h，合并水提液，浓缩至0.5g原药材/ml，加入乙醇至含醇量为80%，室温（25℃）条件下静置12h，取沉淀，干燥，即得金钱草总多糖。多糖的纯度为50.79%，出膏率为7.09%。

实施例2总黄酮制备工艺的研究

1材料和仪器

1.1实验材料

金钱草药材（购自四川新荷花中药饮片股份有限公司，批号1204046）；芦丁对照品(批号：MUST-11040302)、槲皮素对照品（批号：MUST-12020101），均购于成都曼斯特生物科技有限公司，山奈素对照品（批号：0773-9910，购于中国药品生物制品检定所）；其它试剂均为分析纯。

其中金钱草药材按照《药典》2010年版“金钱草”项下相关规定进行全检，均符合规定；总黄酮含量测定方法自拟，暂定金钱草总黄酮含量不低于1.30%。

1.2仪器

UV-1700紫外分光光度计（购买于日本岛津公司）；BP211D型电子分析天平(购买于德国Sartorius公司)；KQ-400DB型数控超声波清洗器（购买于昆山市超声仪器有限公司）。

2指标部位和成分含量测定方法的建立

2.1金钱草总黄酮含量测定方法的建立

2.1.1测定波长的选择

分别取空白样品溶液、对照品溶液、供试品溶液进行全波长扫描，确定测定波长。

对照品溶液、供试品溶液均在500nm处有较大吸收，而空白在此位置上没有干扰，选500nm为测定波长。

2.1.2对照品溶液配制

精密称取12.770mg芦丁对照品，用乙醇定容至25ml容量瓶中，完全溶解后，取10ml加水定容至25ml容量瓶中，摇匀，即得对照品溶液（0.204mg/ml）。

2.1.3供试品溶液配制

取金钱草乙醇提取液2ml（药液浓度0.5g生药/ml），水浴挥干溶剂，加乙醇约50ml超声溶解，转移置100ml容量瓶中，用乙醇定容至刻度，摇匀，即得。

2.1.4线性关系考察

精密吸取对照品溶1ml、2mL、3mL、4mL、5mL、6ml，分别编号为1、2、3、4、5、6，分别置于25mL量瓶中，加水至6mL，加5%的亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6分钟后加10%的硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6分钟后再加入氢氧化钠试液10mL，加水至刻度，摇匀，放置30分钟后，于500nm处测定吸光度。以对照品浓度(C)为横坐标，吸收度(A)为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。

表1对照品不同浓度的吸收值

结果表明：回归方程为y=12.109x-0.0072，（r=0.9999）。结果表明，黄酮显色后在0.008～0.049mg/ml范围内，吸收值与浓度成线性相关。

2.1.5精密度考察

同一对照品溶液吸取6ml，照上述方法显色，于500nm处连续6次测定吸收值，测定RSD值，结果表明，6次测定结果的RSD为0.45%，该仪器的精密度良好。

2.1.6重复性考察

同一批供试品溶液吸取6ml，同时取样6份，照上述方法显色，分别测定吸收值，结果表明：RSD为1.24%，表明该方法重复性良好。

2.1.7稳定性考察

取供试品液6ml，照上述显色，分别于显色完成后于5、10、15、20、25、30min测定吸收值，计算RSD值，结果表明，在样品液显色后30min内基本稳定。

2.1.8加样回收考察

取已知含量的同一供试品溶液3ml（含总黄酮0.462mg），分别编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9。分别加入适量对照品溶液，加水补足6ml，照上述方法显色，测定吸光度，换算回收率，计算RSD值，结果表明，该方法回收率基本均在95%-105%之间，RSD为2.25%，采用该方法测定金钱草总黄酮的含量准确可靠。

2.2指标成分槲皮素、山奈素含量测定方法的建立

2.2.1HPLC色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse C-18(150mm×4.6mm,5μm)；柱温：30℃；检测波长：360nm；流速：1mL·min-1；流动相：甲醇-0.4%磷酸(50：50)；进样量：10μL。

2.2.2对照品溶液的配制

分别取槲皮素、山奈素对照品适量，用80%甲醇溶解，配制成槲皮素浓度为4.07μg/ml、山奈素浓度为21.96μg/ml的混合溶液，即得。

2.2.3供试品溶液的配制

取金钱草提取液适量，水浴挥干溶剂，80%甲醇溶解，转移置50ml容量瓶中，加80%甲醇至刻度，摇匀，取续滤液25ml，加盐酸5ml，90℃水浴1小时，转移至50ml容量瓶中，加80%甲醇至刻度，摇匀，即得。

以80%甲醇溶液为空白溶液。

2.2.4专属性考察

分别精密量取配制好的对照品、供试品、空白溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，按“2.2.1HPLC色谱条件”测定，记录谱图，结果见图1-3

由以上图谱可知，对照品、供试品溶液各有效成分分离度、对称性良好，空白对照溶液无干扰，表明系统专属性良好，可用于金钱草槲皮素、山奈素成分的测定。

2.2.5线性关系考察

取配制好的对照品溶液，分别精密吸取2、4、6、8、10、20μL，进样，记录色谱图。分别以槲皮素峰面积（Y1）对质量浓度（X1）、山奈素峰面积（Y2）对质量浓度（X2）进行线性回归，得回归方程：Y1=2835.8X1+0.7705，r=0.9996，表明槲皮素在0.008～0.081μg/ml范围内呈良好的线性关系。得回归方程：Y2=3730.4X2+8.3339，r=0.9996，表明山奈素在0.044～0.439μg/ml范围内呈良好的线性关系。

2.2.6方法学其他内容考察

由于该方法来源于《中国药典》2010版，比较成熟，因此未继续进行方法学其他内容的考察。

经过以上实验可知，该方法专属性、线性关系良好，较为成熟，因此可作为本实验金钱草指标成分含量测定方法。

3金钱草黄酮提取工艺考察

3.1金钱草吸醇率考察

称取金钱草100g，加适量80%乙醇浸泡至透心后，滤去乙醇溶液，药渣称重，计算吸醇率，结果见下表。

表2金钱草吸醇率测定结果

由上可知，金钱草的吸醇率为90.08%，首次提取时应加入1倍量乙醇补足吸醇率。

3.2醇提工艺考察

本实验对乙醇浓度、加醇量、提取时间及提取次数四个因素进行正交筛选。按照L9(34)正交表进行实验，设定因素水平表见表3。以金钱草的有效成分槲皮素、山奈素总和、总黄酮的转移率以及干膏的收率为评价指标，将三者权重系数分别定为0.4、0.4、0.2，综合分析，对提取工艺进行优选。

表3醇提正交试验因素水平表

称取金钱草药材100g，分别按正交试验进行提取，滤过，合并醇提液，药液备用。

3.2.1正交实验指标含量测定

按上述方法制备正交项下各供试品溶液，采用上述色谱方法测定含量：

槲皮素、山奈素转移率=槲皮素、山奈素含量/药材槲皮素、山奈素含量×100%

总黄酮转移率=总黄酮含量/药材总黄酮含量×100%

干膏收率的测定：精密量取正交试验提取液适量，置恒重蒸发皿，蒸干，105℃干燥3小时，干燥器中冷却30分钟，精密称定重量，计算干膏率。

3.2.2金钱草醇提正交实验结果

表4金钱草醇提正交实验结果

表5综合评分方差分析

由上表可知，各指标影响提取效果的因素顺序为：A>C>D>B，方差分析结果表明：金钱草的醇提工艺，以A3B3C3D2组合最佳。即加12倍量80%的乙醇，回流二次，每次1.5小时。为验证工艺稳定性，进行验证实验，结果见下表。

表6正交验证试验结果

由上表可知，该工艺稳定可行。

4金钱草黄酮部分纯化工艺考察

4.1纯化方式选择

黄酮类成分的分离纯化方法较多，有柱层析、薄层层析、溶剂萃取、高效液相色谱（HPLC）以及液滴逆流层析（DCCC）、气相层析、微乳薄层色谱等，但均存在不同程度的缺点而限制了其在工业化生产中的应用，而大孔吸附树脂是一种有机高分子聚合剂，具有物化稳定性高、吸附选择性好，不受无机物存在的影响、再生简便、解吸条件温和、使用周期长、节省费用等优点，具有推广应用的价值。

因此，本实验采用大孔树脂对金钱草黄酮提取物进行纯化，以槲皮素、山奈素及总黄酮含量为考察指标，减少干膏率，提高有效成分纯度。

4.2大孔树脂纯化金钱草总黄酮影响因素的考察

4.2.1金钱草提取液的制备

取金钱草适量，加12倍80%乙醇溶液，提取次数二次，每次1.5小时，合并醇提取液，浓缩至每2ml浓缩液相当于1g生药材，备用。测定槲皮素含量为9.88μg/ml，山奈素含量为18.05μg/ml，总黄酮质量浓度为7.45mg/ml。

4.2.2不同型号大孔树脂的筛选

以不同大孔树脂对槲皮素、山奈素及总黄酮吸附量和解吸率为指标，采用单因素考察法，对AB-8、NKA-9、D101、DHP-20不同型号的大孔树脂进行考察，优选最佳大孔树脂。

精密称取上述4种大孔树脂，每份相当于相应干树脂10g，平行3份，分别精密量取100ml金钱草提取液浸泡各型号大孔树脂12小时，时时振摇，待吸附饱和后，滤去多余药液，测定多余药液中的槲皮素、山奈素以及总黄酮含量；收集吸附饱和的大孔树脂，以70%乙醇溶液充分浸泡12小时，时时振摇，收集洗脱液，浓缩并定容至100ml容量瓶中，分别测定其中槲皮素、山奈素以及总黄酮的含量，计算吸附率和洗脱率，见图4。

由上图可知，NKA-9型大孔树脂对槲皮素、山奈素和总黄酮的吸附率和洗脱率均较高，因此选择NKA-9型大孔树脂对金钱草醇提液进行纯化。

4.2.3动态吸附曲线

取金钱草提取液200ml，通过NKA-9型大孔树脂柱（柱体积50ml），按照2BV/h速度上样，收集过柱后的液体，每15ml收集一次，分别测定过柱液中槲皮素、山奈素和总黄酮的浓度，以流出液份数为横坐标，槲皮素、山奈素含量总和以及总黄酮质量浓度为纵坐标，分别绘制动态吸附曲线，结果见图5、6。

由上图可知，槲皮素、山奈素在第7份时出现明显泄露，总黄酮在第13份时泄露明显，综合考虑，选择90ml作为最大上样量，即1.8BV，此时，槲皮素、山奈素以及总黄酮保留完全。

4.2.4药液浓度的选择

为考察药液浓度对纯化效率的影响，本实验设置不同药液浓度进行考察，取药液110ml，分别调节药液浓度为0.3、0.5、0.7g生药/ml，按2BV/h速度上样，收集各洗脱液，定容至110ml，测定其中有效成分及总黄酮含量，计算各浓度下有效成分或部位的吸附率，结果见下表。

表7药液浓度考察结果

由上表可知，药液浓度对树脂纯化效率影响显著，浓度过小过大均会导致吸附率降低，因此，本实验选择0.5g生药/ml为上样药液浓度。

4.2.5上样速度考察

为考察上样速度对纯化效率的影响，本实验设置不同上样速度进行考察，取药液一定量，按实验确定的最大上样量，分别以1、2、3BV/h的速度流经树脂柱上样，收集各流出液，定容至与最大上样量同样体积，测定其中有效成分及总黄酮的含量，结果见表下表。

表8上样速度考察结果

由上表可知，上样速度对树脂纯化效率影响程度有限，速度过慢上样完全但较为耗时，不利于工业大生产，综合考虑，因此2BV/h为较理想的上样速度。

4.2.6树脂柱径高比筛选

为考察径高比对纯化效率的影响，本实验设置径高比分别为1:3、1:6、1:9、1:12、1:15进行考察，取药液一定量，按实验确定的最大上样量，按2BV/h速度上样，收集各洗脱液，定容至与最大上样量同样体积，测定其中有效成分及总黄酮含量，计算各浓度下有效成分或部位的吸附率，结果见下表。

表9径高比考察结果

由上表可知，树脂柱的径高比对纯化效率影响较大，树脂柱在1:9～1:15时，金钱草有效成分及总黄酮吸附率均较高，考虑到工业生产的可行性，径高比设定为1:9～1:12较为妥当。

4.2.7洗脱溶媒浓度的选择

取金钱草提取液一定量，按最大上样量以2BV/h速度上样于预处理的树脂柱（柱体积50ml），适量水洗，Molish反应阴性后，以5倍柱体积的10%、30%、50%、70%、90%乙醇分别洗脱树脂柱，收集各洗脱液，定容至250ml，分别测定其中有效成分及总黄酮的含量，计算洗脱率，结果见表下表。

表10洗脱溶媒考察结果

由上表可知，10%乙醇虽然洗脱总黄酮的能力较差，但可除去大部分水溶性杂质，5倍量70%的乙醇可以洗脱82.20%的有效成分及87.7%的总黄酮，因此确定采用10%乙醇溶液除杂，70%乙醇洗脱，收集70%乙醇部分，为金钱草醇提有效部位。

4.2.8洗脱剂量的选择

按实验确定的最大上样量，取金钱草提取液适量过经过预处理的树脂柱（柱体积72ml），适量水洗，直至Molish反应阴性，用4BV10%乙醇溶液除杂，然后以5倍柱体积的70%乙醇洗脱树脂柱，洗脱流速为2BV/h，收集洗脱液，每45ml收集一份，共收集8份，分别测定各洗脱液中有效成分及总黄酮的含量，结果及洗脱曲线见下表。

表11洗脱剂量考察结果

由上表可知，当洗脱至第6份溶液，即4倍柱体积时，可洗脱94.11%的有效成分及92.20%的总黄酮，继续增加洗脱剂量，洗脱率变化不大，从工业生产节约成本考虑，故选择洗脱剂量为4倍柱体积。

根据以上实验确定大孔树脂纯化法：取大孔树脂，湿法装柱，调节径高比为1:10，将0.5g生药/ml浓度的金钱草提取液以2BV/h的上样速度上柱吸附，最大上样量为1.8BV，水洗至Molish反应阴性（约3-4BV），用4BV10%乙醇溶液除杂后，加4BV70%乙醇溶液洗脱树脂柱，收集洗脱液，备用。

4.2.9验证实验

取金钱草药材2000g，按所筛选工艺提取，合并提取液，浓缩至浓度为0.5g生药/ml药液，取适量药液，对以上纯化工艺进行验证试验，测定有效成分及总黄酮转移率，同时测定干膏率，实验平行进行3次，结果见下表。

表12验证试验结果

以上结果表明实验所选大孔树脂纯化工艺稳定可行。

5浓缩工艺考察

工业上醇溶液一般采用减压浓缩方式回收乙醇，本实验采用温度60℃、真空度-0.08～-0.1Mpa回收乙醇，浓缩至相对密度为1.05～1.10（60℃）的清膏，备用。考查浓缩前后槲皮素、山奈素及总黄酮等的保有率，结果见下表：

表13醇洗脱液液回收乙醇并减压浓缩后含量变化

由上表可知，在实验筛选的浓缩条件下，各有效成分保有率较高。

6药理用样品的制备

为方便药理实验，将大孔树脂纯化后的金钱草醇提浓缩液于60℃干燥，测定固形物中槲皮素、山奈素及总黄酮的含量，结果如下：

表14干燥考察结果

由上表可知，供药理实验用总黄酮有效部位的槲皮素、山奈素含量为4.61%，总黄酮含量为51.39%。

实施例3总多糖制备工艺的研究

1材料和仪器

1.1实验材料

金钱草药材（购自四川新荷花中药饮片股份有限公司，批号1204046）、葡萄糖对照品（MUST-11020603，购于成都曼斯特生物科技有限公司）、其余试剂为分析纯。

其中金钱草药材按照《药典》2010年版“金钱草”项下相关规定进行全检，均符合规定；多糖含量进行自检，初步规定金钱草多糖含量不低于6.26%。

1.2实验仪器

紫外分光光度计；超声波处理器（220V，50Hz）；赛多利斯电子分析天平（精度为十万分之一）

2实验内容和方法

2.1金钱草多糖含量测定方法建立

2.1.1测定波长的选择

分别取空白样品溶液、对照品溶液、供试品溶液进行全波长扫描，确定测定波长。

对照品溶液、供试品溶液均在490nm处有较大吸收，而空白在此位置上没有干扰，结合《药典》多糖的测定波长，选490nm为测定波长。

2.1.2对照品溶液配制

精密称取葡萄糖标准品适量，加水配制成浓度为0.138mg/ml溶液，即得。

2.1.3供试品溶液配制

称取33.010mg金钱草粗多糖加水超声使其溶解，并定容到100ml量瓶中，过滤取续滤液，取10ml续滤液，加水定容到25ml量瓶中，摇匀，即得。

2.1.4线性关系考察

精密量取对照品溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，1.2ml分别置具塞试管中，各加水补至2.0ml，再分别加5%苯酚溶液1.0ml，混匀，迅速加入5.0ml浓硫酸，混匀，室温放置10分钟，置40℃水水浴中保温15分钟，取出，冰浴5min，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光法，在490nm的波长处测定吸光度。以吸光度(A)为纵坐标，葡萄糖浓度C为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。直线回归方程为：y=49.26x-0.0171（r=0.9976），表明葡萄糖在0.003～0.021mg/ml内样品量与吸光度线性良好。

2.1.5精密度考察

精密量取对照品溶液0.6ml置具塞试管中，按照上述显色方法显色，在490nm的波长处连续6次测定吸光度，计算RSD，结果表明，6次测定结果的RSD为0.59%，该仪器的精密度良好。

2.1.6重复性考察

同一批供试品溶液吸取2ml，同时取样6份，照上述方法显色，分别测定吸收值，计算RSD，结果表明：重复性试验RSD值为2.66%，说明重复性良好，将吸光度带入标准曲线，计算多糖含量，可知供试品溶液中多糖平均含量为0.174mg/ml。

2.1.7稳定性考察

取供试品液2ml，照上述显色，分别于显色完成后于15、30、45、60、75、90min测定吸收值，计算RSD，结果表明，在样品液显色后90min内基本稳定。

2.1.8加样回收考察

取同一供试品溶液5ml续滤液（平行做取9份），分别编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9。分别加入适量对照品溶液，加水定容至25ml量瓶中，分别取2ml测定吸光度，计算回收率，结果表明，该方法回收率基本均在95%～105%之间，RSD值为3.05%，采用该方法测定金钱草中多糖的含量准确可靠。

2.2金钱草多糖的提取药材准备

取适量金钱草药材，加入12倍量80%乙醇回流提取2次，每次1.5h，取出滤渣，挥干乙醇，药渣晾干，供水提取备用。

2.3金钱草多糖水提工艺筛选

2.3.1正交设计优化金钱草多糖水提工艺

综合文献和前期实验，影响提取工艺的因素主要有溶媒用量、提取次数、提取时间。因此，以这三个因素为主要影响因素，以多糖转移率Y1、干膏率Y2为评价指标,根据实际情况并参照常用方法将二者权重系数分别定为0.8、0.2，进行试验设计，因素水平见表15。

多糖转移率=水提液中多糖含量/金钱草药材多糖含量×100%

表15因素及水平表

2.3.2实验结果

按上述正交设计因素水平表进行实验，实验结果见下表：

表16正交设计安排及结果

注:Y=Y1/Ymax×80+Y2/Ymax×20

方差分析结果见下表

表17方差分析表结果表

从上表可知，影响提取效果最主要的因素是提取时间，其次是提取次数和溶剂用量；综合直观分析和方差分析与结合实际，确定水提取工艺为：A3B3C2，即溶剂用量10倍量，提取次数2次，提取时间2h。

2.3.3验证实验

取同一批药材，通过进一步试验对最优工艺进行验证，实验重复3次，结果见下表：

表18验证试验结果

由表可知，验证结果与正交试验结果相接近，表明水提工艺基本稳定。

3金钱草多糖醇沉工艺考察

3.1醇沉静置温度的考察

取金钱草水提药液适量，减压浓缩至0.5g生药/ml的药液，即为供试品溶液。

取2份上述供试品溶液，使含醇量为80%，分别于室温条件下（25℃左右）和冰箱中（4℃），放置12h，抽滤得醇沉物，醇沉物50℃真空干燥，分别得多糖粗品，并称取其质量，计算多糖出膏率。再分别精密称取多糖粗品30mg，加水溶解，置于100ml容量瓶中，摇匀定容，精密移取10ml转移至25ml容量瓶，加水至刻度，摇匀，即得供试品溶液。取供试品溶液，参照2.1.4中多糖含量测定方法测定最终醇沉物的多糖纯度与多糖出膏率，从而筛选出最佳静置温度。

表19静置温度考察

结果表明：常温和低温保存效果没较大差异，故采用常温静置沉淀即可。

3.2醇沉时间的考察

取4份药液，各50ml，加入乙醇，使含醇量为80%，室温下放置6、12、24、48h，抽滤得醇沉物，醇沉物50℃真空干燥，分别得多糖粗品，并称取其质量，计算多糖出膏率。再分别精密称取多糖粗品30mg，加水溶解，置于100ml容量瓶中，摇匀定容，精密移取10ml转移至25ml容量瓶，加水至刻度，摇匀，即得供试品溶液。取供试品溶液，参照2.1.4中多糖含量测定方法测定最终醇沉物的多糖纯度与多糖出膏率，从而筛选出最佳醇沉时间。

表20醇沉时间的考察

以上结果表明：随着醇沉时间的增加，多糖纯度和多糖出膏率逐渐增加，醇沉12h时即可达到较理想水平，从工业大生产角度考虑，选择醇沉时间为12h最优。

3.3药液浓度考察

取4份药液，分别浓缩或稀释至药液浓度为0.1、0.25、0.5、1g生药/ml，加入乙醇，分别使含醇量为80%，室温静置12h，抽滤得醇沉物，50℃真空干燥，分别得多糖粗品，并称取其质量，计算多糖出膏率。再分别精密称取多糖粗品30mg，加水溶解，置于100ml容量瓶中，摇匀定容，精密移取10ml转移至25ml容量瓶，加水至刻度，摇匀，即得供试品溶液。取供试品溶液，参照2.1.4中多糖含量测定方法测定最终醇沉物的多糖纯度与多糖出膏率，从而筛选出最佳药液浓度。

表21药液浓度考察

以上结果表明：当浓度为0.5g生药/ml时，醇沉所得多糖纯度和得率较优，则药液浓度为0.5g生药/ml时较理想。

3.4醇浓度的考察

取4份药液，各50ml，加入乙醇，分别使含醇量为50%、60%、70%、80%，室温静置12h，抽滤得醇沉物，醇沉物50℃真空干燥，分别得多糖粗品，并称取其质量，计算多糖出膏率。再分别精密称取多糖粗品30mg，加水溶解，置于100ml容量瓶中，摇匀定容，精密移取10ml转移至25ml容量瓶，加水至刻度，摇匀，即得供试品溶液。取供试品溶液，参照2.1.4中多糖含量测定方法测定最终醇沉物的多糖纯度与多糖出膏率，从而筛选出最佳醇沉浓度。

表22醇浓度的考察

以上结果表明：当醇浓度为80%时，多糖纯度和得率都较为理想，因此，制备金钱草粗多糖时，选择醇浓度80%较优。

3.5醇沉次数的考察

取3份药液，各50ml，加入乙醇，使含醇量为80%，分别醇沉次数1、2、3次，室温静置12h，抽滤得醇沉物，醇沉物50℃真空干燥，分别得多糖粗品，并称取其质量，计算多糖出膏率。再分别精密称取多糖粗品30mg，加水溶解，置于100ml容量瓶中，摇匀定容，精密移取10ml转移至25ml容量瓶，加水至刻度，摇匀，即得供试品溶液。取供试品溶液，参照2.1.4中多糖含量测定方法测定最终醇沉物的多糖纯度与多糖出膏率，从而筛选出最佳醇沉次数。

表23醇沉次数的考察

以上结果表明：随着醇沉次数的增加，多糖纯度增加明显，但粗多糖出膏率呈下降趋势，综合多糖纯度和得率因素考虑，选择最佳醇沉次数为1次。

综上所述，最佳醇沉工艺条件为：制备0.5g生药/ml金钱草药液，往药液中加入乙醇，调节醇浓度为80%，室温（25℃）条件下静置12h，过滤，收集沉淀，干燥，即得。

3.6验证试验

取3份供试品溶液，在最优醇沉工艺条件下醇沉，结果如下表：

表24验证试验结果

由上表可知：验证试验表明醇沉工艺中，多糖平均得率可达7.09%，醇沉后平均纯度可达51.37%，结果比较稳定，说明醇沉优化工艺稳定可行。

4药理用样品的制备

为方便药理实验，需要对金钱草多糖醇沉物进行干燥，取同一批醇沉物，50℃干燥至干，测定干燥物中金钱草多糖含量，结果如下表：

表25不同干燥方式考察结果

结果表明：50℃干燥条件下得到棕色固形物，其中多糖含量为50.79%。

以下通过试验例具体说明本发明的有益效果。

试验例1金钱草有效部位利尿作用研究

1.1材料

1.1.1受试药物

金钱草多糖（实施例1）；

(2)金钱草总黄酮（实施例1）；

(3)阳性药：氢氯噻嗪(HYDROCHLOROTHIAZIDE)功能主治：水肿性疾病：排泄体内过多的钠和水，减少细胞外液容量，消除水肿。症见充血性心力衰竭、肝硬化腹水、肾病综合症、急慢性肾炎水肿、慢性肾功能衰竭早期、肾上腺皮质激素和雌激素治疗所致的钠、水潴留等。规格：25mg×100片。用法用量：口服，成人用量，治疗水肿性疾病，每次25～50mg(每次1～2片)。生产厂家：山西云鹏制药有限公司生产。批准文号：国药准字H14020796；生产批号：A120201。生产日期：20120221；有效期至：20150220。各实验组药物的配制见表26。

表26药物配制方法

1.1.2实验动物

SD大鼠，SPF级，

各半，体重180～220g，由成都达硕生物科技有限公司提供，实验动物质量合格证号：scxk(111)2008-24。

1.1.5统计方法

用SPSS17.0软件进行统计分析。数据以均数±标准差

表示，组间采用单因素方差分析，方差齐者组间进行LSD检验，方差不齐者进行Tamhane’sT2检验。

1.2实验内容与方法

1.2.1动物筛选

取健康SD大鼠，预先置于代谢笼中1～2日适应环境，以25ml/kg剂量灌胃纯净水，观察自由饮水条件尿量是否稳定。收集2h内尿量，凡尿量达到所灌入量的40%以上的动物可用于利尿实验。将筛选出的大鼠随机分为4组，每组8只，分别作为：空白对照组、阳性组、金钱草黄酮组、多糖组。

1.2.2实验步骤

各实验组大鼠禁食不禁水15小时后，给予水负荷生理盐水30ml/kg，30分钟后，各实验组按组别、剂量灌胃给药，①空白对照组：等体积纯净水；②阳性对照组(氢氯噻嗪组)：11.6mg·kg-1；③多糖组：2132mg·kg-1；④黄酮组：240mg·kg-1。给药后压迫大鼠下腹，使膀胱中余尿排尽，然后置代谢笼中收集6小时尿液。

1.2.3检测指标

①分别于给药后1h、2h、4h、6h时间点采集各组大鼠尿液，以各组大鼠尿重量为量化指标。

1.3实验结果

1.3.1各实验组大鼠不同时间点尿量比较结果见表43～46。

表27各实验组大鼠1h时间点尿量比较

由表27可知，与空白组比较，给药后1小时，阳性组大鼠尿液量显著增加(P<0.05)，黄酮组、多糖+黄酮组大鼠尿液量有增加趋势。

表28各实验组大鼠2h时间点尿量比较

由表28可知，与空白组比较，金钱草黄酮组和阳性组大鼠在给药2小时尿量均有显著增大(P<0.05)，金钱草多糖组和多糖+黄酮组大鼠在给药2小时尿量有增大趋势。

表29各实验组大鼠4h时间点尿量比较

由表29可知，与空白组比较，金钱草黄酮组和阳性组大鼠在给药4小时尿量均有显著增大(P<0.05)，金钱草多糖组和多糖+黄酮组大鼠在给药4小时尿量有增大趋势。

表30各实验组大鼠6h时间点尿量比较

由表30可知，与空白组比较，金钱草黄酮组和阳性组大鼠在给药6小时尿量均有显著增大(P<0.05)，金钱草多糖组大鼠在给药6小时尿量依然有增大趋势。

1.4实验小结

以上研究结果表明，金钱草黄酮和多糖对实验性大鼠均有利尿作用，主要体现在金钱草多糖和黄酮均可增加大鼠尿量。虽然二者均具有利尿效果，但二者利尿作用强度和发挥利尿作用时间存在差异，金钱草黄酮在2、4、6小时三个时间点均可显著增加大鼠尿量，金钱草多糖在这三个时间点上只体现出利尿趋势，表明金钱草黄酮发挥利尿作用快速强烈，多糖发挥利尿作用相对缓慢。

试验例2金钱草有效部位对大鼠肾结石影响实验研究

1实验材料、仪器

1.1受试药物

金钱草多糖（实施例1）；

金钱草总黄酮（实施例1）；

阳性药：排石颗粒。功能主治：利水，通淋，排石，解毒。用于石淋及排除泌尿结石。生产厂家：南京同仁堂药业有限责任公司。生产批号：20120613。

1.2化学试剂

(1)乙二醇：成都市科龙化工试剂公司，生产批号：20120605。

(2)氯化铵：成都市科龙化工试剂公司公司，生产批号：20090816。

实验动物

SD大鼠，SPF级，各半，体重180～220g，由成都达硕生物科技有限公司提供，实验动物质量合格证号：scxkc(111)2008-24。

1.4实验仪器

(1)BSA224S电子天平：规格：220g/0.1mg，赛多利斯科学仪器有限公司。

(2)紫外分光光度计：SHIMADZU，UV1700，上海锐翔仪器公司。

(3)Thermo全功能酶标仪，BIS-2113，美国Thermo Fisher Scientific仪器有限公司生产。

(4)恒温摇床：QYC-200型，上海福玛仪器有限公司。

(5)匀浆机：DY89-I型，宁波新芝生物科技股份有限公司。

(6)离心机：TG2-16C型，上海安亭科学仪器厂。

(7)电热恒温水浴锅：型号SK12-6，浙江宁波医疗器械厂。

2统计方法

用SPSS17.0软件进行统计分析。数据以均数±标准差

表示，组间采用单因素方差分析，方差齐者组间进行LSD检验，方差不齐者进行Tamhane’s T2检验。

3实验内容与方法

3.1大鼠肾结石模型复制方法

实验第1d除空白组灌胃给予等体积纯净水外，其余各组按大鼠灌胃5%乙二醇和4％氯化铵2ml，连续14d（每天上午灌胃给药造模）。

3.2实验分组及给药

SD大鼠按体重随机分为5组，每组8只，分别作为：①模型对照组：等体积纯净水；②阳性对照组(排石颗粒组)：1500mg·kg-1；③多糖组：2132mg·kg-1；④黄酮组：240mg·kg-1。另按体重随机称取8只正常大鼠作为正常对照组⑥：等体积纯净水。造模当天下午各组大鼠按剂量灌胃给药(以后每次给药时间均在造模当天下午)，每天1次，连续14天。

3.3检测指标

①肾脏重量系数：剖取大鼠左右肾脏，称重，计算肾脏重量系数：

肾脏重量系数(g/g)=(左肾重量+右肾重量)/体重

②观察肾组织病理改变及大鼠肾结石情况：采用肾组织常规石蜡包埋，组织切片，HE染色，偏光显微镜观察肾组织形态、草酸钙结晶分布、肾脏病理组织及大鼠肾结石情况。

4实验结果

4.1药物对大鼠肾脏重量系数的影响结果见表31。

表31各实验组大鼠肾脏重量系数

由表31可知，与模型组比较，各实验组大鼠肾脏重量均有降低趋势。

4.4各实验组大鼠肾脏结石病理形态比较

正常组：大鼠肾皮质，髓质无结晶形成，细胞排列整齐规则，结构清晰，肾小管腔内无沉积物，上皮细胞无肿胀充血肾乳头肾盂肾盏清晰，无结石。

模型组：大鼠肾皮质明显充血，近曲小管水肿，髓质充血，间质水肿，远曲小管可见较多的沉积物。大量炎性细胞浸润，乳头管也可见结石，肾盏内见脱落细胞。

阳性组：皮质充血，近曲小管水肿，髓质充血，间质水肿，远曲小管可见少量的结石。炎性细胞浸润减少，乳头管也可见结石，肾盏内有脱落细胞。

金钱草多糖组：大鼠肾皮质充血明显减轻，近曲小管水肿，髓质充血，间质水肿，近远曲小管可见沉积物。炎性细胞浸润多见，乳头管也可见沉积物，肾盏内见脱落细胞。

金钱草黄酮组：大鼠肾皮质充血明显减轻，近曲小管水肿，髓质充血，间质水肿，近远曲小管结石减少。少量炎性细胞浸润，乳头管也可见结石，肾盏内见脱落细胞。

5实验结论

金钱草多糖和黄酮均具有治疗大鼠肾结石的药理活性。

试验例3金钱草有效部位利胆作用的实验研究

1实验材料

1.1受试药物

(1)金钱草多糖（实施例1）：

(2)金钱草总黄酮（实施例1）：

(3)阳性药：消炎利胆片，功能主治：清热，祛湿，利胆。用于肝胆湿热引起的口苦，胁痛和急性胆囊炎，胆管炎。生产厂家：广东罗浮山国药股份有限公司。生产批号：Z44021422。

1.2实验动物

SD大鼠，SPF级，各半，体重180～220g，由成都达硕生物科技有限公司提供，实验动物合格证号：scxk(111)2008-24。

1.3实验耗材、仪器、设备

▲电子天平  ▲胆囊引流管  ▲胆红素(TB)试剂盒  ▲胆固醇(TC)试剂盒▲总胆汁酸(TBA)试剂盒  ▲低速离心机

2统计方法

用SPSS17.0软件进行统计分析。数据以均数±标准差

表示，组间采用单因素方差分析，方差齐者组间进行LSD检验，方差不齐者进行Tamhane’s T2检验。

3实验内容与方法

3.1实验分组

选择体质合格的SD大鼠，按体重随机分为4组，每组8只，雌雄各半，分别作为：①正常对照组：等体积生理盐水；②阳性对照组(消炎利胆片)：7200mg/kg；③金钱草多糖组：2132mg/kg；④金钱草黄酮组：240mg/kg。各组大鼠按体重、剂量由十二指肠给相应药物和纯净水。

3.2给药方法及测定

①实验前12小时禁食不禁水。

②12小时后，各组大鼠以3%戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉，仰位固定，沿腹正中线切开约2cm，打开腹腔，找到幽门部，翻转十二指肠，在十二指肠降部肠系膜中找到胆管，在其下穿二根丝线，结扎乳头部，向肝脏方向作V型切口，插入引流管。

③待稳定20分钟后，收集胆汁30分钟，然后各组大鼠由十二指肠按组分别给予纯净水、消炎利胆片药液、金钱草多糖药液、金钱草黄酮药液、金钱草多糖+黄酮药液。

给药后每30分钟收集胆汁一次，共4次，记录并收集胆汁流量。

3.3检测指标及方法

(1)测定各组大鼠给药120min后的胆汁量，每30min收集一次。

(2)测定各组大鼠胆汁中胆红素(TB)、胆固醇(TC)、总胆汁酸(TBA)的含量。

4实验结果

4.1各实验组胆汁流量比较

4.1.1各实验组大鼠不同时间点胆汁流量比较结果见表32～35。

表32各实验组大鼠30min时间点胆汁流量比较

由表32可知，与空白组比较，给药后30min，除多糖组外，其余各组大鼠胆汁流量均有增加趋势。

表33各实验组大鼠60min时间点胆汁流量比较

由表33可知，与空白组比较，金钱草黄酮组大鼠在给药60min后胆汁流量有增大趋势。

表34各实验组大鼠90min时间点胆汁流量比较

由表34可知，与空白组比较，金钱草黄酮组和阳性组大鼠在给药90min胆汁流量均有显著增大(P<0.05)。

表35各实验组大鼠120min时间点胆汁流量比较

由表35可知，与空白组比较，金钱草黄酮组和阳性组大鼠在给药120min胆汁流量均有显著增大(P<0.05)。

4.2药物对大鼠血液中胆红素(TB)、胆固醇(TC)、总胆汁酸(TBA)浓度的影响

由于实验过程中胆汁收集量较少，难以达到检测操作的需要量，结合相关文献，本实验对血液中胆红素(TB)、胆固醇(TC)、总胆汁酸(TBA)浓度进行测定，具体如下：

4.2.1药物对大鼠血液中TB浓度的影响结果见表36。

表36各实验组大鼠血液中TB浓度

由表36可知，与空白组比较，金钱草黄酮组大鼠血液中TB浓度显著增大(P<0.05)。

4.2.2药物对大鼠血液TC浓度的影响结果见表37。

表37各实验组大鼠血液TC浓度

由表37可知，与空白组比较，金钱草黄酮组大鼠血液TC浓度均有显著降低(P<0.05)。

4.2.3药物对大鼠血液TBA浓度的影响结果见表38。

表38各实验组大鼠血液TBA浓度

由表38可知，与空白组比较，金钱草黄酮组大鼠血液TBA浓度显著增大(P<0.05)。

5实验结论

以上实验表明，金钱草黄酮具有明显促排大鼠胆汁的作用，主要体现在金钱草黄酮可显著增加大鼠胆汁流量、增大血液胆红素、总胆汁酸浓度，降低胆固醇浓度。

Claims (9)

1.金钱草总黄酮，其特征在于：所述总黄酮中，黄酮含量以芦丁计为50%～60%w/w，槲皮素和山奈素总含量为4%～5%w/w。

2.同时制备金钱草总黄酮和总多糖的方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：

（1）取金钱草，粉碎，加入70%-90%v/v乙醇提取，过滤，药渣和醇提液备用；

（2）取步骤（1）所得醇提液，浓缩后，上极性大孔吸附树脂柱，依次用0-70%v/v乙醇洗脱，收集70%v/v乙醇洗脱液，减压回收溶剂，干燥即得金钱草总黄酮；

（3）取步骤（1）所得药渣，加水提取，合并水提液，浓缩后，加入乙醇至含醇量为70-90%v/v，醇沉，取沉淀，干燥，即得金钱草总多糖。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中所述乙醇浓度为80%v/v；步骤（2）中，所述极性大孔吸附树脂为NKA-9，径高比为1：（3-15），依次用水、10%v/v乙醇、70%v/v乙醇洗脱；步骤（3）中，所述含醇量为80%-90%v/v。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，洗脱的具体操作如下：

先用水洗至不发生Molish反应，再依次用4倍柱体积的10%v/v乙醇和4倍柱体积的70v/v乙醇洗脱，收集70v/v乙醇洗脱液。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述极性大孔吸附树脂柱的径高比为1：（9-15）；优选为1：（9-12）。

6.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，加入80%v/v乙醇提取2次，每次1.5h，每次乙醇体积用量为金钱草重量的12倍；

步骤（3）中，加水煎煮提取2次，每次2h，每次加水量为金钱草重量的10倍。

7.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，醇提液浓缩至浓度为0.5～0.7g原药材/ml；步骤（3）中，水提液浓缩至浓度为0.5～1g原药材/ml。

8.权利要求2～7任意一项所述方法制备的金钱草总黄酮或总多糖。

9.权利要求8所述金钱草总黄酮或总多糖在制备治疗利尿排石、利胆、治疗肾结石的药物中的用途。

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